Summary
I denna artikel beskriver vi hur vi får FRET spår av enskilda DNA-molekyler immobiliserade på en yta med hjälp av en automatiserad scanning konfokalmikroskop.
Abstract
Fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) har mikroskopi i stor utsträckning använts för att studera struktur och dynamik molekyler av biologiskt intresse, såsom nukleinsyror och proteiner. Enda molekyl FRET (SM-FRET) mätningar på immobiliserade molekylerna tillåter långa observationer av systemets sätt tills båda färgämnen photobleach-resulterar i tid-spår som rapport om biomolekylär dynamik med ett brett spektrum av tidsskalor från millisekunder till minuter. För att underlätta förvärv av ett stort antal spår för statistiska analyser, måste processen automatiserad och provet miljön bör hårt styrda över hela mättiden (~ 12 timmar). Detta sker med hjälp av en automatiserad scanning konfokalmikroskop som gör att förhören med tusentals enstaka molekyler över natten, och en mikroflödessystem cell som tillåter kontrollerad utbyte av buffert, med begränsad syrehalt och håller en konstant temperatur under hela mätperioden. Här visar vi hur man monterar mikroflödessystem enheten och hur man aktiverar sin yta för DNA immobilisering. Sedan förklarar vi hur du förbereder en buffert för att maximera fotostabilitet och livslängd fluoroforer. Slutligen visar vi de steg som ingår i förberedelserna inställningarna för automatisk förvärv av tidsupplöst enda molekyl FRET spår av DNA-molekyler.
Protocol
1 - Montera mikroflödessystem cellen
Den mikroflödessystem cellen görs genom att smälta en mönstrad, 2 mm tjocka, Polydimetylsiloxan (PDMS) hårddisken till en nyligen rengjord kvarts täckglas. De PDMS disken innehåller fyra 30 l rektangulära kammare som nås av in-och utlopp flexibla kapillärer ansluten till en buffert reservoar och en sprutpump, respektive för kontrollerat flöde av buffert. Flödet cellen stöds på baksidan av en glasruta och placeras på en skräddarsydd cell hållare som innehåller en vattenkyld termoelektrisk inslag för att reglera temperaturen.
- För att göra det mönstrade PDMS disken, blanda 10 delar bas silikon elastomer med 1 del härdare, blanda väl och låt avgasning i 1 timme i vakuum.
- Häll försiktigt i elastomer blandningen på mikroflödessystem cellen mögel. I vårt fall är detta en 1 "kiselskiva med fyra remsor (1x10 4 x 1x10 3 x 300 mikrometer) gjorda av negativ fotoresist. Låt detta att bota på en värmeplatta vid 70 ° C i två timmar.
- Skala försiktigt botas PDMS disken ur formen med hjälp av ett rakblad. Säkring disken på en 1''glasfönster (med 8 x 2 mm diameter förborrade hål i båda ändarna av de kanaler) med plasma-oxiderande båda ytorna i 30 sekunder. Säkring av glasrutor på den flata sidan av PDMS disken (den sida som inte innehåller kanaler).
- Sätt i en 2-tums lång flexibel kvarts kapillär slangar genom varje glasfönster är hålet tills den når kanalen. Sätta in en nål först och sedan efter med kapillär kan underlätta denna process. Täta hålen glasfönster med ett snabbhärdande förening silikon gjutning såsom Kwik-Cast.
- Skölj kanaler med etanol och vatten, och plasma-aktivera cellen tillsammans med en nyligen rengjord, 1-tums runda kvarts täcka slip i 30 sekunder. Vi föreslår att du rengör locket glida med piraya *. Säkring locket glida åt sidan av cellen som innehåller de kanaler, tätning kamrarna.
- Lämna de församlade cellen att bota över natten i rumstemperatur.
* Piranha är en lösning av H 2 O 2 och H 2 SO 4 i 1:2,5 proportioner. För att rengöra täckglas, sänk dem i piraya vid 90 ° C i 20 minuter.
