Summary
In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.
Abstract
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-Mikroskopie wurde in großem Umfang verwendet werden, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse, wie Nukleinsäuren und Proteinen zu studieren. Einzelmolekül-FRET (sm-FRET)-Messungen an immobilisierten Molekülen erlauben langen Beobachtungen der System-wirksam, bis beide Farbstoffe photobleach-was in der Zeit-Spuren, die über biomolekulare Dynamik mit einem breiten Spektrum von Zeitskalen von Millisekunden bis Minuten. Zur Erleichterung der Übernahme einer großen Anzahl von Spuren für statistische Auswertungen, muss der Prozess automatisiert werden und die Probe Umfeld sollte dicht über die gesamte Messzeit (~ 12 Stunden) gesteuert werden. Dies geschieht mit Hilfe eines automatisierten konfokalen Mikroskop, das die Befragung von Tausenden von einzelnen Molekülen über Nacht ermöglicht, und einem mikrofluidischen Zelle, die den kontrollierten Austausch von Puffer erlaubt, mit eingeschränkten Sauerstoffgehalt und sorgt für eine konstante Temperatur während des gesamten Messperiode. Hier zeigen wir, wie die Mikrofluidik-Gerät montieren und wie man seine Oberfläche für die DNA-Immobilisierung zu aktivieren. Dann werden wir erklären, wie man einen Puffer vorbereiten, die Photostabilität und die Lebensdauer der Fluorophore zu maximieren. Schließlich zeigen wir die Schritte in der Vorbereitung der Einrichtung für die automatisierte Übernahme von zeitaufgelösten Einzelmolekül-FRET beteiligt Spuren von DNA-Molekülen.
Protocol
1 - Montage des mikrofluidischen Zelle
Die mikrofluidischen Zelle erfolgt durch Fusion aus einem gemusterten, 2 mm dick, Polydimethylsiloxan (PDMS) Festplatte auf eine frisch gereinigte Quarz Deckglas. Die PDMS-Diskette enthält vier 30 ul rechteckigen Kammern, die durch Ein-und Auslass flexible Kapillaren verbunden mit einem Pufferspeicher und einer Spritzenpumpe, bzw. für die kontrollierte Fluss von Puffer zugegriffen wird. Die Messzelle ist auf seiner Rückseite durch ein Glasfenster unterstützt und auf eine maßgeschneiderte Küvettenhalter mit einem wassergekühlten thermoelektrischen Element die Temperatur zu regulieren.
- Um die gemusterten PDMS Festplatte, mix 10 Teilen Silicon-Elastomer-Basis mit 1 Teil Härter, gut mischen und Entgasung für 1 Stunde im Vakuum.
- Vorsichtig gießen das Elastomer-Mix auf den mikrofluidischen Zelle Form. In unserem Fall ist dies ein 1 "Silizium-Wafer mit vier Streifen (1x10 4 x 1x10 3 x 300 um) von negativen Photoresist gemacht. Lassen Sie diese auf einer Heizplatte bei 70 ° C aushärten für zwei Stunden.
- Ziehen Sie vorsichtig das gehärtete PDMS Festplatte aus der Form mit einer Rasierklinge. Sicherung der Festplatte auf ein 1''Glasfenster (mit 8 x 2 mm Durchmesser vorgebohrt an beiden Enden der Kanäle) von Plasma-oxidierende beide Oberflächen für 30 Sekunden. Sicherung der Glasscheiben auf der flachen Seite des PDMS Festplatte (die Seite nicht mit den Kanälen).
- Legen Sie ein 2-Zoll langen, flexiblen Quarzglaskapillare Schlauch durch jede Glasscheibe das Loch, bis sie den Kanal erreicht. Einsetzen einer Nadel und dann nach mit der Kapillare kann diesen Prozess erleichtern. Seal die Glasscheibe Löcher mit einer schnellen Aushärtung Silikonverguss wie Kwik-Cast.
- Spülen der Kanäle mit Ethanol und Wasser, und Plasma-Aktivierung der Zelle zusammen mit einem frisch gereinigten, 1-Zoll runden Quarz Deckglas für 30 Sekunden. Wir schlagen vor, Reinigung dieses Deckglas mit Piranhas *. Fuse das Deckglas auf der Seite der Zelle mit den Kanälen, Abdichtung der Kammern.
- Lassen Sie die Montage Zelle zu härten bei Raumtemperatur über Nacht.
* Piranha ist eine Lösung von H 2 O 2 und H 2 SO 4 in 1:2.5 Proportionen. Zur Reinigung der Deckgläser, tauchen sie in Piranha bei 90 ° C für 20 min.
