Summary
Descrevemos um novo método cirúrgico para cateterizar "alças intestinais" dentro do íleo de ovelhas. Uma vez que os animais têm recuperado de uma cirurgia e que tenha limpado antibióticos e analgésicos, múltiplos tratamentos podem ser depositados diretamente em loops através dos cateteres.
Abstract
O intestino é uma estrutura complexa que está envolvido não somente na absorção de nutrientes, mas também atua como uma barreira entre o indivíduo eo mundo exterior. Como tal, o intestino tem um papel fundamental na vigilância imunológica e proteção contra patógenos entéricos. Investigação da fisiologia intestinal e imunologia comumente emprega "alças intestinais" como um modelo experimental. A maioria destes modelos de alça são não-recuperação de procedimentos cirúrgicos que estudo de curta duração (<24 h) alterações no intestino (1-3). Nós anteriormente criou um modelo de recuperação alça intestinal especificamente para medida de longo prazo (<6 meses) alterações imunológicas no intestino de ovelha exposição segue para vacinas, adjuvantes, e vírus (4). Este procedimento tratamentos localizados a um 'loop' específicas, permitindo-nos a amostra esta área do intestino. Uma desvantagem significativa deste método é a única janela de oportunidade para administrar tratamentos (ou seja, no momento da cirurgia). Além disso, amostras de ambos os mucosa intestinal e conteúdo luminal só pode ser tomada ao término do projeto. Outras limitações importantes do modelo acima são de que a manipulação cirúrgica e pós-operatórios necessários medidas (por exemplo, administração de antibióticos e analgésicos) pode afetar diretamente o tratamento em si e / ou alterar a função imunológica, assim, resultados de confusão. Portanto, nós modificamos o nosso modelo de alça intestinal através da inserção de cateteres de longo prazo para a loops. Ovelhas recuperar totalmente do procedimento, e não são afetados pela cateteres exteriorizados. Nomeadamente, o estabelecimento de cateteres em loops nos permite introduzir múltiplos tratamentos durante um intervalo prolongado, após a recuperação da cirurgia e depuração de fármacos administrados durante a cirurgia e no período pós-operatório.
Protocol
Procedimento experimental:
- Todos os instrumentos são autoclavados; não autoclaváveis materiais são esterilizados em solução Germex esterilização a frio para um mínimo de 10 min.
- Ovelhas são pré-medicados com acepromazina (0,05 mg / kg), glicopirrolato (0,005 mg / kg) e tartarato de butorfanol (0,2 mg / kg) IM, e partiu para 15-20 min.
- O pescoço é raspado ea pele cirurgicamente limpo. Uma vez que a veia jugular é visualizada, 0,1 ml de lidocaína é injetado SC sobre a veia, o cateter é introduzido na veia e garantiu à pele com gado de cimento tag de identificação e 2 tape hospital ". Durante a cirurgia, os animais são dadas 10 ml / kg / h de Plasmalyte 148 (por fluxo de gravidade).
- Diazepam (0,2 mg / kg) é administrado IV, ea anestesia é induzida com tiopental sódico (10 mg / kg). Spray de lidocaína endotraqueal é aplicado para as pregas vocais, a ovelha é intubado e mantido em isoflurano (1,5-2,5% em 100% O 2 a uma taxa de 4 L / min) para a duração da cirurgia.
- O animal é colocado em decúbito dorsal sobre uma esteira aquecida para ajudar a manter a temperatura do corpo durante a cirurgia. Um tubo é inserido no estômago no rúmen para evitar timpanismo excessiva.
- O abdômen ventral é raspado ea pele está preparada para a cirurgia com três Prepodyne esfrega cirúrgico. O abdômen é então coberto, assegurando que a exposição adequada do sítio cirúrgico (umbigo para abdômen caudal) é mantida.
- A incisão mediana 15-20 cm é feita usando uma electroscapel, caudalmente a partir do umbigo, e as vezes ileocecal está localizado no quadrante inferior direito do abdômen. O íleo e ceco caudal são, então, exteriorizado. Durante todo o processo, a manipulação do intestino é minimizado e cuidado é tomado para garantir o intestino exteriorizado é mantido úmido com água morna (37-39 ° C) fosfato estéril salina tamponada (PBS, pH 7,2).