2 - Aktivera yta för molekylen immobilisering
För nukleinsyra studier består den enklaste ytan immobilisering system av första beläggning ett glas eller kvarts täckglas med biotinylerad bovint serumalbumin (BSA) och därefter med streptavidin. Detta gör att biotinylerad prov som ska immobiliserade med hög specificitet för dagar i rumstemperatur.
- Anslut slangar till kapillärerna för enkel buffert injektion med en spruta och kanyl.
- Injicera en lösning av 0,1 mg / ml biotinylerad BSA i buffert A (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtreras med hjälp av 0,02 ìm filter) i kanalen och inkubera i minst 30 min.
- Flöde 300-500 l av buffert A för att ta bort fria biotinylerad BSA från kanalen, försiktigt så att inte fälla några luftbubblor inne i kammaren.
- Injicera en lösning av 0,1 mg / ml streptavidin i buffert A och inkubera i 15 min. Upprepa sedan steg 3.
- Flöde genom en 3-5 pM lösning av biotinylerad provet. Utför en yta skanning för att kontrollera täckningen av fluorescerande molekyler. Om det behövs, öka urvalet koncentration för att få bättre täckning. Inkubera i 10 min och upprepa steg 3.
Den mikroflödessystem cellen är monterad på en motordriven xy-stadium så grova (upp till 25 mm) rörelse med hjälp av optiskt kodade likströmsmotorer, och fina (1 nm) rörelse med hjälp av två slutna piezo-aktuatorer (Physik Instrumente modell M-014 eller liknande). Detta kan göras antingen före eller efter aktivering av ytan för prov immobilisering.
3 - Förbereda Imaging Buffer (IB)
IB består av en enzymatisk syre spolningssystem och en triplett törstsläckare, som Trolox. Eftersom IB spolas genom ständigt över natten, bör minst 10 ml beredas i förväg.
- Förbered 10 ml 0,8% w / v D-glukos, minst 35 mM Tris-HCl pH 8,0 och 50 mM NaCl i avjoniserat vatten. Ju högre koncentration av buffert är viktig av två skäl: upplösa Trolox kommer att försura lösningen och den enzymatiska reaktionen kommer också att sänka pH i lösningen över tiden. Eftersom denna lösning har en lång hållbarhet det kan lagras som en stamlösning.
- Lös upp 5 mg av Trolox i bufferten bereddes i steg 1 genom att vortexa i ett par minuter och sedan skaka på> 10 min. Trolox är inte särskilt lösligt i vatten vid pH> 7, så stressa inte detta steg. Filtrera lösningen med en 0,2 ìm filter och lämna avgasning i vakuum i 10 minuter.
- Förbered "gloxy" enzymatisk lösning genom att blanda 60 l Water, 20 l 5X buffert A, 20 l katalas, 1 mg glukos oxidas och 100 l 10 mg / ml BSA. Filtrera lösningen med en 0,22-filter ìm centrifugen.
- Blanda försiktigt bufferten från steg 2 med "gloxy"-lösning från steg 3 att undvika bildandet av luftbubblor.
- Flöde IB genom kanalen med en konstant hastighet av 5 ml / min med en mekanisk sprutpump för att styra flödet. Bubble argongas i IB-reservoaren för att förhindra att luftens syre från att åter upplösas i bufferten.
Ytan skanning, molekyl lokalisering och förvärv av enstaka spår molekyl intensitet styrs av ett LabView-program som möjliggör automatisk datainsamling 1. Programmet skannar 20x20 ìm 2 områden på 0,2 ìm upplösning, med en hastighet av 0,1 ìm / ms. Data omedelbart behandlas för att ge intensitet-viktade platser för alla pixlar över bakgrunden räknas. När immobiliserade molekylerna finns, flyttas de en efter en in i konfokala volymen och intensiteten hos donator och acceptor fluoroforen redovisas som en funktion av tiden tills båda fluoroforer photobleach. Scenen är då programmerad att flytta till ett nytt ursprung 100 ìm bort och scanning processen upprepas.
