Summary
במאמר זה אנו מתארים כיצד נקבל סריג עקבות של מולקולות דנ"א בודדות משותקת על משטח באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal.
Abstract
פלואורסצנטי תהודה העברת אנרגיה (סריג) מיקרוסקופיה כבר בשימוש נרחב כדי לחקור את המבנה והדינמיקה של מולקולות ביולוגיות של עניין, כמו חומצות גרעין וחלבונים. מולקולה בודדת סריג (SM-סריג) מדידות על מולקולות משותקת היתר תצפיות ארוכות של מערכת יעילה עד צובעת הן photobleach, וכתוצאה מכך זמן עקבות כי דיווח על הדינמיקה biomolecular עם מגוון רחב של לוחות הזמנים של אלפיות דקות. כדי להקל על רכישת מספר גדול של עקבות עבור ניתוחים סטטיסטיים, התהליך חייב להיות אוטומטי והסביבה מדגם צריך להיות פיקוח הדוק לאורך זמן המדידה כולו (~ 12 שעות). מטרה זו מושגת באמצעות מיקרוסקופ סריקה אוטומטית confocal המאפשר חקירה של אלפי מולקולות בודדות הלילה, תא microfluidic המאפשר החליפין מבוקר של המאגר, עם תכולת החמצן מוגבלת ושומר על טמפרטורה קבועה לאורך כל תקופת המדידה כולה. כאן אנו מראים כיצד להרכיב את המכשיר microfluidic וכיצד להפעיל פני השטח שלו במשך immobilization DNA. אז אנחנו מסבירים כיצד להכין חיץ על מנת למקסם את photostability ואת משך החיים של fluorophores. לבסוף, אנו מראים את הצעדים מעורבים בהכנת ההתקנה לרכישת אוטומטיות מולקולות הזמן לפתור אחת סריג עקבות של מולקולות דנ"א.
Protocol
1 - הרכבת תא microfluidic
התא microfluidic נעשית על ידי פיוזינג בדוגמת, 2 מ"מ עובי, polydimethylsiloxane (PDMS) דיסק לחמוק נוקה לאחרונה כיסוי קוורץ. הדיסק מכיל ארבעה PDMS 30 חדרי מלבני μl הנגישים מפרצון ו לשקע גמישה נימים מחובר למאגר חיץ ומשאבה מזרק, בהתאמה, עבור זרימה מבוקרת של המאגר. התא זרימה נתמך על הצד האחורי שלה על ידי חלון זכוכית והניחו על בעל מחוייט תא המכיל מים מקורר אלמנט תרמואלקטרי כדי לווסת את הטמפרטורה.
- כדי להפוך את PDMS בדוגמת דיסק, לערבב 10 חלקים אלסטומר בסיס סיליקון עם סוכן 1 לרפא חלק, ומערבבים היטב ולהשאיר degassing שעה 1 בוואקום.
- בעדינות יוצקים את תערובת אלסטומר עובש על התא microfluidic. במקרה שלנו, מדובר 1 "פרוסות סיליקון עם ארבע רצועות (1x10 1x10 4 x 3 x 300 מיקרומטר) עשוי photoresist שלילית. תשאיר את זה לרפא על צלחת חמה ב 70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
- בזהירות מקלפים את הדיסק PDMS נרפא מהתבנית בעזרת סכין גילוח. נתיך את הדיסק על החלון''1 כוס (המכיל 8 x 2 מ"מ בקוטר טרום קדח חורים בשני הקצוות של הערוצים) על ידי פלזמה חמצון שני משטחים למשך 30 שניות. נתיך חלונות זכוכית על הצד השטוח של הדיסק PDMS (הצד לא המכיל את ערוצים).
- הכנס 2 אינץ' בצינור ארוך וגמיש סיליקה התמזגו נימי דרך כל חור בחלון של זכוכית עד שהוא מגיע לערוץ. החדרת מחט הראשון ולאחר מכן הבאים עם נימי עשוי להקל על התהליך הזה. חותם את חלון זכוכית חורים באמצעות יציקת סיליקון ריפוי מהיר תרכובת כגון יצוקה-Kwik.
- שוטפים את ערוצי עם אתנול ומים, פלזמה להפעיל את התא יחד עם תלוש לנקות טרי, מכסים עגולים 1 אינץ' קוורץ למשך 30 שניות. אנו ממליצים לנקות את תלוש לכסות באמצעות פיראניה *. הפתיל להחליק לכסות לצד של התא המכיל את הערוצים, איטום לתאי.
- השאר את התא התאספו כדי לרפא לילה בטמפרטורת החדר.