- Um segmento de 85 cm do íleo (ou seja, o "segmento intestinal ') é medido e, em seguida, preso com uma pinça Doyen (grampos intestinal) e pinças grandes Kelly em cada extremidade do segmento. Dentro do segmento intestinal, 'loops' e 'vãos' entre os loops serão estabelecidos. Doyen pinça são colocados do lado do íleo a serem unidas (anastomose), e as pinças Kelly são colocados do lado do segmento intestinal do íleo.
- O íleo é cortado entre cada Doyen e pinça Kelly eo segmento intestinal designado para loops é gentilmente lavada duas vezes com 60 ml de PBS morna para remover ingesta.
- Um coquetel de antibióticos de largo espectro (enrofloxacina 200 mg e 250 mg de metronidazol em PBS morna, 60 ml de volume total) é distribuída em todo o segmento intestinal e para a esquerda por 30 min.
- As extremidades cortadas proximal e distal do íleo (excluindo o segmento intestinal) são unidos para formar uma área contínua e funcional intestinal. Primeiro, o íleo está alinhado por duas suturas estadia, colocados nas fronteiras mesentérica e antimesentérica do intestino, respectivamente. Então, um padrão de sutura simples contínua (2-0 Vicryl) é preenchido em ambos os lados do intestino para se juntar ao intestino juntos.
- PBS quente (3-5 ml) é injetado no local da anastomose para verificar se há vazamentos e falhas de sutura. Então, a ponta da pinça Kelly é pressionado contra a superfície serosa do intestino, perto do local do local da anastomose, e para dentro avançados no local da anastomose para garantir o lúmen intestinal é grande e patentes.
- O coquetel de antibióticos é removido do segmento intestinal. Cada extremidade do segmento é fechada com um padrão de sutura contínua simples (fio absorvível; 2-0 Vicryl), seguido por um padrão de sutura Vicryl 2-0 invertendo usando.
- O segmento de 85 cm de comprimento intestinal é dividido em três 15 cm 'loops', dois de 15 cm de comprimento "vãos" entre os loops, e dois de 5 cm de comprimento blunt-end compartimentos no términos do segmento intestinal (Figura 1) . Os laços são criados, colocando uma ligadura ao redor do intestino utilizando 2-0 seda. Vale ressaltar que grandes vasos mesentéricos não são ligados durante este procedimento, uma vez que estes são necessários para suprir o intestino com sangue, mantendo a viabilidade intestinal. Além disso, as ligaduras são deixados muito tempo, como eles serão utilizados para garantir a cateteres.
- Cateteres (ou seja, tubulação silastic) são identificados individualmente através de um marcador permanente. Uma bola de silício (5 mm de diâmetro) circundando o cateter, é colocado 4-5 cm a partir do final de cateter para ajudar a prevenir o cateter de deslizar para fora do intestino (Figura 1). Após a esterilização em autoclave, uma pomada não-antibiótico (Orbeseal) é assepticamente inserido na extremidade do cateter (3-5 mm), o que garante que o cateter permanece patente (ou seja, não tornar-se conectado por mucosa sloughed dentro do loop).
- Uma pequena incisão é colocada no aspecto cranial de cada um dos três loops. Cada buraco é ampliada com introdutor de cateter ('dilatador navio', por exemplo), e um segmento 6-8 centímetros de cateter é inserido caudalmente emo loop, até que a bola passa silcone no lúmen (Figura 1).
- A parede intestinal é garantido ao redor do cateter com uma sutura em bolsa (2-0 Vicryl). O cateter é mais seguro para o intestino, amarrando o cateter com a ligadura de seda que delineava a extremidade cranial do loop.
- Ampicilina (5 ml, 100 mg / ml em PBS quente) é injetado em cada ciclo e interespaço, eo intestino é colocado de volta na cavidade abdominal. Cefazolina (8 ml, 100 mg / ml em PBS quente) é injetado na cavidade peritoneal através da incisão abdominal.
- Uma única incisão pequena é feita através da parede abdominal adjacente à incisão mediana, e os cateteres são exteriorizados através deste site.
