Summary
Descriviamo un nuovo metodo chirurgico per catheterizing 'anse intestinali' all'interno del ileo di pecore. Una volta che gli animali hanno recuperato da un intervento chirurgico e hanno eliminato gli antibiotici e analgesici, terapie multiple possono essere depositati direttamente in loop tramite i cateteri.
Abstract
L'intestino è una struttura complessa che è coinvolto non solo l'assorbimento delle sostanze nutritive, ma anche agisce come una barriera tra l'individuo e il mondo esterno. Come tale, l'intestino ha un ruolo fondamentale nella immunosorveglianza e protezione da patogeni enterici. Indagare intestinale fisiologia e immunologia impiega comunemente 'anse intestinali' come modello sperimentale. La maggior parte di questi modelli loop sono procedure chirurgiche mancato recupero che lo studio a breve termine (<24 ore), i cambiamenti a livello intestinale (1-3). Abbiamo già creato un modello di ciclo intestinale di recupero per misurare specificamente a lungo termine (<6 mesi), alterazioni immunologiche nell'intestino di esposizione pecore seguito ai vaccini, i coadiuvanti, e virus (4). Questa procedura trattamenti localizzati ad uno specifico 'loop', che ci permette di assaggiare questa zona dell'intestino. Un svantaggio di questo metodo è la singola finestra di opportunità di somministrare trattamenti (cioè al momento della chirurgia). Inoltre, campioni sia della mucosa intestinale e il contenuto del lume può essere presa solo al termine del progetto. Altre limitazioni salienti del modello di cui sopra sono che la manipolazione chirurgica e necessaria post-operatoria (somministrazione ad esempio antibiotici e analgesici) possono direttamente influenzare il trattamento stesso e / o alterare la funzione immunitaria, quindi i risultati confondenti. Pertanto, abbiamo modificato il nostro modello intestinale ciclo con l'inserimento di cateteri a lungo termine in loop. Pecore recuperare pienamente dalla procedura, e non sono influenzate dalla cateteri esteriorizzato. In particolare, la creazione di cateteri in loop ci permette di introdurre trattamenti multipli in un intervallo esteso, a seguito di recupero da un intervento chirurgico e la clearance dei farmaci somministrati durante l'intervento chirurgico e il periodo post-operatorio.
Protocol
Procedura sperimentale:
- Tutti gli strumenti vengono sterilizzati in autoclave, non autoclavabili materiali sono sterilizzati in soluzione Germex sterilizzazione a freddo per un minimo di 10 min.
- Le pecore sono pre-medicati con acepromazina (0,05 mg / kg), glicopirrolato (0,005 mg / kg) e butorfanolo tartrato (0,2 mg / kg) IM, e lasciato per 15-20 minuti.
- Il collo è rasata e la pelle chirurgicamente rimosso. Una volta che la vena giugulare viene visualizzato, 0,1 ml di lidocaina viene iniettata SC sopra la vena, il catetere viene introdotto nella vena e fissato alla cute utilizzando cemento di identificazione del bestiame tag e 2 "nastro ospedale. Durante l'intervento, gli animali sono dati da 10 ml / kg / ora di Plasmalyte 148 (dal flusso di gravità).
- Diazepam (0,2 mg / kg) viene somministrato IV, e l'anestesia viene indotta con tiopentale sodico (10 mg / kg). Spruzzo lidocaina endotracheale viene applicata per le corde vocali, la pecora è intubato e mantenuto in isoflurano (1.5-2.5% in% O 100 2 ad un tasso del 4 L / min) per tutta la durata dell'intervento.
- L'animale viene posto in decubito dorsale su un tappetino riscaldato per aiutare a mantenere la temperatura corporea durante l'intervento. Un tubo nello stomaco viene inserito nel rumine per evitare timpanismo eccessivo.
- L'addome ventrale è rasata e la pelle viene preparata per l'intervento chirurgico con tre scrub Prepodyne chirurgico. L'addome è poi drappeggiate, assicurando che l'esposizione appropriata del sito chirurgico (ombelico di addome caudale) è mantenuto.
