Summary
Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.
Abstract
Fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET) microscopia tem sido amplamente utilizada para estudar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico, tais como ácidos nucléicos e proteínas. Única molécula FRET (sm-FRET) medições em moléculas imobilizadas permitir observações longo do sistema de forma eficaz até que ambos os corantes photobleach, resultando em tempo de traços que o relatório sobre a dinâmica biomolecular com uma ampla gama de escalas de tempo de milissegundos para minutos. Para facilitar a aquisição de grande número de vestígios de análises estatísticas, o processo deve ser automatizado e ao meio ambiente amostra deve ser rigidamente controlado sobre o tempo de medição inteira (~ 12 horas). Isso é feito usando um microscópio de varredura confocal automatizada que permite o interrogatório de milhares de moléculas individuais durante a noite, e uma célula microfluídicos que permite a troca de tampão controlada, com teor de oxigênio restrito e mantém uma temperatura constante durante todo o período de medição. Aqui nós mostramos como montar o dispositivo micro e como ativar a sua superfície para imobilização de DNA. Então nós explicamos como preparar um tampão para maximizar a fotoestabilidade e duração da fluoróforos. Finalmente, vamos mostrar os passos envolvidos na preparação da instalação para a aquisição automatizada de molécula tempo resolvido única FRET traços de moléculas de DNA.
Protocol
1 - Montagem da célula microfluídica
A célula microfluídica é feita por uma fusão padronizada, 2 mm de espessura, polidimetilsiloxano disco (PDMS) para uma cobertura de vidro de quartzo limpo de fresco. O disco contém quatro PDMS 30 mL câmaras retangulares que são acessados por entrada e saída flexíveis capilares conectados a um reservatório de tampão e uma bomba de seringa, respectivamente, para o fluxo controlado de buffer. A célula de fluxo é suportado em sua parte traseira por uma janela de vidro e colocado em um porta-celular feito sob medida contendo um elemento termoelétrico refrigerado a água para regular a temperatura.
- Para fazer o padrão PDMS disco, misturar 10 partes de base elastômero de silicone com um agente de cura parte, misture bem e deixe por 1 hora de desgaseificação a vácuo.
- Delicadamente despeje a mistura de elastômero para o molde de células microfluídicos. No nosso caso, este é um um wafer de silício ", com quatro faixas (1x10 1x10 4 x 3 x 300 mm) feita a partir de fotorresiste negativo. Deixe isso para a cura em uma placa quente a 70 ° C por duas horas.
- Retire cuidadosamente o disco PDMS curado do molde utilizando uma lâmina de barbear. Fundir o disco em uma janela de vidro 1''(contendo 8 x 2 mm de diâmetro pré-furos em ambas as extremidades dos canais) por plasma oxidante ambas as superfícies por 30 segundos. Fusível as janelas de vidro para o lado plano do disco PDMS (o lado que não contenham os canais).
- Inserir um tubo de 2 polegadas de sílica fundida longo e flexível capilar através do orifício de cada janela de vidro, até atingir o canal. Inserção de uma agulha e depois seguir com o capilar pode facilitar este processo. Os orifícios de vidro da janela usando um composto de fundição de cura rápida de silicone tais como Kwik-Cast.
- Enxágüe os canais com etanol e água, e plasma-ativar a célula em conjunto com um recém-limpos, lamínula de 1 polegada circular de quartzo por 30 segundos. Sugerimos a limpeza dessa lamínula usando piranha *. Fundir o lamínula para o lado da célula que contém os canais, de vedação das câmaras.
- Deixe o celular se reuniram para cura de noite à temperatura ambiente.
* Piranha é uma solução de H 2 O 2 e H 2 SO 4 em 1:2,5 proporções. Para limpar o lamínulas, mergulha-as na piranha a 90 ° C por 20 min.
2 - Ativação da superfície para imobilização molécula
Para estudos de ácido nucléico, o esquema mais simples imobilização de superfície consiste em primeiro revestimento de vidro ou de quartzo com lamínula biotinilado albumina bovina (BSA) e depois com estreptavidina. Isto permite que a amostra biotinilado a ser imobilizada com alta especificidade para os dias em temperatura ambiente.
- Conectar tubos flexíveis para os capilares para a injecção de buffer fácil usando uma seringa e agulha.
- Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de BSA biotinilado em tampão A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrado através de filtros 0,02 mm) para o canal e incubar por pelo menos 30 min.
- ML de tampão de fluxo 300-500 A para remover qualquer BSA livre biotinilado do canal, tomando cuidado para não prender as bolhas de ar no interior da câmara.
- Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de estreptavidina em tampão A e incubar por 15 min. Em seguida, repita a Etapa 3.
- Fluxo através de uma solução pM 05/03 da amostra biotinilado. Realizar um exame de superfície para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes. Se necessário, aumentar a concentração da amostra para obter uma melhor cobertura. Incubar por 10 min e repita o passo 3.
A célula microfluídica é montado em um palco motorizado xy permitindo movimento (até 25 mm) grossa usando codificada opticamente motores DC, e do movimento (1 nm) bem usando dois acionadores de circuito fechado piezo (Physik Instrumente modelo M-014 ou similar). Isto pode ser feito antes ou após a ativação da superfície para a imobilização da amostra.
3 - Preparar o tampão Imaging (IB)
O IB consiste de um sistema enzimático de limpeza de oxigênio e um supressor triplet, como Trolox. Uma vez que o IB é lavada através constantemente durante a noite, pelo menos, 10 ml deve ser preparado com antecedência.
- Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glicose, pelo menos 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl em água deionizada. A maior concentração de tampão é importante por duas razões: Trolox dissolvendo vai acidificar a solução, ea reação enzimática irá também diminuir o pH da solução ao longo do tempo. Uma vez que esta solução tem uma vida útil longa, pode ser armazenado como uma solução de reserva.
- Dissolver 5 mg de Trolox no buffer preparada na Etapa 1 em vortex por alguns minutos e, em seguida, balançando para> 10 min. Trolox não é muito solúvel em água em pH> 7, por isso não apressar esse passo. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mm e deixar de desgaseificação a vácuo por 10 minutos.
- Prepare a solução "gloxy" enzimática através da mistura de 60 mL water, 20 l de tampão 5X A, 20 l de catalase, uma glicose oxidase mg e 100 l de 10 mg / ml BSA. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 mM centrífuga.
- Misture delicadamente o buffer da Etapa 2 com a solução "gloxy" do Passo 3 evitando a formação de bolhas de ar.
- O fluxo IB através do canal a uma taxa constante de 5 mL / min usando uma bomba de seringa mecânicas para controlar a vazão. Bolha de gás argônio para o reservatório IB para evitar que o oxigênio atmosférico de re-dissolvendo-se no buffer.
A varredura de superfície, localização molécula e aquisição de traços de intensidade única molécula é controlado por um programa LabView que permite a coleta de dados automatizada 1. O programa verifica 20x20 M 2 áreas em 0,2 mM resolução, com uma taxa de 0,1 mícron / ms. Os dados são processados imediatamente para produzir intensidade ponderadas localizações de todos os pixels acima da contagem de fundo. Uma vez que as moléculas imobilizadas são encontrados, eles são movidos um por um para o volume confocal e as intensidades do doador e receptor fluoróforo são registrados como uma função do tempo até que ambos photobleach fluoróforos. O estágio é então programado para mover para uma nova origem 100 mm de distância, e o processo de digitalização é repetido.
4 - Resultados Representante
Abaixo estão algumas imagens que mostram a célula montada microfluídicos antes da ativação da superfície e depois de ser montado no microscópio pronto para imobilização molécula. Se o canal é ativado com sucesso, verifica a superfície deve ser semelhante ao ilustrado abaixo scans mostrando de emissão do doador de corante (verde) e receptor (vermelho) após a excitação do doador direto. Estas moléculas são movidos um por um para o volume de sondagem ea fluorescência é registrado ao longo do tempo até que ambos photobleach corantes, como mostrado nos traços única molécula. A partir de vestígios como estes pode-se obter a eficiência FRET que informa sobre a separação dos doadores aceitador-instantânea, que por sua vez é usado para explorar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico.
Figura 1: Célula microfluídica com quatro canais, cada um com entrada / saída capilares. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
Figura 2: Célula montado no microscópio pronto para medições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.
Figura 3: Configuração para sm-FRET medições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 3.
Figuras 4 e 5: canal vermelho e verde de um exame de superfície de imobilizado FRET moléculas animado com laser verde. Clique para ver uma versão maior da figura 4 , ou a figura 5 .
Figuras 6, 7, 8 e 9: trajetórias Intensidade do doador (verde) e receptor (vermelho) fluoróforos rotulados a uma molécula de DNA 8, 10, 16 e 18 pares de bases de distância. Clique para ver uma versão maior da figura 6 , figura 7 , figura 8 , ou a figura 9 .
Discussion
Embora o protocolo acima foi optimizado para o nosso sistema em particular e para uma escolha específica de corantes (TMR e ATTO647N), é de modo algum o único método provado. Recentemente, um sistema de oxigênio alternativa limpeza composto de ácido protocatecuico (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxigenase (PCD) foi mostrado para aumentar a fotoestabilidade de determinados corantes 4. Da mesma forma, outros triplet estado quenchers tais como β-mercaptoetanol (BME) pode ser usado em vez de Trolox, embora estes não podem suprimir de longa duração piscar de alguns corantes, em particular Cy5 5.
Apesar de imobilização via biotina-estreptavidina-biotina albumina bovina (BSA) é a escolha preferida para estudos ácidos nucléicos, um polietileno glicol (PEG) com revestimento de superfície é mais adequado para estudos de proteínas, uma vez que impede não-específica de adesão 1. Além disso, sub-difração limitada vesículas tamanho pode ser usado para encapsular a biomolécula de interesse nos casos em que pode ser afetada por interações de superfície 6.
Neste artigo nós usamos uma configuração confocal equipado com fotodiodos avalanche de silicone para adquirir os traços intensidade de fluorescência. Este protocolo funciona igualmente bem com a Total microscópios reflexão interna de fluorescência (TIRF) equipados com câmeras CCD. Independentemente da microscopia utilizadas, sm-FRET pode informar sobre resoluções espaciais aproximando do angstrom, quando o doador eo receptor de sinal estão devidamente corrigido 7.
Acknowledgments
Agradecemos a Chandran Sabanayagam por sua ajuda no desenvolvimento do sistema, Joshua Edel para aconselhamento sobre a concepção do dispositivo micro e os funcionários do Instituto Rowland na Universidade de Harvard para usinagem de peças da instalação. Reconhecemos discussões úteis com os membros do grupo Meller no Instituto Rowland e na Universidade de Boston, e os membros do grupo T. Ha 's em UIUC para informações úteis. Finalmente, agradecemos o apoio financeiro da National Science Foundation (PHY-0701207) e do Instituto Nacional de Saúde (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
