La production de lentivirus

Summary

Pour faire des lentivirus, des vecteurs d'ADN sont transfectés dans les cellules humaines 293. Après la récolte et la concentration du surnageant, le titre viral est déterminé par l'expression de fluorescence avec un cytomètre en flux.

Abstract

L'interférence ARN (ARNi) est un système d'inactivation des gènes dans les cellules vivantes. Dans l'ARNi, les gènes homologues en séquence à court ARN interférents (siRNA) sont réduits au silence à l'état post-transcriptionnel. ARN en épingle à cheveux courts, des précurseurs de siARN, peut être exprimé en utilisant des lentivirus, permettant l'ARNi dans une variété de types cellulaires. Les lentivirus, comme le virus de l'immunodéficience humaine, sont capables d'infecter à la fois la division et non de division des cellules. Nous allons décrire une procédure pour lentivirus colis. Emballage se réfère à la préparation de virus compétents de vecteurs d'ADN. Lentiviraux systèmes de production de vecteurs sont basés sur un «split» du système, où le génome viral naturel a été divisée en des constructions individuelles d'aide plasmide. Ce fractionnement des différents éléments viraux en quatre vecteurs séparés diminue le risque de créer un virus capable de réplication-par recombinaison fortuite du génome lentiviral. Ici, un vecteur contenant le shRNA d'intérêt et de trois vecteurs d'emballage (p-VSVG, pRSV, pMDL) sont transfectées de façon transitoire dans les cellules humaines 293. Après au moins une période d'incubation de 48 heures, le surnageant contenant le virus est récolté et concentrée. Enfin, le titre viral est déterminé par le journaliste (fluorescent) l'expression d'un cytomètre en flux.

Protocol

Partie 1: La transfection de cellules HEK 293 cellules à produire de lentivirus

* 24 heures avant la transfection, plaque 2,5 x 10 ⁶ cellules dans un plat de 10cm pour une confluence de 50-70% le jour suivant.

1. Démarrer ce protocole par la préparation de l'ADN avec lequel on sera plus tard son transfecter des cellules de rendre le virus. Premièrement, diluer FuGENE 6 réactif de transfection Roche, un réactif lipidique qui rendent les cellules prennent l'ADN. Dans un tube de 1,5 ml, pipette 30μl FuGENE 6 dans 600ul milieu sans sérum (SFDMEM). Soyez prudent de ne pas laisser FuGENE toucher le côté du tube, comme il est livré dans le milieu. Que ce FuGENE et mélanger SFDMEM et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
2. Dans le bouchon du tube, mélanger 4 ug lentiviraux plasmide avec 4 ug de chaque 3 ^ème génération de vecteurs viraux emballage (pMDL, pRSV et pVSV-G). Le plasmide lentiviral contient l'ADN du virus va insérer dans le génome de chaque cellule qu'il infecte, tandis que les vecteurs d'emballages contenant des gènes de toutes les autres protéines nécessaires pour faire un lentivirus.
3. Fermer le couvercle et mélanger en inversant le tube à quelques reprises.
4. Incuber 15-20 minutes à température ambiante.
5. Pipeter ensemble du contenu du tube dans 293 plaques. Mélanger doucement par plaque basculante en arrière.
6. Retour aux cellules de l'incubateur et de permettre la production virale se poursuivre pendant 48-96 heures avant la récolte.
7. Durant l'incubation, les cellules 293 transcrire l'ADN d'intérêt à partir du plasmide lentiviral, créant une copie d'ARN de la construction lentiviraux. Ils ont aussi transcrire et traduire des gènes dans les vecteurs d'emballage dans les protéines virales. Ces protéines font procéder à des virus ARN contenant la version de votre construction lentiviral, dont le virus se transcription inverse et l'insérer dans les génomes de toutes les cellules qu'il infecte.

Partie 2: Récolte lentiviraux

1. Après la période d'incubation, prélever des cellules de l'incubateur et d'utiliser une seringue de 10 ml à usage unique, pour éliminer le surnageant, qui contient maintenant le virus. Il y aura environ 10 ml de surnageant.
2. Fixez un filtre à seringue 0.45μM à la pointe et de filtrer les virus dans un tube Ultracentrifuger Beckman. Le filtre ne permet que des virus, des cellules et non de passer à travers.
3. Avant de jeter, incuber les cellules produisant du virus, des plaques de culture, des seringues et des filtres dans l'eau de Javel à 10% pendant 45 minutes.

Partie 3: Concentration lentiviraux par ultracentrifugation

1. Charger des tubes à centrifuger en SW-41Ti ou SW-28 seaux rotor.
2. Utilisez DMEM sans sérum pour équilibrer tous les virus contenant des tubes à l'intérieur 0.2g.
3. Sceau du rotor fermé seaux et de les accrocher du rotor avant de placer le rotor à l'intérieur du ultracentrifugeuse
4. Spin le virus pendant 90 minutes dans une ultracentrifugeuse à 4 ° C à 25000 rpm dans un rotor SW-41Ti ou 24000 rpm dans un rotor SW-28.
5. Dans une hotte de culture de tissus, inverser les tubes à l'envers pour verser le surnageant dans un récipient contenant l'eau de Javel à 10%.
6. Utilisez un Kimwipe pour absorber l'excès de liquide autour de la boulette et inverser le tube dans un rack pratique pour pas plus de cinq minutes.
7. Pour re-suspendre le culot viral, utiliser un embout de filtre pour ajouter 100 ul de PBS stérile dans le tube, puis la pipette et une baisse d'environ 20 fois.
8. Laisser le virus à 4 ° C pendant la nuit pour terminer la remise en suspension. On peut stocker preps virale à 4 degrés pendant environ 1 semaine et à -80 degrés jusqu'à un an. N'oubliez pas de traiter tous les tubes vides avec l'eau de Javel à 10% avant de les jeter.
9. Si on veut utiliser la prépa virale pendant plus de la semaine 1, faire des aliquots minimale de 5-20 pi pour des expériences futures et une aliquote de 3 à 5uL pour le titrage. Congeler et stocker l'aliquots à 80 moins.