- Un 15-20 incisione mediana cm è fatta utilizzando un electroscapel, caudalmente da l'ombelico, e la piega ileocecale si trova nel quadrante inferiore destro dell'addome. La caudale ileo e cieco sono poi esteriorizzato. Nel corso della procedura, la gestione dell 'intestino è ridotto al minimo e si ha cura di garantire l'intestino esteriorizzato è tenuto umido con caldi (37-39 ° C) fosfato sterile tamponata (PBS, pH 7,2).
- Un segmento di 85 cm di ileo (cioè il 'segmento intestinale') è misurata e poi bloccato con una pinza Doyen (morsetti intestinale) e grandi pinze Kelly ad ogni estremità del segmento. All'interno del segmento intestinale, 'loop' e 'interspazi' tra i passanti sarà stabilito. Pinze decano sono posizionati sul lato dell'ileo da unire (anastomosi), e la pinza di Kelly sono posti sul lato segmento intestinale dell'ileo.
- L'ileo è tagliato tra ogni Doyen e Kelly pinza e il segmento intestinale designato per cicli è delicatamente lavata due volte con 60 ml di caldo PBS per rimuovere ingerito.
- Un cocktail di antibiotici ad ampio spettro (200 mg enrofloxacina e 250 mg di metronidazolo in caldo PBS, 60 ml di volume totale) è distribuito in tutto il segmento intestinale e lasciato per 30 minuti.
- Le estremità taglio prossimale e distale dell'ileo (escluso il segmento intestinale) sono uniti a formare un tratto continuo e funzionale intestinale. In primo luogo, l'ileo è allineato da due punti di sutura soggiorno, posto al confine mesenterici e antimesenterico dell'intestino, rispettivamente. Poi, un modello semplice sutura continua (2-0 Vicryl) si completa su entrambi i lati l'intestino ad unirsi insieme l'intestino.
- Caldo PBS (3-5 ml) viene iniettato nel sito anastomosi di controllo delle perdite e guasti sutura. Poi, la punta della pinza di Kelly è premuta contro la superficie sierosa dell'intestino, nei pressi del sito del sito di anastomosi, e verso l'interno avanzato presso il sito anastomosi per garantire il lume intestinale è grande e brevetti.
- Il cocktail antibiotico viene rimosso dal segmento intestinale. Ogni estremità del segmento è chiuso con un modello semplice sutura continua (sutura assorbibile; Vicryl 2-0) seguito da un modello di sutura invertendo con Vicryl 2-0.
- Il 85 centimetri di lunghezza del segmento intestinale è suddivisa in tre 15 centimetri 'loop', due 15 cm lungo 'interspazi' tra i passanti, e due 5 cm di lunghezza smussato-end scomparti al capolinea del segmento intestinale (Figura 1) . I loop vengono creati inserendo una legatura intorno l'intestino utilizzando 2-0 seta. È interessante notare che grandi vasi mesenterici non sono legatura durante questa procedura, in quanto questi sono necessari per fornire l'intestino con il sangue, mantenendo la vitalità intestinale. Inoltre, le legature vengono lasciati lungo, in quanto saranno utilizzati per fissare i cateteri.
- Cateteri (tubi silastic cioè) sono identificati individualmente con un pennarello indelebile. Una palla al silicio (5 mm di diametro) che circondano il catetere, si trova 4-5 cm dalla fine catetere per aiutare a prevenire il catetere di scivolare fuori dell'intestino (Figura 1). Dopo la sterilizzazione in autoclave, un non-antibiotico unguento (Orbeseal) è asetticamente inserito alla fine del catetere (3-5 mm), questo assicura che il catetere rimane brevetto (cioè non si riempiono di mucosa sloughed all'interno del ciclo).
- Una piccola incisione viene posto al aspetto cranica di ognuno dei tre anelli. Ogni buca è ampliata con un introduttore catetere ('vaso dilatatore', cioè), e un segmento di 6-8 cm di catetere viene inserito in caudalmenteil ciclo, fino a quando la palla passa silcone nel lume (Figura 1).
- La parete intestinale è assicurata in tutto il catetere con una sutura stringa borsa (2-0 Vicryl). Il catetere è ulteriormente assicurata per l'intestino legando il catetere con la seta legatura che delinea la fine del cranio del ciclo.