* Piranha הוא פתרון של H 2 O 2 ו - H 2 SO 4 ב 1:2.5 הפרופורציות. כדי לנקות את מכסה מחליק, לטבול אותם פיראניה על 90 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
2 - הפעלת משטח immobilization מולקולה
עבור מחקרים חומצות גרעין, immobilization הפשוטה ערכת השטח כוללת ציפוי הראשון זכוכית או להחליק לכסות עם קוורץ biotinylated אלבומין בסרום שור (BSA) ולאחר מכן עם streptavidin. זה מאפשר דגימה biotinylated להיות משותק עם סגוליות גבוהה במשך ימים בטמפרטורת החדר.
- חיבור צינור גמיש כדי הנימים להזרקה חיץ קל באמצעות מזרק ומחט.
- הזרק פתרון של 0.1 מ"ג / מ"ל BSA biotinylated במאגר (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, מסונן באמצעות מסנן 0.02 מיקרומטר) לתוך הערוץ דגירה של לפחות 30 דקות.
- 300-500 תזרים μl של חיץ כדי להסיר כל BSA biotinylated בחינם מערוץ, נזהרים שלא מלכודת כל בועות אוויר בתוך החדר.
- הזרק פתרון של 0.1 מ"ג / מ"ל streptavidin במאגר ו דגירה במשך 15 דקות. ואז לחזור על שלב 3.
- זרימה דרך פתרון 3-5 PM המדגם biotinylated. בצעו סריקה של פני השטח כדי לבדוק את הכיסוי של מולקולות ניאון. אם יש צורך, להגדיל את הריכוז מדגם ולקבל כיסוי טוב יותר. דגירה של 10 דקות ולחזור על שלב 3.
התא microfluidic הוא רכוב על הבמה ממונע xy המאפשר תנועה גס (עד 25 מ"מ) באמצעות מקודד אופטית מנועי DC, תנועה קנס (1 ננומטר) באמצעות שני לולאה סגורה מפעילים piezo (פיזיק Instrumente דגם M-014 או דומה). ניתן לעשות זאת לפני או אחרי הפעלת משטח immobilization המדגם.
3 - הכנת מאגר הדמיה (IB)
IB מורכב של מערכת החמצן האנזימטית הדחה וכן מרווה משולשת, כגון Trolox. מאז IB הוא הסמיק עד לילה כל הזמן, לפחות 10 מ"ל צריכים להיות מוכנים מראש.
- הכן 10 מ"ל של 0.8% w / v D-גלוקוז, לפחות 35 מ"מ טריס-HCl pH 8.0 ו - 50 mM NaCl במים deionized. ריכוז גבוה של חיץ חשוב משתי סיבות: Trolox המסת יהיה להפוך לחומצה הפתרון, ואת התגובה האנזימטית יהיה גם להוריד את ה-pH של התמיסה לאורך זמן. מאז הפתרון הזה יש חיי מדף ארוכים זה יכול להיות מאוחסן כפתרון המניות.
- ממיסים 5 מ"ג Trolox במאגר שהוכנו על ידי vortexing שלב 1 במשך כמה דקות ולאחר מכן רעד במשך 10 דקות>. Trolox אינו מסיס מאוד במים ב-pH> 7, ולכן לא ממהרים שלב זה. סנן את הפתרון באמצעות 0.2 מיקרומטר לסנן ולהשאיר degassing בוואקום במשך 10 דקות.
- הכן את הפתרון "gloxy" אנזימטית על ידי ערבוב 60 wate μlr, 20 μl של חיץ 5X, 20 μl של Catalase, 1 מ"ג גלוקוז אוקסידאז 100 μl של 10 מ"ג / מ"ל BSA. סנן את הפתרון באמצעות צנטריפוגות לסנן 0.22 מיקרומטר.
- בעדינות מערבבים את החיץ בין שלב 2 עם פתרון "gloxy" מ שלב 3 למנוע את היווצרות של בועות אוויר.
- תזרים IB דרך ערוץ בקצב קבוע של μl 5 / min באמצעות משאבת מזרק מכני לשלוט על קצב הזרימה. הבועה ארגון גז לתוך המאגר IB למנוע חמצן אטמוספרי מ מחדש מתמוססת לתוך המאגר.
סריקת המשטח, לוקליזציה מולקולה ורכישת עקבות עוצמת יחיד מולקולה נשלטת על ידי תוכנית LabVIEW המאפשר איסוף נתונים אוטומטיים 1. התוכנית סורקת 20x20 2 תחומי מיקרומטר ברזולוציה של 0.2 מיקרומטר, עם שיעור של 0.1 מיקרומטר / MS. הנתונים מעובדים מיד בעוצמה תשואה משוקלל מיקומם של כל הפיקסלים מעל ספירות הרקע. לאחר מולקולות משותקת נמצאים, הם עברו אחד אחד לתוך נפח confocal ואת עוצמות של התורם fluorophore acceptor נרשמות כפונקציה של זמן עד photobleach fluorophores שניהם. השלב מתוכנת ואז לעבור מקור חדש 100 מיקרומטר משם, תהליך הסריקה הוא חזר.
