Summary
Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.
Abstract
Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) mikroskobu yaygın nükleik asitler ve proteinler gibi biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği incelemek için kullanılır olmuştur. (Sm-FRET) immobilize molekülleri ölçümleri tek bir molekül FRET uzun gözlemler izin sisteminin etkin bir şekilde hem boyalar zaman izleri photobleach sonuçlanan kadar milisaniyeden zaman ölçekleri dakikaya kadar geniş bir yelpazede ile biyomoleküler dinamikleri üzerinde rapor. Istatistiksel analizler için izleri çok sayıda satın alma kolaylaştırmak için, süreci otomatik olmalıdır ve örnek ortamında tüm ölçüm süresi (~ 12 saat) üzerinden sıkıca kontrol edilmelidir. Bu sorgulama gecede binlerce tek moleküllerin sağlayan bir otomatik tarama konfokal mikroskop ve sınırlı oksijen içeriği ile tampon kontrollü döviz izin verir ve tüm ölçüm süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korur mikroakışkan hücre kullanılarak yapılır. Burada mikroakışkan cihaz monte etmek için nasıl ve DNA immobilizasyon için yüzey aktif hale getirmek için nasıl göstermektedir. Sonra biz bir tampon fluorophores fotostabilite ve ömrünü en üst düzeye çıkarmak için nasıl hazırlanacağını açıklar. Son olarak, zamana bağımlı tek bir molekülün otomatik edinimi için kurulum hazırlanmasında yer alan adımları DNA moleküllerinin izlerini FRET göstermektedir.
Protocol
1 - mikroakışkan hücre Montaj
Mikroakışkan hücre eritme tarafından yapılan bir desenli, taze temizlenmiş kuvars kapak kayma için 2 mm kalınlığında, polidimetilsiloksan (PDMS) disk. PDMS disk tampon kontrollü akışı için, sırasıyla, bir tampon rezervuar ve bir enjektör pompası bağlı giriş ve çıkış esnek kılcal damarlar tarafından erişilen dört 30 ul dikdörtgen odaları içerir. Akış hücresi arka tarafında bir cam pencere tarafından desteklenen ve ısısını düzenlemek için su soğutmalı bir termoelektrik unsuru içeren bir ölçüye göre hücre sahibi üzerine yerleştirilir.
- Desenli PDMS diski yapmak için, 1 kısım sertleştirici ile 10 parça silikon elastomer baz karışımı, iyice karıştırın ve 1 saat vakum gaz alma terk.
- Mikroakışkan hücre kalıp üzerine elastomer karışımı yavaşça dökün. Bizim durumumuzda, bu negatif fotorezist yapılan dört şeritler (1x10 4 x 1x10 3 x 300 mm) 1 "silikon gofret 70 sıcak bir plaka üzerinde tedavisi için bırakın ° C iki saat boyunca.
- Bir jilet kullanarak kalıp tedavi PDMS disk dikkatlice soyulur. 30 saniye boyunca iki yüzeyine oksitleyici plazma 1''cam pencere (kanalların her iki uçta da 8 x 2 mm çaplı ön delikler içeren) üzerine disk Sigorta. Sigorta PDMS disk düz yüzüne cam pencereler (kanalları içermeyen tarafı).
- 2-inç uzunluğunda esnek erimiş silika kapiler boru kanal ulaşıncaya kadar her bir cam pencere delikten takın. Ilk önce bir iğne takma ve sonra aşağıdaki ile kılcal bu süreci kolaylaştırabilir. Kwik-Cast gibi hızlı bir kür silikon döküm bileşik kullanarak cam pencere delikleri Seal.
- Etanol ve su ile durulayın kanallar, ve 30 saniye süreyle taze temizlenmiş, 1-inç dairesel kuvars kapak kayma ile birlikte hücre plazma etkinleştirin. Biz piranha kullanarak bu kapağın kayma temizlik öneririz *. Odaları, sızdırmazlık kanalları içeren hücre yan kapak kayma Sigorta.
- Oda sıcaklığında gece boyunca tedavi etmek için birleştirilmiş hücre bırakın.
* Piranha H 2 O 2 ve H 2 SO 4 1:2.5 oranlarda bir çözümdür. Kapak fişleri temizlemek için, 90 piranha onları batırmayın ° C, 20 dk.