- Ampicillina (5 ml, 100 mg / ml in PBS calda) viene iniettato in ogni ciclo e intercapedine, e l'intestino è reinserito nella cavità addominale. Cefazolina (8 ml, 100 mg / ml in PBS calda) viene iniettato nella cavità peritoneale attraverso l'incisione addominale.
- Una sola coltellata piccola incisione viene fatta attraverso la parete addominale adiacente alla incisione linea mediana, ed i cateteri sono esteriorizzato attraverso questo sito.
- La posizione e la tensione dei cateteri viene regolata all'interno della cavità peritoneale. Muscoli addominali sono chiusi con un modello semplice sutura interrotta (sutura assorbibile; Catgut # 3), e la pelle è chiuso con un modello orizzontale interrotto materasso (non assorbibile sutura; Supramid # 1).
- Una curva tubo cavo in acciaio inox (7 mm ID, 10 mm di diametro, 65 cm di lunghezza) è inserito sotto la pelle vicino l'incisione addominale, tunnel sotto la pelle di un sito uscire appena caudalmente al collo e tra le spalle. I cateteri vengono inseriti nel tubo e spinto in avanti per almeno il 50% della lunghezza del tubo. Il tubo con il catetere viene poi estratta dalla pelle al sito di uscita, esponendo i cateteri.
- La tensione dei cateteri è regolata nel sito incisione, e la pelle è chiuso con Supramid # 1.
- Cateteri individuali sono identificati e collocati all'interno di una benda "pouch", che è suturato alla pelle con Supramid # 1. La custodia protegge i cateteri da danni successivi.
- Post-operatoria, le pecore vengono iniettati IM con flunixin (sid) a una dose iniziale di 2,2 mg / kg, seguita da una dose di mantenimento di 1,1 mg / kg sid per 3 giorni. Anche le pecore vengono iniettati IM con Hemostam (3 ml) e enrofloxacina (2,5 mg / kg) sid per 3 e 5 giorni, rispettivamente. Gli animali siano mantenuti in Plasmalyte endovenosa 148 con soluzione glucosata al 5%, somministrato continuamente con una pompa peristaltica per garantire che il flusso (145 ml / h) continua indipendentemente dalla posizione del corpo. Essi sono autorizzati a bere ad libitum, ma di alimentazione è limitata fino rumine normali funzioni intestinali e sono stati ripristinati. L'assunzione di cibo, il consumo di acqua, temperatura corporea, il passaggio di feci e urine, rumori intestinali, disturbi addominali, comportamento, e le concentrazioni di glucosio nel sangue sono strettamente monitorate (bid), quando necessario, le concentrazioni di glucosio nei fluidi per via endovenosa sono adeguati per mantenere le concentrazioni di glucosio nel sangue entro il normale range. Sangue chimica ed ematologia (cioè albumina, fosfatasi alcalina, alanina aminotransferasi, amilasi, calcio, colesterolo, creatinina, glucosio, fosfato inorganico, bilirubina totale, proteine totali, urea, globulina, sodio, potassio, cloruro, pressione parziale di ossigeno, pH, parziale anidride carbonica pressione, bicarbonato e anidride carbonica totale, rossi e globuli bianchi, ematocrito, emoglobina, differenziale numero di globuli bianchi e piastrine) sono monitorati prima e immediatamente dopo la chirurgia, e ogni due giorni dopo. Una volta che la funzione intestinale normale inizio, terapia fluida endovenosa è terminato e gli animali vengono trasferiti al paddock (cioè 5-7 giorni post-chirurgico). Gli animali siano mantenuti in recinti individuali (in vista di altri animali), riducendo così lo stress e la possibilità di subire danni alla loro tasche catetere (ad esempio, masticare da un penmate).
- Per iniettare trattamenti in cicli individuali, 5 ml del trattamento è iniettato nel catetere con una siringa sterile dotata di un indicatore 18, blunt-ended ago. Per garantire la deposizione di tutti i trattamenti nel circuito, il catetere viene iniettato con 3 ml di PBS.