4 - representativa resultat
Nedan finns några bilder som visar den samlade mikroflödessystem cell innan ytan aktivering och efter att ha monterat på mikroskopet redo för molekyl immobilisering. Om kanalen är aktiverad framgångsrikt bör ytan söker likna skannar avbildas nedan som visar utsläpp av givaren färg (grön) och acceptor (röd) efter direkta givare excitation. Dessa molekyler flyttas en efter en in i sondera volym och fluorescens registreras över tid tills båda färgämnen photobleach, som visas i den enda molekyl spår. Ur spår som dessa kan man få FRET effektivitet som informerar om den momentana donator-acceptant separation, vilket i sin tur används för att undersöka strukturen och dynamiken hos molekyler av biologiskt intresse.
Figur 1: Mikroflödessystem cell med fyra kanaler med vardera inlopp / utlopp kapillärer. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Figur 2: Cell monterad på mikroskopet redo för mätningar. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 2.
Figur 3: Inställning för SM-FRET mätningar. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 3.
Figurerna 4 och 5: Röda och gröna kanalen i en ytkontroll av immobiliserade FRET molekyler glada med grön laser. Klicka för att se en större version av figur 4 , eller figur 5 .
Figur 6, 7, 8 och 9: Intensitet banor av givare (grön) och acceptor (röd) fluoroforer märkt att en DNA-molekyl 8, 10, 16 och 18 baspar isär. Klicka för att se en större version av figur 6 , 7 figur , figur 8 eller figur 9 .
Discussion
Även om ovanstående protokoll har optimerats för vår speciella system och för ett visst val av färger (TMR och ATTO647N) är det ingalunda den enda bevisade metoden. Nyligen var ett alternativ syre spolningssystem bestående av protocatechuic syra (PCA) / protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) visat sig öka fotostabilitet av vissa färgämnen 4. Likaså kan andra triplett-statliga quenchers såsom β-merkaptoetanol (BME) användas i stället för Trolox, även om dessa kanske inte undertrycka långvariga blinkande några färgämnen, särskilt Cy5 5.
Även immobilisering via biotin-streptavidin-biotinylerad bovint serumalbumin (BSA) är det självklara valet för nukleinsyror studier är en polyetylenglykol (PEG)-belagda ytan bättre lämpad för studier av proteiner eftersom det hindrar icke-specifik vidhäftning 1. Dessutom kan sub-diffraktion-begränsad storlek blåsor användas för att kapsla in den biomolekylen av intresse i de fall det kan påverkas av ytinteraktioner 6.
I denna artikel har vi använt en konfokala installation utrustad med silikon lavin fotodioder att förvärva fluorescensintensiteten spår. Detta protokoll fungerar lika bra med en total inre mikroskop Reflektion fluorescens (TIRF) utrustade med CCD-kameror. Oavsett mikroskopi används, SM-FRET kan informera om fysisk resolutioner närmar Ångström när givaren och acceptanten signalen är korrekt korrigeras 7.
Acknowledgments
Vi tackar Chandran Sabanayagam för hans hjälp med att utveckla systemet, Joshua Edel för råd om utformningen av mikroflödessystem enheten och personalen på Rowland institutet vid Harvard University för bearbetning delar av installationen. Vi erkänner nyttiga diskussioner med medlemmar av Meller grupp på Rowland institutet och vid Boston University, och medlemmar av T. Ha 's grupp vid UIUC för nyttig information. Slutligen, vi uppskattar det ekonomiska stöd från National Science Foundation (PHY-0.701.207) och National Institute of Health (GM075893).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fused silica capillary tubing | Polymicro Technologies | TSP150375 | |
| Fused silica cover slip | Esco Products | R425000 | |
| Tubing | Diba Industries | ||
| Biotinylated BSA | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9085 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 0021122 | |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | 3097366-1004 | Silicone Elastomer Kit |
| Trolox | Aldrich | 238813 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C3155 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Kwik-Cast Sealant | World Precision Instruments, Inc. | Kwik-Cast | Silicone Casting Compound |
References
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual. CSHL Press. , (2008).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis. Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).
- Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer. J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).
- Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).
- Di Fiori, N., Meller, A. Article in preparation. , Forthcoming.