2 molekül immobilizasyon için yüzey aktif hale getirme
Nükleik asit çalışmalar için, en basit yüzey immobilizasyon şeması ilk kaplama cam veya biotinlenmiş sığır serum albumin ve (BSA) sonra streptavidin kuvars kapak kayma oluşur. Bu biotinlenmiş örnek, gün boyunca oda sıcaklığında yüksek özgüllük ile immobilize olanak sağlar.
- Esnek borular kolay tampon enjeksiyon için bir şırınga ve iğne kullanılarak kılcal bağlayın.
- 0.1 mg / ml tampon biotinlenmiş BSA bir çözüm enjekte A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.02 mikron filtre kullanarak filtre) kanal ve en az 30 dakika süreyle inkübe.
- Akış 300-500 ul tampon bir odanın içinde herhangi bir hava kabarcığı yakalamak için dikkatli olmak, kanalın herhangi bir ücretsiz biotinlenmiş BSA kaldırmak için.
- 0.1 bir çözüm enjekte streptavidin buffer mg / ml ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra Adım 3 tekrarlayın.
- 3-5 pM biotinlenmiş örnek bir çözüm akmaya. Floresan moleküllerin kapsama kontrol etmek için bir yüzey taraması yapın. Gerekirse, daha iyi kapsama alanı elde etmek için numune konsantrasyonu artırır. 10 dakika boyunca inkübe ve Adım 3 tekrarlayın.
Mikroakışkan hücre optik olarak kodlanmış DC motorları kullanılarak kaba (25 mm) hareket sağlayan bir motorlu xy sahne üzerine monte edilmiş ve iki kapalı döngü piezo aktüatörler kullanılarak ince (1 nm) hareket (Physik Instrumente modeli M-014 veya benzeri). Bu, önce ya da örnek immobilizasyon için yüzey aktive sonra yapılabilir.
3 - Görüntüleme Buffer (IB) hazırlanması
IB gibi Trolox gibi bir enzimatik oksijen süpürücü sistemi ve bir üçlü söndürücü oluşur. IB sürekli bir gecede kızarmış olduğundan, en az 10 ml önceden hazırlanmış olmalıdır.
- 10 ml% 0.8 w / v D-glukoz, en az 35 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 50 mM NaCl deiyonize su hazırlayın. Tampon yüksek konsantrasyonda iki nedenden ötürü önemlidir: Trolox çözme çözüm asitlenir ve enzimatik reaksiyon da zaman içinde çözüm pH değerini düşürecektir. Bu çözüm, uzun bir raf ömrüne sahiptir bu yana bir stok solüsyonu olarak saklanabilir.
- Adım 1 birkaç dakika karıştırın ve daha sonra> 10 dakika için sallayarak tarafından hazırlanan tampon Trolox 5 mg eritin. Trolox pH> 7 suda çok çözünür değildir, bu nedenle bu adımı acele etmiyoruz. Filtre 0.2 mikron filtre ve 10 dakika boyunca vakum gaz alma terk kullanarak çözüm.
- 60 ul Wate karıştırma "gloxy" enzimatik çözüm hazırlayınr, 5X tampon, katalaz 20 ul, 1 mg glukoz oksidaz ve 10 ul 100 mg / ml BSA 20 ul. 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak çözüm Filtre.
- Adım 2 Adım 3 hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek "gloxy" çözümü ile tampon yavaşça karıştırınız.
- 5 ul / dak akış hızı kontrol etmek için mekanik bir şırınga pompası kullanarak sabit bir oranda kanalı ile IB Akış. Tampona yeniden çözünmesi atmosferik oksijenin önlemek için IB rezervuar içine Bubble argon gazı.
Yüzey tarama, tek bir molekül yoğunluğu izleri molekül yerelleştirme ve satın alma, otomatik veri toplama 1 izin veren bir LabView programı tarafından kontrol edilir . Program, 0.1 mm / ms oranı ile 0.2 mikron çözünürlüğü 20x20 mikron 2 alanları tarar. Veri yoğunluğu ağırlıklı yerlerde arka plan sayıları her şeyden piksel verim hemen işlenir. Immobilize molekülleri bulundu sonra, konfokal hacmi ve donör ve alıcı fluorofor şiddetleri içine tek tek, hem de fluorophores photobleach kadar zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir taşınır. Sahne daha sonra 100 mikron uzaklıkta yeni bir kökeni geçmek için programlanmış ve tarama işlemi tekrarlanır.