Punti critici:
Procedure di importanza cruciale per il successo di questa procedura chirurgica sono: (1) verificare che l'intestino non è attorcigliato su se stesso prima di stabilire l'anastomosi, (2) assicurare l'integrità e la pervietà delle anastomosi, (3) in modo adeguato fissaggio del catetere per il muro ciclo con la legatura delineare la fine del cranio del ciclo, ma garantendo che l'allegato non influisce la pervietà del catetere; (4) minimizzando la movimentazione intestinale e assicurare che esteriorizzato dell'intestino è tenuto umido, (5) garantire il catetere appropriato tensione; (6) garantendo il mantenimento dell'integrità del catetere non è influenzato durante la sutura dei muscoli e della pelle, (7) impedendo rimpinzarsi da pecore post-intervento chirurgico (cioè durante il periodo di post-operatoria ileo) che può causare occlusione ruminale e svalutazioni funzione del rumine, e (8) assicurare che gli animali ricevano sufficiente la terapia endovenosa di liquidi per i primi 3-5 giorni post-intervento chirurgico, che le concentrazioni di glucosio nel sangue sono attentamente monitorati, e le concentrazioni di glucosio nei fluidi per via endovenosa sono adjusTed, se necessario, per prevenire l'ipoglicemia. 
Figura 1. Una rappresentazione schematica del cateterizzati loop ileale. Notare le tre 15 centimetri di lunghezza cateterizzati 'loop', i due 15 centimetri di lunghezza non cateterizzati 'intercapedini' stabilito tra i passanti, e le due 5 centimetri di lunghezza segmenti terminali, tutti istituiti all'interno di una cm-lungo '85 segmento intestinale 'di un ileo pecore.
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Discussion
In questa procedura, siamo stati in grado di stabilire con successo cateteri nelle anse intestinali stabilito nella ileo di pecore. Aderendo a rigorosi assistenza post-operatoria, gli animali rapidamente recuperato dalla procedura e ripreso la normale attività 5-7 giorni dopo l'intervento chirurgico. Abbiamo determinato che la creazione di cateteri all'interno di cicli non influenza la funzione della mucosa intestinale o immunitaria (dati non riportati) e gli animali possono vivere per almeno 8 settimane dopo l'intervento chirurgico. Questa procedura ci permette di introdurre trattamenti multipli in diversi comparti immunologici su un intervallo esteso, una volta che gli animali hanno recuperato da un intervento chirurgico, e per misurare empiricamente gli effetti fisiologici e immunologici di questi trattamenti.
Una considerazione importante per gli esperimenti futuri è la posizione del segmento intestinale all'interno del piccolo intestino. In questa procedura abbiamo creato chirurgicamente il segmento intestinale all'interno della 'ileo immunologicamente funzionale' spesso definiti dalla ileale (continua) le placche di Peyer (5,6). Questa zona può estendersi cranialmente fino a 2 m oltre piega ileocecale. Anche se questa regione è considerata anatomicamente come il digiuno, nel contesto della funzione immunologica, è ileo, evidenziando l'importanza di considerare la funzione quando descrive le regioni intestinale.
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Disclosures
Tutte le procedure sperimentali su animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale di prodotti per animali (utilizzo di un protocollo Animal # 0609) e seguito le linee guida stabilite dal Consiglio canadese dei prodotti per animali.
