Summary
Se describe un nuevo método quirúrgico para la cateterización "asas intestinales" en el íleon de los ovinos. Una vez que los animales se han recuperado de la cirugía y han limpiado los antibióticos y analgésicos, múltiples tratamientos pueden ser depositados directamente en los bucles a través de los catéteres.
Abstract
El intestino es una estructura compleja que está involucrado no sólo en la absorción de nutrientes, sino que también actúa como una barrera entre el individuo y el mundo exterior. Como tal, el intestino desempeña un papel fundamental en inmunovigilancia y la protección de los agentes patógenos entéricos. La investigación de la fisiología y la inmunología intestinal habitualmente emplea 'asas intestinales "como modelo experimental. La mayoría de estos modelos de ciclo no son la recuperación de los procedimientos quirúrgicos que estudio a corto plazo (<24 h) cambios en el intestino (1-3). Anteriormente hemos creado un modelo de recuperación de asa intestinal para medir específicamente a largo plazo (<6 meses) los cambios inmunológicos en el intestino de oveja siguiente exposición a las vacunas, adyuvantes y virus (4). Este procedimiento tratamientos localizados a un determinado 'loop', lo que nos permite probar esta zona del intestino. Una desventaja importante de este método es la única ventana de oportunidad para administrar los tratamientos (es decir, en el momento de la cirugía). Además, las muestras tanto de la mucosa intestinal y el contenido luminal sólo pueden ser tomadas a la terminación del proyecto. Otras limitaciones más destacados del modelo anterior es que la manipulación quirúrgica y post-operatorio requerido medidas (por ejemplo, administración de antibióticos y analgésicos) puede afectar directamente el propio tratamiento y / o alterar la función inmune, por lo tanto los resultados de confusión. Por lo tanto, hemos modificado nuestro modelo de asa intestinal mediante la inserción de catéteres a largo plazo en los lazos. Las ovejas se recuperan totalmente del procedimiento, y se ven afectados por los catéteres exteriorizados. En particular, el establecimiento de los catéteres en los bucles nos permite introducir múltiples tratamientos en un intervalo prolongado, después de la recuperación de la cirugía y la eliminación de los fármacos administrados durante la cirugía y el período post-operatorio.
Protocol
Procedimiento experimental:
- Todos los instrumentos se esterilizan en autoclave, no autoclaveable materiales son esterilizados en una solución de esterilización en frío Germex por un mínimo de 10 min.
- Las ovejas son premedicados con acepromacina (0,05 mg / kg), glicopirrolato (0.005 mg / kg), y el tartrato de butorfanol (0,2 mg / kg) de mensajería instantánea, y se fue a 15-20 minutos.
- El cuello se afeita y se ha borrado de la piel quirúrgicamente. Una vez que la vena yugular se visualiza, 0,1 ml de lidocaína se inyecta SC sobre la vena, se introduce el catéter en la vena y se fija a la piel mediante la identificación del ganado etiqueta de cemento y 2 ", cinta de hospital. Durante la cirugía, los animales se les da 10 ml / kg / h de Plasmalyte 148 (por gravedad).
- Diazepam (0,2 mg / kg) se administra IV, y la anestesia se indujo con tiopental sódico (10 mg / kg). Aerosol de lidocaína endotraqueal se aplica a las cuerdas vocales, la oveja está intubado, y se mantiene en el isoflurano (1.5-2.5% en O 100 2% a una tasa de 4 L / min) por la duración de la cirugía.
- El animal se coloca en decúbito dorsal sobre una alfombra con calefacción para ayudar a mantener la temperatura corporal durante la cirugía. Un tubo gástrico se inserta en el rumen para prevenir timpanismo excesivo.
- La parte ventral del abdomen se rasura y la piel se prepara para la cirugía con tres lavados quirúrgicos Prepodyne. El abdomen es entonces cubierto, asegurando que la exposición adecuada de la herida quirúrgica (ombligo en el abdomen caudal) se mantiene.