4 - Temsilci Sonuçlar
Aşağıda yüzey aktivasyonu öncesi ve molekül immobilizasyon için hazır mikroskop üzerine monte sonra monte mikroakışkan hücre gösteren bazı görüntülerin. Kanal başarıyla aktifse, yüzey taramaları doğrudan bağış uyarma sonra donör boya (yeşil) ve alıcı (kırmızı) gösteren emisyon aşağıda tasvir taramaları benzer olmalıdır. Bu moleküller tek tek problama hacmi içine taşınır ve floresan hem boyalar photobleach kadar zaman içinde kaydedilir, tek bir molekülün izleri görüldüğü gibi. Bu gibi izlerini, biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği keşfetmek için kullanılan anlık donör-alıcı ayırma hakkında bilgi FRET verimliliği elde edebilirsiniz.
Şekil 1: Dört kanal ile mikroakışkan hücre, her giriş / çıkış kılcal damarlar ile. Lütfen Şekil 1'de bir büyük halini görmek için buraya tıklayınız .
Şekil 2: Hücre ölçümler için hazır mikroskop üzerine monte. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3: sm-FRET ölçümler için Kurulum. Lütfen Şekil 3 büyük halini görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4 ve 5: Kırmızı ve yeşil kanal hareketsiz bir yüzey taraması yeşil lazer ile heyecan molekülleri FRET. Daha büyük bir sürümünü görmek için tıklayınız Şekil 4 , Şekil 5 .
Şekil 6, 7, 8 ve 9: Yoğunluk yörüngeleri donör (yeşil) ve bir DNA molekülünün 8, 10, 16 ve 18 basepairs ayrı etiketli alıcı (kırmızı) fluorophores. Daha büyük halini görmek için tıklayınız Şekil 6 , Şekil 7 , Şekil 8 , Şekil 9 .
Discussion
Yukarıdaki protokol ve boyalar (TMR ve ATTO647N) belirli bir seçim sistemi için optimize edilmiş olmasına rağmen, sadece ispat yöntemi anlamına gelir. Son zamanlarda, protocatechuic asit (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PSD) oluşan alternatif bir oksijen temizleyici sistem belirli boyalar 4 fotostabilite artırdığı gösterilmiştir. Aynı şekilde, bu, özellikle Cy5 5, bazı boyaların uzun süreli yanıp sönen bastırmak olmasa da, β-mercaptoethanol (BME) gibi diğer üçlü-devlet quenchers yerine Trolox olabilir.
(BSA), biotin streptavidin biotinlenmiş sığır serum albümini ile immobilizasyon nükleik asitlerin çalışmalar için tercih ediliyor olsa da, non-spesifik yapışma 1 önler, polietilen glikol (PEG) kaplı yüzey proteinlerin çalışmalar için daha uygundur. Ayrıca, alt-kırınım sınırlı boyutu veziküller yüzey etkileşimleri 6 etkilenebilir durumda faiz biyomolekülün kapsülleyen kullanılabilir.
Bu yazıda, floresan izlerini elde etmek için silikon çığ fotodiyotlar ile donatılmış bir konfokal kurulum kullandık. Bu protokol, CCD kamera ile donatılmıştır Toplam İç Yansıma Floresan mikroskoplar (TIRF) ile eşit derecede iyi çalışır. Mikroskopi ne olursa olsun, donör ve alıcı sinyali düzgün 7 düzeltilir angström yaklaşan mekansal çözünürlüklerde bilgilendirmek sm- FRET.
Acknowledgments
Chandran Sabanayagam sistemi, Joshua mikroakışkan cihaz tasarımı ile ilgili öneri ve kurulum işleme parçaları için Harvard Üniversitesi Rowland Enstitüsü personel Edel gelişmekte olan yardımlarından dolayı teşekkür ederiz. UIUC faydalı bilgiler için yararlı Rowland Enstitüsü ve Boston Üniversitesi'nde Meller grup, üyeleri ile tartışmalar, T. Ha 'grubu üyeleri ve kabul etmiş sayılırsınız. Son olarak, Ulusal Bilim Vakfı (FİZ-0.701.207) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM075893) mali destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