- A posição ea tensão dos cateteres é ajustado dentro da cavidade peritoneal. Músculos abdominais são fechadas com um padrão de sutura interrompido simples (fio absorvível; Catgut # 3), ea pele é fechada com um padrão horizontal interrompido colchão (sutura não absorvível; Supramid # 1).
- Um tubo de aço inoxidável curvadas oca (7 mm de diâmetro, 10 mm de diâmetro externo, 65 cm de comprimento) é inserido sob a pele perto da incisão abdominal, túneis sob a pele para um local de saída apenas caudal para o pescoço e entre os ombros. Os cateteres são inseridos no tubo e empurrada para a frente por pelo menos 50% do comprimento do tubo. O tubo com os cateteres é então retirado da pele no local da saída, expondo os cateteres.
- A tensão dos cateteres é ajustada no local incisão, ea pele é fechada com Supramid # 1.
- Cateteres individuais são identificadas e colocadas dentro de uma "bolsa" bandage que é suturada à pele com Supramid # 1. A bolsa protege os cateteres de danos subseqüentes.
- Pós-operatório, as ovelhas são injetadas IM com flunixin (sid) com uma dose inicial 2,2 mg / kg, seguido por uma dose de manutenção de 1,1 mg / kg sid durante 3 dias. Ovelhas também são injetados IM com Hemostam (3 ml) e enrofloxacina (2,5 mg / kg) SID para 3 e 5 dias, respectivamente. Os animais são mantidos em Plasmalyte intravenosa 148 com solução de dextrose 5%, administrado continuamente com uma bomba peristáltica para garantir que o fluxo (145 ml / hr) continua, independentemente da posição do corpo. Eles são autorizados a beber ad libitum, mas alimentação é restrita até normal do rúmen e funções do intestino são restauradas. Ingestão de alimentos, o consumo de água, temperatura corporal, a passagem de fezes e urina, ruídos intestinais, desconforto abdominal, comportamento, e as concentrações de glicose no sangue são monitorados de perto (bid), quando necessário, as concentrações de glicose nos fluidos intravenosos são ajustados para manter as concentrações de glicose no sangue dentro da faixa normal. Química do sangue e hematologia (ou seja, fosfatase alcalina albumina, alanina aminotransferase, amilase, colesterol, cálcio, creatinina, glicose, fosfato inorgânico, bilirrubina total, proteínas totais, uréia, globulina, sódio, potássio, cloreto, pressão parcial de oxigênio, pH, parcial dióxido de carbono pressão, bicarbonato e dióxido de carbono total, contagem de células vermelhas e brancas do sangue, hematócrito, hemoglobina, contagem diferencial de glóbulos brancos e contagem de plaquetas) são monitorados antes e imediatamente após a cirurgia, e todos os outros dias depois. Uma vez que a função intestinal normal começa, fluidoterapia intravenosa é encerrada e os animais são transferidos para piquetes (ie 5-7 dias pós-cirurgia). Os animais são mantidos em baias individuais (dentro da vista de outros animais), reduzindo o estresse e as chances de sofrer danos à sua malotes cateter (por exemplo, mastigar por um penmate).
- Para injetar tratamentos em loops individual, 5 ml do tratamento é injetado no cateter, utilizando uma seringa estéril equipado com um calibre 18, ponta e agulha. Para garantir a deposição de todos os tratamento para o loop, o cateter é então injectado com 3 ml de PBS.
Pontos críticos:
Procedimentos de importância crucial para o sucesso deste procedimento cirúrgico incluem: (1) verificar se o intestino não está torcido sobre si mesmo antes de estabelecer a anastomose, (2) garantir a integridade e permeabilidade da anastomose; (3) proteger adequadamente o cateter a parede loop com a ligadura delinear a extremidade cranial do loop, mas garantindo que o anexo não afeta a permeabilidade do cateter; (4) minimizando o manuseio intestinal e garantir que intestino exteriorizado é mantida úmida; (5) assegurar o adequado dos cateteres tensão; (6) assegurar que a integridade do cateter não é afetada durante a sutura do músculo e pele; (7) impedindo gorging pelos ovinos pós-cirurgia (ou seja, durante o período de íleo pós-operatório), que pode causar impactação ruminal e comprometimento da rúmen função; e (8) assegurar que os animais recebem terapia intravenosa de líquidos suficientes para os primeiros 3-5 dias pós-operatório, que as concentrações de glicose no sangue são cuidadosamente monitoradas, e as concentrações de glicose nos fluidos intravenosos são regulávelted se necessário, para prevenir a hipoglicemia. 