- Una incisión de línea media 15-20 cm se realiza mediante un electroscapel, caudalmente desde el ombligo, y el pliegue ileocecal se encuentra en el cuadrante inferior derecho del abdomen. El caudal del íleon y el ciego luego se exterioriza. A lo largo del procedimiento, la manipulación del intestino se reduce al mínimo y se tiene cuidado para asegurar el intestino exteriorizado se mantiene húmeda con agua tibia (37-39 ° C) estéril tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2).
- Un segmento de 85 cm del íleon (es decir, el "segmento intestinal") se mide y se sujeta con pinzas Doyen (abrazaderas intestinal) y las grandes pinzas de Kelly en cada extremo del segmento. Dentro del segmento intestinal, 'loops' y 'espacios intermedios "entre los bucles se establecerá. Pinzas Doyen se colocan en el lado del íleon a unir (anastomosis), y las pinzas de Kelly se colocan en el lado del segmento intestinal del íleon.
- El íleon se corta entre cada Doyen y pinza Kelly y el segmento intestinal designado para los bucles es ligeramente enrojecida dos veces con 60 ml de PBS caliente para eliminar la ingesta.
- Un cóctel de antibióticos de amplio espectro (200 mg de enrofloxacino y 250 mg de metronidazol en PBS caliente, 60 ml de volumen total) se distribuye en todo el segmento intestinal y se dejó durante 30 min.
- Los extremos del corte proximal y distal del íleon (excluyendo el segmento intestinal) se unen para formar un tracto intestinal continua y funcional. En primer lugar, el íleon es alineado por dos suturas, colocados en los bordes mesentérico y antimesentérico del intestino, respectivamente. Entonces, un patrón simple sutura continua (2-0 Vicryl) se completa en ambos lados del intestino para unirse al intestino.
- PBS caliente (3-5 ml) se inyecta en el lugar de anastomosis para comprobar si hay fugas y la falta de sutura. Entonces, la punta de la pinza de Kelly se presiona contra la superficie serosa del intestino, cerca del sitio de la anastomosis, y hacia adentro avanzadas en el sitio de anastomosis para garantizar el lumen intestinal es grande y patente.
- El cóctel de antibióticos se elimina el segmento intestinal. Cada extremo del segmento se cerró con un patrón de sutura continua simple (reabsorbibles; Vicryl 2-0), seguido de un patrón de sutura Vicryl 2-0 con inversión.
- Los 85 cm de longitud del segmento intestinal se divide en tres "bucles" de 15 cm, dos de 15 cm de largo "espacios intermedios" entre los bucles, y dos de 5 cm de longitud de extremo romo compartimentos en los extremos del segmento intestinal (Figura 1) . Los lazos se crean mediante la colocación de una ligadura de todo el intestino con seda 2-0. Es de destacar que los principales vasos mesentéricos no se ligan durante este procedimiento, ya que estas son necesarias para suministrar el intestino con la sangre, mantener la viabilidad intestinal. Además, las ligaduras se quedan mucho tiempo, ya que se utiliza para fijar el catéter.
- Catéteres (tubos de silastic es decir) estar individualmente identificados con un marcador permanente. Una bola de silicio (5 mm de diámetro) que rodea el catéter, se coloca 4-5 cm del extremo del catéter para evitar que el catéter se salga del intestino (Figura 1). Después de la esterilización en autoclave, un ungüento antibiótico no (Orbeseal) es aséptica inserta en el extremo del catéter (3-5 mm), lo que asegura que el catéter queda patente (es decir, no se tapan por la mucosa desprendidas dentro del bucle).
- Una pequeña incisión se coloca en la parte craneal de cada uno de los tres bucles. Cada agujero se agranda con un introductor de catéter ("dilatador de vasos", es decir), y un segmento de 6-8 cm de catéter se inserta caudalmente enel lazo, hasta que el balón silcone pasa en el lumen (Figura 1).
- La pared intestinal, alrededor de la sonda con una sutura bolsa (2-0 Vicryl). El catéter está asegurada en el intestino mediante la vinculación de la sonda con la seda de ligadura que delineó el extremo craneal del bucle.