2 - Die Aktivierung der Oberfläche für Molekül Immobilisierung
Für Nukleinsäure-Studien besteht die einfachste Oberflächenimmobilisierung Schema der ersten Beschichtung eine Glas-oder Quarz-Deckglas mit biotinyliertem Rinderserumalbumin (BSA) und dann mit Streptavidin. Dies ermöglicht dem biotinylierten Probe mit hoher Spezifität für Tage bei Raumtemperatur immobilisiert werden.
- Connect flexible Schlauch an den Kapillaren zur einfachen Puffer-Injektion mit einer Spritze und Nadel.
- Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml biotinylierte BSA in Puffer A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, gefiltert mit 0,02 um-Filter) in den Kanal und Inkubation für mindestens 30 min.
- Flow 300-500 ul Puffer A mit einem freien biotinylierten BSA aus dem Kanal zu entfernen, wobei darauf geachtet, keine Luftblasen im Inneren der Kammer Falle.
- Inject einer Lösung von 0,1 mg / ml Streptavidin in Puffer A und Inkubation für 15 min. Wiederholen Sie dann Schritt 3.
- Der Fluss durch eine 3-5 pM Lösung des biotinylierten Probe. Führen Sie eine Oberflächen-Scan, um die Abdeckung der fluoreszierenden Moleküle kontrollieren. Wenn nötig, erhöhen die Konzentration der Probe um eine bessere Abdeckung zu erreichen. Inkubieren für 10 min und wiederholen Sie Schritt 3.
Die mikrofluidischen Zelle befindet sich auf einem motorisierten XY-Tisch ermöglicht grob (bis zu 25 mm) Bewegung mit optisch kodiert DC-Motoren montiert und fein (1 nm) Bewegung mit zwei closed-loop Piezo-Aktuatoren (Physik Instrumente Modell M-014 oder ähnlich). Dies kann entweder vor oder nach der Aktivierung der Oberfläche für die Immobilisierung Probe durchgeführt werden.
3 - Vorbereiten der Imaging Buffer (IB)
Die IB besteht aus einer enzymatischen Sauerstoffbindung und einem Triplett-Quencher, wie Trolox. Da der IB durch ständig über Nacht geleert wird, sollte mindestens 10 ml im Voraus vorbereitet werden.
- Bereiten Sie 10 ml von 0,8% w / v D-Glucose, mindestens 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 und 50 mM NaCl in deionisiertem Wasser. Die höhere Konzentration des Puffers ist aus zwei Gründen wichtig: Lösen Trolox wird die Lösung in einen sauren und der enzymatischen Reaktion wird auch niedriger der pH-Wert der Lösung im Laufe der Zeit. Da diese Lösung hat eine lange Haltbarkeit kann es als eine Stammlösung gelagert werden.
- Lösen Sie 5 mg Trolox im Puffer in Schritt 1 durch Vortexen für ein paar Minuten und dann Schütteln für> 10 min bereit. Trolox ist nicht sehr leicht löslich in Wasser bei pH> 7, so drängt es nicht diesen Schritt. Die Lösung wird mit einem 0,2 um-Filter und lassen Entgasung im Vakuum für 10 Minuten.
- Bereiten Sie die "gloxy" enzymatische Lösung durch Mischen von 60 ul water, 20 ul 5X Puffer A, 20 ul der Katalase, 1 mg Glucose-Oxidase und 100 ul 10 mg / ml BSA. Die Lösung wird mit einem 0,22 um Filter-Zentrifuge.
- Vorsichtig mischen Puffer aus Schritt 2 mit dem "gloxy"-Lösung aus Schritt 3 Vermeidung der Bildung von Luftblasen.
- Durchfluss der IB durch den Kanal mit einer konstanten Rate von 5 l / min mit einem mechanischen Spritzenpumpe, um den Fluss zu steuern. Bubble-Argon-Gas in die IB Reservoir an Luftsauerstoff aus re-Auflösung in den Puffer zu verhindern.
Die Abtastung der Oberfläche, Molekül-Lokalisierung und Erfassung von einzelnen Moleküls Intensität Spuren wird durch ein LabView-Programm, das automatisierte Datenerfassung 1 erlaubt gesteuert. Das Programm scannt 20x20 um 2 Bereiche mit 0,2 mm Auflösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 mu m / ms. Die Daten werden sofort verarbeitet, um die Intensität gewichteten Positionen aller Pixel über dem Hintergrund zählt zu erhalten. Sobald die immobilisierten Moleküle gefunden werden, werden sie verschoben eins nach dem anderen in das konfokale Volumen und die Intensität der Donor-und Akzeptor-Fluorophor als Funktion der Zeit, bis beide Fluorophore photobleach werden aufgezeichnet. Die Bühne ist dann so programmiert werden, um einen neuen Ursprung 100 pm weg, und der Scan-Vorgang wird wiederholt.