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca non avrebbe potuto essere completato senza la dedizione e gli sforzi di molte persone alla Agricoltura e Agri-Food Canada Research Centre, Lethbridge, Alberta, Canada. A tale proposito, ringraziamo: Tara Shelton per il pre-e post-operatoria la cura degli animali, la preparazione chirurgica ed anestesiologia, analisi di campioni, e l'assistenza con video immagini; Randy Wilde e Estela Costa per le cure pre e post-operatoria; Jenny Gusse per l'analisi del campione; Byron Lee per l'immagine trequarti, e Brian Egland per le pecore allevamento. Ringraziamo anche Brent Selinger (Dipartimento di Scienze Biologiche, Università di Lethbridge) per la fornitura di apparecchiature video e consigli, così come altre forme di assistenza (ad esempio produzione esecutiva) e la Re-Curriculum Development Centre, Università di Lethbridge per competenza videografia. Questo studio è stato sostenuto in parte da finanziamenti della Foods avanzata e di rete Materiali (GDI), il Canada-Alberta settore dei fondi per lo sviluppo di manzo (GDI), e l'agricoltura e Agri-Food Canada (GDI e JPK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103091 | |
| Surgical mask | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MAX53013 | |
| Surgical gown | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 3365 | |
| OB Apron | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900062 | |
| Surgical cap | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903271 | |
| EZ Scrub brush | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC377479 | |
| Anesthetic machine | Boyle | - | |
| Sodasorb | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108638 | |
| Laryngoscope | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Laryngoscope blade (Miller blade #4) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 902667 | |
| Endotracheal tube (7.0 - 8.5 mm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Lidocaine endotracheal spray | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103364 | |
| Acepromazine | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AUS01020 | |
| Glycopyrrolate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | SAB2880 | |
| Butorphanol tartrate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AYE304541 | |
| Diazepam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sab790 | |
| Thiopental sodium | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103508 | |
| Epinephrine hydrochloride | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103856 | |
| Doxapram | Strathcona Pharmacy | - | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 100339 | |
| Hemostam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103857 | |
| Flunixin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sch140100 | |
| Enrofloxacin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | hll0049 | |
| Metronidazole | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101653 | |
| Ampicillin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | NOV67185-6 | |
| Cefazolin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | nov69397 | |
| Electroscapel | Macan | MV8 | |
| Heating mat | Kane | PHMD-48 | |
| Stomach tube (Nalgene tubing 5/16" ID) | Fisher Scientific | - | |
| Needle driver | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108338 | |
| Addison brown forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 911075 | |
| Rat tooth forcep | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 5275 | |
| Kelly forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901133 | |
| Mosquito hemostat | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108471 | |
| Carmalt forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901225 | |
| Scalpel handle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900285 | |
| Scalpel blade #22 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900511 | |
| Metzenbaum scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901166 | |
| Sharp-sharp scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108264 | |
| Towel clamp | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901213 | |
| Allis tissue forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901201 | |
| Doyen’s forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 904226 | |
| Stainless steel bowl | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903601 | |
| Stainless steel trocar (curved) | Local Supplier | - | |
| Catheter introducer | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 11440 | |
| Surgical towel | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 7972 | |
| Disposable drape | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900035 | |
| Steri drape | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2323 | |
| Drape (40 x 40 cm) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 8358 | |
| Surgical drape (7" x 11 ¼" opening) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2694 | |
| Vicryl (2-0) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | JJMJ333H | |
| Silk 2-0 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105248 | |
| Catgut #3 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-2070 | |
| Supramid #1 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-3040 | |
| Needles (cutting and non-cutting) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Silastic tubing (0.040" ID, 0.085" OD) | Fisher Scientific | 11-189-15D | |
| Orbeseal ointment | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 106344 | |
| Clear silicone (732 multi-purpose sealant) | Local Supplier | - | |
| Blunt end needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 905035 | |
| Marker (permanent industrial) | Local Supplier | - | |
| Catheter pouch (constructed of Elastoplast 7.5 cm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Hospital tape (2") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103842 | |
| Hospital tape (1") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | VLMRENF20 | |
| Gauze sponge 4x4 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107551 | |
| Gauze cling | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107633 | |
| Elastoplast 7.5cm | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Elastoplast rippable bandage | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104093 | |
| Syringe (60 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104004 | |
| Syringe (10 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc301604 | |
| 25G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305122 | |
| 20G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305175 | |
| 18G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903353 | |
| Intracath IV catheter (16G 8") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc3831621 | |
| IV administration set (10 drop) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101797 | |
| 0.9% NaCl solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB1322P | |
| Plasmalyte 148 solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB2534 | |
| Dextrose | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MCT60190 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 7524-10 | |
| Livestock identification tag cement | Local Supplier | - | |
| Germex solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | mtc60270 | |
| Isopropyl alcohol | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104590 | |
| Stanhexidine cleanser | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 109248 | |
| Prepodyne solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105710 | |
| Prepodyne scrub | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105711 |
References
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- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
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- Motyka, G., Greibel, P. J., Reynolds, J. D. Agents that activate protein kinase C resue sheep ileal Peyer's patch B cells from apoptosis. Eur. J. Immunol. 23, 1314-1321 (1993).