- Ampicilina (5 ml, 100 mg / ml en PBS caliente) se inyecta en cada ciclo y espacio intermedio, y el intestino se vuelve a colocar en la cavidad abdominal. Cefazolina (8 ml, 100 mg / ml en PBS caliente) se inyecta en la cavidad peritoneal a través de la incisión abdominal.
- Se hace una incisión única puñalada pequeña se hace a través de la pared abdominal adyacente a la incisión de la línea media, y los catéteres se exteriorizan a través de este sitio.
- La posición y la tensión de los catéteres se ajusta dentro de la cavidad peritoneal. Los músculos abdominales se cierran con un patrón de sutura simple interrumpida (sutura absorbible; catgut n º 3), y la piel se cierra con un patrón de interrupción colchón horizontal (sutura no absorbible; Supramid # 1).
- Una curva del tubo hueco de acero inoxidable (7 mm de diámetro, 10 mm de diámetro exterior y 65 cm de longitud) se inserta bajo la piel cerca de la incisión abdominal, debajo de la piel de un sitio de salida solo caudal en el cuello y entre los hombros. Los catéteres se introducen en el tubo y la empujó hacia adelante por lo menos el 50% de la longitud del tubo. El tubo con los catéteres se tira de la piel en el sitio de salida, la exposición de los catéteres.
- La tensión de los catéteres se ajusta en el sitio de incisión, y la piel se cierra con Supramid # 1.
- Catéteres individuales son identificados y colocados dentro de un vendaje "bolsa", que se sutura a la piel con Supramid # 1. La bolsa protege a los catéteres de daños posteriores.
- Después de la operación, las ovejas son inyectados IM con flunixina (sid), con una dosis inicial de 2,2 mg / kg, seguida de una dosis de mantenimiento de 1,1 mg / kg una vez por 3 días. Las ovejas también se inyecta IM con Hemostam (3 ml) y enrofloxacina (2,5 mg / kg) sid de 3 y 5 días, respectivamente. Los animales se mantienen en 148 Plasmalyte intravenosa con una solución de dextrosa al 5%, administrada de forma continua con una bomba peristáltica para asegurar que el flujo (145 ml / hr) se desarrolla independientemente de la posición del cuerpo. Se les permite beber ad libitum, sino que se alimentan es restringida hasta que el rumen normal y las funciones intestinales se recuperan. La ingesta de alimentos, el consumo de agua, la temperatura corporal, el paso de las heces y la orina, los ruidos intestinales, dolor abdominal, el comportamiento y las concentraciones de glucosa en sangre son seguidos de cerca (la oferta); cuando sea necesario, las concentraciones de glucosa en los fluidos por vía intravenosa se ajustan para mantener las concentraciones de glucosa en sangre dentro del rango normal. Química sanguínea y hematología (es decir, la albúmina, fosfatasa alcalina, alanina aminotransferasa, amilasa, calcio, colesterol, creatinina, glucosa, fosfato inorgánico, bilirrubina total, proteínas totales, urea, la globulina, sodio, potasio, cloruro, presión parcial de oxígeno, pH, parcial de dióxido de carbono de presión, el bicarbonato y dióxido de carbono total, conteo de glóbulos rojos y glóbulos blancos, hematocrito, hemoglobina, el diferencial de leucocitos en sangre y plaquetas) son controlados antes y después de la cirugía de inmediato, y, posteriormente, cada dos días. Una vez que comienza la función normal del intestino, la terapia de fluidos por vía intravenosa se termina y los animales son trasladados a corrales (es decir, 5-7 días después de la cirugía). Los animales son mantenidos en corrales individuales (a la vista de otros animales), lo que reduce el estrés y el riesgo de sufrir daños a sus bolsas de catéter (por ejemplo, masticar un PenMate).
- Para inyectar los tratamientos en los bucles individuales, 5 ml del tratamiento se inyecta en el catéter usando una jeringa estéril equipado con un calibre 18, con extremos romos aguja. Para garantizar el depósito de todo el tratamiento en el circuito, el catéter se inyecta con 3 ml de PBS.