Figura 1. A representação esquemática da cateterizada loops ileal. Observe a três 15 cm de comprimento cateterizada 'loops', os dois 15 centímetros de comprimento não-cateterizada "vãos" estabelecida entre os loops, e os dois segmentos de 5 cm de comprimento terminal, todas as estabelecidas dentro de um segmento de 85 cm de comprimento 'intestinal "de um íleo ovelhas.
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Discussion
Neste procedimento, fomos capazes de estabelecer com êxito cateteres em alças intestinais estabelecido na íleo dos ovinos. Ao aderir a cuidados pós-operatórios rigorosos, os animais rapidamente recuperado do procedimento e retomou as atividades normais dia 07/05 após a cirurgia. Determinou-se que o estabelecimento de cateteres dentro de loops não afeta a função da mucosa intestinal ou imunes (dados não mostrados) e animais podem viver por pelo menos 8 semanas após a cirurgia. Este procedimento permite-nos apresentar vários tratamentos em distintos compartimentos imunológicos mais de um intervalo prolongado, uma vez que os animais se recuperaram de cirurgia, e para medir empiricamente os efeitos fisiológicos e imunológicos destes tratamentos.
Uma consideração importante para futuros experimentos é a localização do segmento intestinal dentro do intestino delgado. Neste procedimento, criado cirurgicamente o segmento intestinal dentro do "íleo imunologicamente funcional" frequentemente definidos pela ileal (contínuo) de Peyer patches (5,6). Esta área pode se estender cranialmente até 2 m além vezes ileocecal. Embora esta região é considerada anatomicamente como o jejuno, no contexto da função imunológica, é íleo, destacando a importância de considerar a função para descrever regiões intestinal.
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Disclosures
Todos os procedimentos em animais experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care (Protocolo de Uso de Animais # 0609) e seguiu as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados Animal.
Não temos nada para revelar.
Acknowledgments
A pesquisa não poderia ter sido concluído sem a dedicação e esforços de muitas pessoas no Agriculture and Agri-Food Canada Research Centre, Lethbridge, Alberta, Canadá. A este respeito, nós agradecemos: Tara Shelton para pré e cuidados pós-operatórios de animais, preparação cirúrgica e anestesiologia, análise de amostras, e assistência com o vídeo de imagem; Randy Wilde e Estela Costa para os cuidados pré e pós-operatório; Jenny Gusse para análise de amostras; Byron Lee para trocar a imagem, e Brian Egland criação de ovinos. Agradecemos também Brent Selinger (Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Lethbridge) para fornecimento de equipamentos de vídeo e conselhos, bem como outras formas de assistência (ou seja, produção executiva), e do Curriculum Development Re-Centre, Universidade de Lethbridge para perícia videografia. Este estudo foi apoiado em parte por concessões do Foods Avançado e Rede de Materiais (GDI), o Canadá, Alberta Beef Fundo de Desenvolvimento da Indústria (GDI), e Agricultura e Agri-Food Canada (GDI e JPK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical gloves | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103091 | |
| Surgical mask | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MAX53013 | |
| Surgical gown | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 3365 | |
| OB Apron | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900062 | |
| Surgical cap | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903271 | |
| EZ Scrub brush | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC377479 | |
| Anesthetic machine | Boyle | - | |
| Sodasorb | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108638 | |
| Laryngoscope | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Laryngoscope blade (Miller blade #4) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 902667 | |
| Endotracheal tube (7.0 - 8.5 mm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Lidocaine endotracheal spray | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103364 | |
| Acepromazine | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AUS01020 | |
| Glycopyrrolate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | SAB2880 | |
| Butorphanol tartrate | Western Drug Distribution Center, Ltd. | AYE304541 | |
| Diazepam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sab790 | |
| Thiopental sodium | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103508 | |
| Epinephrine hydrochloride | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103856 | |
| Doxapram | Strathcona Pharmacy | - | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 100339 | |
| Hemostam | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103857 | |
| Flunixin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | sch140100 | |
| Enrofloxacin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | hll0049 | |
| Metronidazole | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101653 | |
| Ampicillin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | NOV67185-6 | |
| Cefazolin | Western Drug Distribution Center, Ltd. | nov69397 | |
| Electroscapel | Macan | MV8 | |
| Heating mat | Kane | PHMD-48 | |
| Stomach tube (Nalgene tubing 5/16" ID) | Fisher Scientific | - | |