4 - repräsentative Ergebnisse
Im Folgenden sind einige Bilder zeigen die versammelten mikrofluidische Zelle vor Aktivierung der Oberfläche und, nachdem er auf dem Mikroskop bereit für Molekül Immobilisierung montiert. Wenn der Kanal erfolgreich aktiviert ist, sollte Oberflächenscans ähnlich sein wie die Scans unten zeigt Emission des Donor-Farbstoff (grün) und Akzeptor (rot) nach direkter Anregung des Donors dargestellt. Diese Moleküle sind eins nach dem anderen in die Sondierung Volumen bewegt wird und die Fluoreszenz wird im Laufe der Zeit, bis beide Farbstoffe photobleach aufgezeichnet, wie in der einzigen Molekül Spuren gezeigt. Von Spuren wie diese kann man erhalten, die FRET-Effizienz, die von der momentanen Donor-Akzeptor-Trennung, die wiederum verwendet, um die Struktur und Dynamik von Molekülen von biologischem Interesse zu erkunden, ist informiert.
Abbildung 1: Microfluidic Zelle mit vier Kanälen, die jeweils mit Eingang / Ausgang Kapillaren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.
Abbildung 2: Cell am Mikroskop bereit für Messungen montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 2 zu sehen.
Abbildung 3: Setup für sm-FRET-Messungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 3 zu sehen.
Abbildungen 4 und 5: Rote und grüne Kanal eines Oberflächen-Scan von immobilisierten FRET-Moleküle mit grünem Laser angeregt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen Abbildung 4 oder Abb. 5 .
Abbildungen 6, 7, 8 und 9: Intensity Flugbahnen der Spender (grün) und Akzeptor (rot) Fluorophoren markiert, um ein DNA-Molekül 8, 10, 16 und 18 Basenpaare voneinander entfernt. Bitte klicken Sie auf eine größere Version zu sehen Abbildung 6 , Abbildung 7 , Abbildung 8 oder Abbildung 9 .
Discussion
Obwohl die obige Protokoll wurde für uns ein besonderes System und für eine bestimmte Auswahl von Farbstoffen (TMR und ATTO647N) optimiert wurde, ist es keineswegs die einzige bewährte Methode. Vor kurzem wurde eine alternative Sauerstoffbindung System, bestehend aus Protocatechusäure (PCA) / Protocatechuat-3 ,4-Dioxygenase (PCD) gezeigt, dass die Photostabilität bestimmter Farbstoffe 4 zu erhöhen. Ebenso können andere Triplett-Zustand Quencher wie β-Mercaptoethanol (BME) anstelle von Trolox verwendet werden, obwohl diese nicht unterdrücken können lang anhaltende Blinken einige Farbstoffe, insbesondere Cy5 5.
Obwohl Immobilisierung über Biotin-Streptavidin-biotinylierten Rinderserumalbumin (BSA) ist die bevorzugte Wahl für Nukleinsäuren Studien wird ein Polyethylenglykol (PEG)-beschichteten Oberfläche besser für Untersuchungen von Proteinen geeignet, da es unspezifische Adhäsion 1 verhindert. Darüber hinaus können sub-beugungsbegrenzten Größe Vesikel verwendet werden, um das Biomolekül des Interesses in den Fällen, wo es von Oberflächen-Wechselwirkungen 6 beeinflusst werden kann, zu verkapseln.
In diesem Artikel haben wir einem konfokalen Aufbau mit Silikon Avalanche-Photodioden ausgestattet, um die Fluoreszenz-Intensität Spuren erwerben verwendet. Dieses Protokoll funktioniert genauso gut mit Total Internal Reflection Fluorescence Mikroskope (TIRF) mit CCD-Kameras ausgestattet. Unabhängig von der Mikroskopie verwendet, sm-FRET können auf räumliche Auflösungen nähert sich dem Angström, wenn der Donor-und Akzeptor Signal korrekt 7 korrigiert werden informieren.
Acknowledgments
Wir danken Chandran Sabanayagam für seine Hilfe bei der Entwicklung des Systems, Joshua Edel für Beratung in der Gestaltung der Mikrofluidik-Gerät und das Personal an der Rowland Institute der Harvard University für die Bearbeitung von Teilen der Einrichtung. Wir erkennen an, nützliche Gespräche mit Mitgliedern der Meller Gruppe an der Rowland Institute und an der Boston University, und die Mitglieder der T. Ha 's-Gruppe am UIUC für hilfreiche Informationen. Schließlich schätzen wir die finanzielle Unterstützung von der National Science Foundation (PHY-0701207) und dem National Institute of Health (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