Puntos críticos:
Procedimientos de importancia crucial para el éxito de este procedimiento quirúrgico incluyen: (1) verificar que el intestino no se tuerce sobre sí mismo antes de establecer la anastomosis, (2) asegurar la integridad y la permeabilidad de la anastomosis, (3) proteger adecuadamente el catéter para la pared del lazo con la ligadura delinear el extremo craneal del bucle, pero asegurándose de que la unión no afecta a la permeabilidad del catéter; (4) reducción de la manipulación intestinal y la garantía de que el intestino exteriorizado se mantiene húmedo; (5) asegurar el catéter adecuado tensión, (6) garantizando la integridad de la sonda no se ve afectada durante la sutura del músculo y la piel; (7) la prevención de hartarse de las ovejas después de la cirugía (es decir, durante el período de íleo postoperatorio) que puede causar retención ruminal y el deterioro de la función del rumen, y (8) asegurar que los animales reciban tratamiento suficiente líquido por vía intravenosa durante los primeros 3-5 días después de la cirugía, que las concentraciones de glucosa en sangre se controlan cuidadosamente, y las concentraciones de glucosa en los fluidos por vía intravenosa son ResulTed, si es necesario para prevenir la hipoglucemia. 
Figura 1. Representación esquemática de sondaje asas de íleon. Tenga en cuenta los tres de 15 cm de largo por sondaje "loops", los dos de 15 cm de largo no sondaje "espacios intermedios" establecido entre los lazos, y los dos 5 cm de largo segmentos terminales, todos los establecidos en un 85 cm de largo 'del segmento intestinal "de un íleo ovejas.
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Discussion
En este procedimiento, hemos sido capaces de establecer con éxito los catéteres en las asas intestinales establecido en el íleon de los ovinos. Al adherirse a estrictos cuidados post-operatorios, los animales se recuperaron rápidamente del procedimiento, se reanuda la actividad normal de 5-7 días después de la cirugía. Se determinó que el establecimiento de los catéteres dentro de los ciclos no afecta la función inmune o la mucosa intestinal (datos no mostrados) y los animales pueden vivir por lo menos 8 semanas después de la cirugía. Este procedimiento nos permite introducir múltiples tratamientos en distintos compartimentos inmunológica en un intervalo prolongado, una vez que los animales se han recuperado de la cirugía, y para medir empíricamente los efectos fisiológicos e inmunológicos de estos tratamientos.
Una consideración importante para futuros experimentos es la localización del segmento intestinal en el intestino delgado. En este procedimiento se crea quirúrgicamente el segmento intestinal dentro de la 'íleon inmunológicamente funcional "con la frecuencia definida por ileal (continua), las placas de Peyer (5,6). Esta zona puede extenderse cranealmente hasta 2 m más allá del pliegue ileocecal. Aunque esta región es considerada anatómicamente como el yeyuno, en el contexto de la función inmunológica, es el íleon, destacando la importancia de considerar la función de la hora de describir las regiones intestinal.
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Disclosures
Todos los procedimientos en animales experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales Institucional (Protocolo de la utilización de animales # 0609) y siguió las directrices establecidas por el Consejo Canadiense de Protección de los Animales.