Partie 4: Titrage lentiviraux par cytométrie en flux

1. La prochaine étape est de déterminer le titre viral par cytométrie en flux. Cette méthode fonctionne uniquement dans les cas où le plasmide lentiviral contient un gène rapporteur fluorescent. L'idée est que lorsque le virus infecte une cellule, il introduit l'ADN plasmidique dans le génome lentiviral de cette cellule. La cellule infectée sera ensuite transcrire et traduire les gènes que vous avez inclus dans le plasmide lentiviral, et si vous avez inclus un gène rapporteur fluorescent, les cellules infectées seront fluorescence. Le niveau de fluorescence représente la puissance, ou titre, du virus.
2. Pour chaque stock viral pour être titrés, diluer 3 ul de virus concentré dans 1,5 ml de milieu complet (DMEM, stylo-streptococcique, la glutamine, FBS).
3. Dans les puits 1-6 dans une seule rangée d'une plaque de 96 puits, effectuer les dilutions suivantes de série: à tous les 6 puits ajouter 100 ul de DMEM complet des médias. Pour le premier bien ajouter 100 ul de médias sans virus (ce qui est de votre contrôle non coloré), à la seconde même ajouter 100 ul du virus dilué (ce qui équivaut à1 ml de virus non dilué), au troisième puits ajouter 100 uldu mix du second puits, à la quatrième et ajouter 100 ml de la 3ème ainsi, pour la cinquième et ajouter 100 ul du puits 4, et pour la sixième et ajouter 100 ul de la 5ème bien. Enfin, prenez 100ul du puits 6 et jeter dans l'eau de Javel. Une dilution en série a été réalisée, où chaque puits a la moitié du volume de virus par rapport à celle qui la précède.
4. Porter le volume total dans tous les puits à 200 pl. Notez que ce sont des dilutions seulement suggéré, ce qui devrait bien fonctionner pour titrage des virus les plus concentrées. Si le virus est faible en titre, ou non concentré on peut avoir besoin d'ajuster les dilutions.
5. Traitez tout virus inutilisée dilué avec Javel à 10% pendant 45 minutes avant de les jeter dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux.
6. Ajouter ~ 15000 saines, les cellules en division active 293 à chacun des six puits. Une seule plaque de 96 puits peut être utilisée pour titrer 16 preps virale.
7. Retour cellules à 37 degrés avec incubateur 5% de CO ₂ et permettre l'infection de procéder au moins 48 heures.
8. Après l'incubation, les cellules sont analysées pour l'expression journaliste (dans notre cas, la fluorescence) avec un cytomètre en flux. Les particules virales sont quantifiés par le pour cent des cellules fluorescentes par puits.

Calculer le nombre d'unités infectieuses par ml avec la formule suivante:

_{(Nombre de cellules par puits, le jour des cellules d'infection journaliste de X positive) X 1000}
^{______________________________________________________
ml de vecteur ajouté à bien}

Partie 5: Résultats du représentant:

Après une transfection de 48 heures d'incubation après, la plaque de 293 cellules devrait être d'environ 90% fluorescentes. Un pourcentage élevé de cellules fluorescentes est une indication d'un pourcentage élevé de cellules produisant des virus.

Après centrifugation, le culot viral est à peine visible lorsque la remise en suspension. Ceci est normal que la pastille est clair et très petites entreprises.

Lors de l'interprétation des résultats cytomètre en flux, notez que l'on ne peut atteindre les calculs précis quand titre infectés (fluorescentes) des cellules avons reçu pas plus d'une intégration virale par cellule. Afin de s'assurer que cela est le cas, utiliser des cellules avec un taux <15% d'infection pour les calculs. Cellules avec des taux d'infection plus élevés ont probablement reçu plusieurs intégrants viraux par cellule. Les dilutions suggéré dans l'étape 2 devrait donner plusieurs échantillons dans cette gamme d'infection. Idéalement, utilisez plusieurs échantillons pour générer une parcelle de titration (ligne linéaire) à partir de laquelle vous pouvez calculer le titre final, mais vous pouvez calculer un titre en utilisant un seul échantillon, si nécessaire. On peut s'attendre à un titre de 1,0 x 10 ⁷ TU / ml pour les non-concentrée de virus et 1,0 x 10 ⁸ TU / ml pour le virus de concentré.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS	Invitrogen
FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes	Falcon BD	353003
Multichannel pipette	Rainin
Filtered pipette tips	Rainin
1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm)	Eppendorf
Ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter Inc.
Tissue culture incubator at 5% CO2	Coulter
Beckman SW41T.I rotor
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluorescent microscope	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.