| Needle driver | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108338 | |
| Addison brown forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 911075 | |
| Rat tooth forcep | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 5275 | |
| Kelly forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901133 | |
| Mosquito hemostat | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108471 | |
| Carmalt forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901225 | |
| Scalpel handle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900285 | |
| Scalpel blade #22 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900511 | |
| Metzenbaum scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901166 | |
| Sharp-sharp scissor | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 108264 | |
| Towel clamp | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901213 | |
| Allis tissue forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 901201 | |
| Doyen’s forcep | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 904226 | |
| Stainless steel bowl | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903601 | |
| Stainless steel trocar (curved) | Local Supplier | - | |
| Catheter introducer | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 11440 | |
| Surgical towel | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 7972 | |
| Disposable drape | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 900035 | |
| Steri drape | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2323 | |
| Drape (40 x 40 cm) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 8358 | |
| Surgical drape (7" x 11 ¼" opening) | The Veterinary Medication Distribution Center Inc., St. Hyacinthe, QE | 2694 | |
| Vicryl (2-0) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | JJMJ333H | |
| Silk 2-0 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105248 | |
| Catgut #3 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-2070 | |
| Supramid #1 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | CSL547-3040 | |
| Needles (cutting and non-cutting) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | - | |
| Silastic tubing (0.040" ID, 0.085" OD) | Fisher Scientific | 11-189-15D | |
| Orbeseal ointment | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 106344 | |
| Clear silicone (732 multi-purpose sealant) | Local Supplier | - | |
| Blunt end needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 905035 | |
| Marker (permanent industrial) | Local Supplier | - | |
| Catheter pouch (constructed of Elastoplast 7.5 cm) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Hospital tape (2") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 103842 | |
| Hospital tape (1") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | VLMRENF20 | |
| Gauze sponge 4x4 | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107551 | |
| Gauze cling | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 107633 | |
| Elastoplast 7.5cm | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104094 | |
| Elastoplast rippable bandage | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104093 | |
| Syringe (60 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104004 | |
| Syringe (10 ml) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc301604 | |
| 25G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305122 | |
| 20G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BDC305175 | |
| 18G Needle | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 903353 | |
| Intracath IV catheter (16G 8") | Western Drug Distribution Center, Ltd. | bdc3831621 | |
| IV administration set (10 drop) | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 101797 | |
| 0.9% NaCl solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB1322P | |
| Plasmalyte 148 solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | BAXJB2534 | |
| Dextrose | Western Drug Distribution Center, Ltd. | MCT60190 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 7524-10 | |
| Livestock identification tag cement | Local Supplier | - | |
| Germex solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | mtc60270 | |
| Isopropyl alcohol | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 104590 | |
| Stanhexidine cleanser | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 109248 | |
| Prepodyne solution | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105710 | |
| Prepodyne scrub | Western Drug Distribution Center, Ltd. | 105711 |
References
- Vidal, J. E., McClane, B. A., Saputo, J., Parker, J., Uzal, F. A. Effects of Clostridium perfringens beta-toxin on the rabbit small intestine and colon. Infect. Immun. 76, 4396-4404 (2008).
- Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet. Pathol. 39, 200-215 (2002).
- Uzzau, S., Leori, G. S., Petruzzi, V., Watson, P. R., Schianchi, G., Bacciu, D., Mazzarello, V., Wallis, T. S., Rubino, S. Salmonella enterica serovar-host specificity does not correlate with the magnitude of intestinal invasion in sheep. Infect. Immun. 69, 3092-3099 (2001).
- Gerdts, V., Uwiera, R. R. E., Mutwiri, G. K., Wilson, D. J., Bowersock, T., Kindane, A., Babiuk, L. A., Griebel, P. J. Multiple intestinal 'loops' provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J. Immunol. Methods. 256, 19-33 (2001).
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