Визуализация Одноместный молекулярных комплексов В Vivo Использование дополнительных флуоресцентной микроскопии

Summary

Здесь мы показываем, протоколы для выполнения одной молекулы флуоресцентной микроскопии на живые клетки бактерий чтобы функциональных молекулярных комплексах для обнаружения, отслеживания и количественно.

Abstract

Полное понимание механизмов живых клеток может быть достигнуто только путем исследования основных процессов, которые вызывают и прямой событий на клеточном уровне. На сегодняшний день сдвига сложности биологических систем вызвало точное одиночных молекул экспериментов, чтобы быть слишком требовательным, сосредоточить внимание на изучении одной системы, использующие относительно сырая масса ансамбль среднего измерений. Тем не менее, многие важные процессы происходят в живой клетке на уровне одного или нескольких молекул, ансамбль измерений обычно маски стохастической и гетерогенный характер этих событий. Здесь, используя передовой оптической микроскопии и аналитические инструменты для анализа изображений мы покажем, как контролировать белков в пределах одной живой бактериальной клетки с точностью до отдельных молекул, и как мы можем наблюдать динамику внутри молекулярных комплексов в функционировании биологических машин. Методы имеют непосредственное отношение физиологически. Они минимально-пертурбативные и неинвазивные к биологическому исследуемого образца и полностью приспособлены для исследований в живой материал, функции, не доступны для других одиночных молекул подходы биофизики. Кроме того, биологических образцов, изучил все производят флуоресцентно с метками белка на уровнях, которые почти идентичны немодифицированные штаммов клетки ("геномной кодирования»), в отличие от более общих, но менее идеальный подход для генерации значительно больше белка, чем это происходит естественным ('плазмиды выражение'). Таким образом, фактические биологические образцы, которые будут изучены значительно ближе к природных организмов, и поэтому наблюдения более актуальными для реальных физиологических процессов.