4 - תוצאות נציג
להלן כמה תמונות מראה את התא microfluidic התאספו לפני הפעלת פני השטח לאחר רכוב על המיקרוסקופ מוכן immobilization מולקולה. אם הערוץ מופעל בהצלחה, סריקות השטח צריך להיות דומה סריקות המתואר להלן מראה פליטה של התורם צבען (ירוק) ו - acceptor (אדום) לאחר עירור התורם ישיר. מולקולות אלו עברו אחד אחד לתוך נפח חיטוט את הקרינה מתועד לאורך זמן עד photobleach צובעת שניהם, כפי שמוצג עקבות מולקולה בודדת. מאת עקבות כמו אלה יכולים להשיג את היעילות סריג אשר מודיע על ההפרדה-acceptor התורם מיידי, אשר בתורו משמש כדי לחקור את המבנה והדינמיקה של מולקולות ביולוגיות של עניין.
איור 1: תא Microfluidic עם ארבעה ערוצים, כל אחד עם כניסה / יציאה הנימים. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
איור 2: תא רכוב על המיקרוסקופ מוכן למדידות. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
איור 3: תוכנית ההתקנה של SM-סריג מדידות. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 3.
איורים 4 ו -5: הערוץ האדום והירוק של סריקה של פני השטח משותקת סריג מולקולות נרגש עם לייזר ירוק. אנא לחץ כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 4 , או דמות 5 .
איורים 6, 7, 8 ו 9: מסלולי אינטנסיביות של התורם (ירוק) ו - acceptor (אדום) fluorophores שכותרתו מולקולת הדנ"א 8, 10, 16 ו - 18 basepairs מזה. אנא לחץ כדי לראות גרסה גדולה יותר של 6 דמות , דמות 7 , 8 דמות , או דמות 9 .
Discussion
אף על פי הפרוטוקול הנ"ל כבר מותאם במיוחד עבור המערכת שלנו עבור בחירה ספציפית של צבעים (ת.מ. ר ו ATTO647N), הוא בהחלט לא השיטה הוכיחה בלבד. לאחרונה, מערכת חמצן חלופי הדחה המורכב של חומצה protocatechuic (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) הוצגה כדי להגדיל את photostability של צבעים מסוימים 4. כמו כן, מדינות אחרות שלישיה quenchers כגון mercaptoethanol-β (BME) יכול לשמש במקום Trolox, אם כי אלה לא יכול לדכא לאורך זמן מצמוץ של צבעים מסוימים, בפרט Cy5 5.
למרות immobilization דרך ביוטין-streptavidin-biotinylated אלבומין בסרום שור (BSA) היא הבחירה המועדפת עבור מחקרים חומצות גרעין, פוליאתילן גליקול (PEG) מצופה משטח מתאים יותר מחקרים של חלבונים שכן היא שוללת הלא ספציפית הידבקות 1. בנוסף, תת עקיפה מוגבל שלפוחית בגודל ניתן לתמצת את biomolecule של עניין במקרים שבהם הוא יכול להיות מושפע אינטראקציות פני 6.
במאמר זה אנו השתמשו ההתקנה confocal מצויד photodiodes סיליקון מפולת לרכוש את עקבות עוצמת הקרינה. פרוטוקול זה עובד באותה מידה עם סך פנימית הקרינה מיקרוסקופים השתקפות (TIRF) מצויד מצלמות CCD. השתמשו משנה מיקרוסקופיה, SM-סריג יכול להודיע על החלטות מרחביות מתקרב אנגסטרום כאשר התורם אות acceptor מתוקנות כראוי 7.
Acknowledgments
אנו מודים צ'נדרן Sabanayagam על עזרתו בפיתוח המערכת, יהושע אדל עצה בעיצוב המכשיר microfluidic והצוות במכון רולנד באוניברסיטת הרווארד עבור עיבוד חלקים של ההתקנה. אנו מכירים דיונים מועילים עם חברי הקבוצה של מלר במכון רולנד ואת באוניברסיטת בוסטון, וחברי קבוצת ט 'הא' s ב UIUC מידע מועיל. לבסוף, אנו מעריכים את התמיכה הכספית של הקרן הלאומית למדע (PHY-0701207) לבין המכון הלאומי לבריאות (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