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación no podría haberse completado sin la dedicación y el esfuerzo de muchas personas en la Agriculture and Agri-Food Canada Research Centre, Lethbridge, Alberta, Canadá. En ese sentido, agradecemos a: Tara Shelton para pre-y post-operatorio de atención de los animales, la preparación quirúrgica, y anestesiología, el análisis de las muestras, y ayuda con imágenes de vídeo; Randy Wilde y Costa Estela de la atención pre-y post-operatorio; Jenny Gusse para el análisis de la muestra, Byron Lee para la imagen de trocar, y Brian Egland de cría de ovejas. También agradecemos a Brent Selinger (Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Lethbridge) para el suministro de equipo de vídeo y asesoramiento, así como otro tipo de ayuda (es decir, producción ejecutiva), y el Plan de Estudios Re-Centro de Desarrollo de la Universidad de Lethbridge de experiencia videografía. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones de los Alimentos y la Red Avanzada de Materiales (GDI), el Canadá-Alberta Industria de Carne Fondo para el Desarrollo (GDI), y de Agricultura y Agroalimentación de Canadá (GDI y JPK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103091 | |
| Surgical mask | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MAX53013 | |
| Surgical gown | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 3365 | |
| OB Apron | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900062 | |
| Surgical cap | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903271 | |
| EZ Scrub brush | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC377479 | |
| Anesthetic machine | Boyle | - | |
| Sodasorb | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108638 | |
| Laryngoscope | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Laryngoscope blade (Miller blade #4) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 902667 | |
| Endotracheal tube (7.0 - 8.5 mm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Lidocaine endotracheal spray | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103364 | |
| Acepromazine | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AUS01020 | |
| Glycopyrrolate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | SAB2880 | |
| Butorphanol tartrate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AYE304541 | |
| Diazepam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sab790 | |
| Thiopental sodium | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103508 | |
| Epinephrine hydrochloride | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103856 | |
| Doxapram | Strathcona Pharmacy | - | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 100339 | |
| Hemostam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103857 | |
| Flunixin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sch140100 | |
| Enrofloxacin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | hll0049 | |
| Metronidazole | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101653 | |
| Ampicillin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | NOV67185-6 | |
| Cefazolin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | nov69397 | |
| Electroscapel | Macan | MV8 | |
| Heating mat | Kane | PHMD-48 | |
| Stomach tube (Nalgene tubing 5/16" ID) | Fisher Scientific | - | |
| Needle driver | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108338 | |
| Addison brown forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 911075 | |
| Rat tooth forcep | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 5275 | |
| Kelly forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901133 | |
| Mosquito hemostat | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108471 | |
| Carmalt forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901225 | |
| Scalpel handle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900285 | |
| Scalpel blade #22 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900511 | |
| Metzenbaum scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901166 | |
| Sharp-sharp scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108264 | |
| Towel clamp | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901213 | |
| Allis tissue forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901201 | |
| Doyen’s forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 904226 | |
| Stainless steel bowl | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903601 | |
| Stainless steel trocar (curved) | Local Supplier | - | |
| Catheter introducer | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 11440 | |
| Surgical towel | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 7972 | |
| Disposable drape | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900035 | |
| Steri drape | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2323 | |
| Drape (40 x 40 cm) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 8358 | |
| Surgical drape (7" x 11 ¼" opening) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2694 | |
| Vicryl (2-0) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | JJMJ333H | |
| Silk 2-0 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105248 | |
| Catgut #3 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-2070 | |
| Supramid #1 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-3040 | |
| Needles (cutting and non-cutting) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Silastic tubing (0.040" ID, 0.085" OD) | Fisher Scientific | 11-189-15D | |
| Orbeseal ointment | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 106344 | |
| Clear silicone (732 multi-purpose sealant) | Local Supplier | - | |
| Blunt end needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 905035 | |
| Marker (permanent industrial) | Local Supplier | - | |
| Catheter pouch (constructed of Elastoplast 7.5 cm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Hospital tape (2") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103842 | |
| Hospital tape (1") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | VLMRENF20 | |
| Gauze sponge 4x4 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107551 | |
| Gauze cling | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107633 | |
| Elastoplast 7.5cm | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Elastoplast rippable bandage | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104093 | |
| Syringe (60 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104004 | |
| Syringe (10 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc301604 | |
| 25G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305122 | |
| 20G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305175 | |
| 18G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903353 | |
| Intracath IV catheter (16G 8") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc3831621 | |
| IV administration set (10 drop) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101797 | |
| 0.9% NaCl solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB1322P | |
| Plasmalyte 148 solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB2534 | |
| Dextrose | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MCT60190 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 7524-10 | |
| Livestock identification tag cement | Local Supplier | - | |
| Germex solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | mtc60270 | |
| Isopropyl alcohol | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104590 | |
| Stanhexidine cleanser | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 109248 | |
| Prepodyne solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105710 | |
| Prepodyne scrub | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105711 |
References
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- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
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