Protocol

1. Чтобы начать эту процедуру, 50 мкл замороженные запасы флуоресцентный белок выражения кишечная палочка бактериальной клетки первого размороженные и выросли аэробно при встряхивании в 5 мл LB питательных сред ночи при 37 ° С. Утром, 50 мкл этого насыщенного культуры извлекается и суб-культурных на минимальные M63 глюкозы культуре средств массовой информации, инкубации при температуре 30 градусов С в течение 4 до 6 часов. Здесь мы показываем, с использованием двух различных штаммов клетки, одна из которых выражает электрон-транспортных цитохрома слит с GFP, другой, который выражает белок, участвующий в бактериальных жгутиков двигателя сливают с GFP.
2. Клетки могут либо собраны непосредственно из растущих суб-культуры, если рассматривая их как иммобилизованных образцов, или они могут быть стриженой укоротить бактериальных жгутиков при просмотре под "привязаны" условиях.
3. Стрижка обычно включает в себя размещение 1-5 мл суб-культуры в устройство, состоящее из двух стерильных шприцев присоединились стерильной трубопроводов. Стрижка делается путем нажатия переменным в каждом шприцевой насос толкать культуру через узкую трубку. Это делается в 50-100 раз, в зависимости от степени сдвига требуется. Культуры центрифугируют для осаждения клеток, что ресуспендировали на минимальных средах, чтобы удалить фрагменты жгутиков.
4. Мы затем подготовить очищены BK7 покровные стекла, погружая в насыщенный раствор КОН в этаноле в течение 20 минут, затем тщательно полоскания в деионизованной воды и этанола, оставляя сохнуть на воздухе в течение не менее 1 ч.
5. Построим простой поток-клеток к дому клетки в микроскоп. Это включает в себя рисование линий парафина смазки на BK7 микроскопический слайд стекла, а затем создать туннель-сэндвич, разместив один из очищены coverlips на вершине, а нажатие вниз осторожно с парой щипцов, давая объемного расхода ячейки 5-10 мкл .
6. Для наблюдения иммобилизованных клеток мы заполняем поток-клеток с помощью инъекции с 0,1% м / о раствора поли-L-лизин, и дать ему для инкубации при комнатной температуре в течение 1 мин. Затем мы вровень с помощью 100 мкл минимальные средства массовой информации путем введения средств массовой информации с одного конца потока клеток и влагу салфеткой от друга.
7. Затем мы фитиль через 20 мкл разведения 1:500 200 нм диаметром латекса микросфер (Polysciences) на минимальных средах, чтобы отметить покровное поверхности. Поток-клеточной инвертируется, что покровное обращены вниз, размещенных на платформу очистить поверхности в простой камере влажности, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Unbound бисер затем смыть влагу до 100 мкл минимальными средствами массовой информации.
8. Если мы хотим наблюдать привязаны клетки мы опускаем поли-L-лизин шаг и вместо того, чтобы заполнить поток-клеток с 5 мг / мл анти-флагеллин антител. Потока ячейка место в камере влажности в течение 10 мин, а затем вспыхнул насквозь влагу.
9. 20 мкл клеточной культуры является то злой через поток-клеток, либо с помощью стриженого образца, если наблюдения привязаны клеток или unsheared образца в просмотре иммобилизованных клеток.
10. Поток-клеточной инвертируется и помещается в камере влажности в течение 20 мин. Свободные клетки затем вымываются влагу до 100 мкл минимальными средствами массовой информации.
11. Каплю иммерсионного масла находится в центре верхней поверхности покровного стекла, а поток-клеток помещается мягко к держателю образца из индивидуальному заказу флуоресцентного микроскопа, что делает оптический контакт с высокой числовой объектива диафрагму.
12. Электронный микроскоп-умножения камера включена и настройки камеры, чтобы быть охлаждены до -70 ° С, программное обеспечение установлено в получении изображений на типичный частотой кадров 25 Гц в кадре режим передачи, первоначально disenabling получить контроль на камеры.
13. Освещение светлого включен и изображение не попадет в фокус, выбрав подходящую клетку или группу клеток для включения в образ на основе их застряли с их длинных параллельных оси покровное поверхности. Фокус тонко регулировать, чтобы 200 нм латексных бусин прилипли к поверхности покровного только в фокусе.
14. Последовательность изображений приобретается в светлое записывать контур тела клетки. Освещение светлого выключен и усиление камеры включена на максимум.
15. Для стандартной комплектации использованием флуоресценции полного внутреннего отражения (или TIRF) лазерного луча на соответствующей длины волны (в данном случае, за зеленый флуоресцентный белок возбуждения, мы используем лазер 473 нм) заданного таким образом, чтобы быть сосредоточена в задней фокальной плоскости объектива, но боковое смещение от оптической оси для создания затухающих поле для возбуждения флуоресценции в ячейку образца.
16. Камера приобретения запускается и лазерной затвор открыт для возбуждения флуоресцентных белков внутри бактерии. Параметры интенсивности лазерного и скорость приобретения должны быть оптимизированы для конкретных биологических исследуемой системы, экспериментируя с разными значениями, но типичный диапазон тElevant к изучению мобильные комплексы белка в клеточной мембране находятся 1-10 мВт лазер по площади круга возбуждения диаметром ~ 30 мкм, время экспозиции в рамках 5-40 мс. Образцы светящимися до photobleached, как правило, в течение ~ 10 с
17. Этот протокол может быть использован как для привязанных клеток, в которых тело клетки вращается вокруг точки крепления между покровным и жгутиковых заглушки, а также для иммобилизованных клеток, которые жестко крепится к покровным поверхности.
18. Некоторые сотовые штаммы, которые имеют большое количество копию комплексов выгоду от начальной дифракционной сосредоточены отбеливателя лазера на одном полюсе клетка до TIRF изображений. Этот отбеливатель равносильно тому, что используется в флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (или FRAP). Используя наш обычай микроскопом некоторые из лазерного возбуждения можно подпитывали на второй независимый путь, используемый для FRAP типа отбеливания. Обычно 1-10 мВт мощности лазера используется, с характерным временем отбеливателя в диапазоне 10-300 мс. Это приводит к гораздо выше изображения контраста в беленой зоне ячейки позволяет отдельные комплексы, которые впоследствии диффундировать в этой области, чтобы быть более легко визуализировать.
19. Для визуализации комплексов в цитоплазме клеток которые диффундируют гораздо быстрее, чем те, в клеточной мембране различные режимы освещения называется "slimfield" работает. Здесь сфокусированного лазерного расширяется латерально просто охватывают одну ячейку. Это производит очень сильное поле позволяет намного быстрее экспозиции обычно миллисекунды должны быть приняты.
20. После сбора данных, изображений подаются в письменном пользовательских программ (закодированы в LabVIEW 8.5). Это автоматически определяет позиции флуоресцентные пятна в клетках с точностью до нескольких нанометров обычно и извлекает их размер и яркость. Brightnessof фотообесцвечивания следа по отношению ко времени гусеничных молекулярного комплекса затем используется для оценки стехиометрии, то есть, сколько отдельных флуоресцентные белки составляют единую молекулярного комплекса.

Представитель Результаты:

Когда протокол будет сделано правильно, образы клеткам рассматривать в светлое, очень различны, с периметры клеточных тел темно против белого / серого тела клетки (рис. 1а). В флуоресценции с помощью иммобилизованных клеток, мы можем увидеть различные интенсивности пятна, типично 250-300 нм в ширину (рис. 1b). Здоровые, привязанный клетки будет видно вращаться вокруг точки троса вложение в светлое изображение. Под возбуждения флуоресценции некоторых молекулярных комплексов в нашем случае также может быть замечены в точке присоединения, с указанием локализации меченых белков с жгутиковых двигателя. Эти пятна отдельных молекулярных комплексов и многие из них видели, будет зависеть от используемого режима освещения и сколько комплексов, фактически находящихся в ячейке на любой момент времени. Мобильности пятен зависит от конкретной биологической системы в стадии изучения. Если плотность пятен изначально очень высок, как в случае с меченым цитохромов здесь используется, то выполнение начального отбеливателя FRAP может улучшить изображения контраста.

Рисунок 1. (А) Светлое и (Б) TIRF изображения (условные цвета) для иммобилизованных клетка кишечной палочки выражения белка, слитого с зеленого флуоресцентного белка (GFP), который, как известно, участвует в жгутиковых моторов бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Discussion

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не "за сдвига" ячейки для глядя на привязал бактерий, так как это может привести к нарушению функциональности жгутиковых моторов. Важно использовать клетки намного дольше, чем один раз на час стекло микроскопа, так как они могут стать кислород исчерпан. Значительная оптимизация может потребоваться, чтобы найти лучшие условия микроскопе изображение обслуживали вашей конкретной биологической системе ведется расследование. Может быть, стоит попытаться визуализации с использованием очищенной GFP только установить правильный возбуждения лазерного излучения, необходимые для вашей конкретной системы микроскопа.