Summary
Un protocolo detallado se describe para la formación de imágenes en tiempo real de los complejos de reparación del ADN en
Abstract
Tanto en procariotas y eucariotas responden al daño del ADN a través de una compleja serie de cambios fisiológicos. Alteraciones en la expresión génica, la redistribución de las proteínas existentes, y el montaje de nuevos complejos de proteínas puede ser estimulada por una variedad de lesiones en el ADN y no coincidentes de pares de bases del ADN. Microscopía de fluorescencia se ha utilizado como una poderosa herramienta experimental para la visualización y cuantificación de estas y otras respuestas a las lesiones del ADN y para supervisar el estado de replicación del ADN dentro de la compleja estructura subcelular de una célula viva. Fusiones traduccionales entre las proteínas fluorescentes reportero y los componentes de la replicación del ADN y la maquinaria de reparación se han utilizado para determinar las señales que se dirigen a proteínas de reparación del ADN de sus lesiones afines
Protocol
Cultivos en crecimiento de las células para la microscopía
1. Uno o dos días antes de la imagen, preparar el B. subtilis cepa que contiene la proteína de fusión de traducción que desea visualizar. Rondas de prueba de los pasos 1A y 1B será necesario determinar qué condiciones de crecimiento ofrece las mejores imágenes de la cepa. En la mayoría de los casos, las células deben ser fotografiado durante la fase de crecimiento exponencial.
- Para algunos B. cepas subtilis (en particular cepas, que crecen muy poco debido a la integración de la fusión traduccional entre el gen de interés y las buenas prácticas agrarias en su locus endógeno), el crecimiento inicial de dos días antes de la imagen es necesaria para imágenes de alta calidad. En el primer día, la racha de B. subtilis cepa a ser reflejado en agar LB con antibiótico de selección (s) e incubar durante la noche a 30 ° C. En el segundo día, inocular 100 l de solución salina 0,85% con una sola colonia y realizar tres diluciones seriadas de 10 veces en placas de agar LB (con antibióticos selectivos), revestimiento de 100 l de cada dilución, seguido de incubación durante la noche a 30 ° C. En el tercer día, seleccione la placa de la dilución con el crecimiento de la luz confluente de células. Crecimiento de la luz confluentes en un plato proporcionará el medio de cultivo con un inóculo de salud, crecimiento exponencial de arranque para producir potencialmente excelentes resultados de imagen (ver paso 4). Este paso es especialmente útil para las imágenes de una calidad más alta de membrana con la mancha FM4-64.
- Otros B. subtilis cepas sólo se puede aplicar a un medio selectivo agar LB por las colonias solo con un palillo estéril el día anterior a la imagen y se incuban durante la noche a 30 ° C. Al día siguiente, las celdas de esta placa será suficiente para su uso como inóculo para la imagen (ver paso 4).
NOTA: Para B. subtilis, cultivos de una noche en medio líquido no son apropiados debido a una combinación de la formación de esporas y las respuestas de quórum, lo que provocará un período prolongado de crecimiento de retraso de fase 1.
2. En la mañana de la imagen, introducir 10 ml de medio de S7 50 3.1 en un matraz Erlenmeyer de 125 mL estéril.
3. Resuspender las células en un máximo de 2 ml de medio de S7 50 de la placa de agar LB con colonias aisladas o las células confluentes luz para obtener un inóculo.
4. Añade suficiente S7 50 medio de las células del inóculo sobre el erlenmeyer que contiene 10 ml S7 50 por medio de una cultura con una densidad inicial óptica medida a 600 nm (OD 600) de ~ 0,08 a 0,1. En este paso es importante tener por lo menos un aire de 10 veces al cociente medio. Por lo tanto, se utiliza 10 a 12,5 ml de medio inoculado en un matraz Erlenmeyer de 125 ml.
5. Crecer cada cultivo a 30 ° C hasta que el cultivo llegue a un OD 600 ~ 0.5-0.8. Agitando los baños de agua son preferibles las revoluciones por minuto, 150 a 200. Culturas desafió con agentes inductores de dañar el ADN o la discrepancia se debe a una fase de crecimiento exponencial a principios OD 600 de tal manera que las células alcanzará la meta de 600 OD con el nuevo período de crecimiento que se requiere para el tratamiento (ver Tabla 1)
Por ejemplo, 2-aminopurine requiere una hora de tratamiento, y por lo tanto un cultivo tratado con 2-aminopurine debe estar en OD 600 ~ 0.3-0.4, de tal manera que una hora de tratamiento / los resultados de crecimiento en un 600 OD ~ 0.5-0.8, el cual las células están listas para la imagen.
Preparación de la muestra
1. Pipetear 300 l de células cultivadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Si las imágenes de las membranas celulares se desea, añadir la dilución 1:1000 de FM4-64 membrana mancha (Invitrogen) para cada muestra de una solución madre de 1 mg / ml. Una valoración de FM4-64 puede ser necesaria para lograr la señal de fluorescencia deseada. Una gama de titulación típica es de 1:100, 1:1000 y 1:10.000.
3. Permitir que las muestras permanezcan a temperatura ambiente hasta por diez minutos, mientras que la diapositiva se está preparando con agarosa al 1% en 1X medio Spizizens como se describe a continuación (ver paso 1 de "preparación de diapositivas").
4. Si la concentración de las células es necesario, preferimos las células de filtrado mediante un filtro de 0,2 micras, con un aparato de vacío. Las células se pueden lavar con suavidad de la superficie del filtro con PBS, otro tampón apropiado o medio antes de su visualización.
Preparación de diapositivas
1. Preparar agarosa al 1% con 1X Spizizens.
Añadir 5 ml de caldo de Spizizens 10 veces a 45 ml ddH2O junto con 0,5 g de agarosa y microondas para derretir. Agarosa fundida en caliente es difícil de pipeta, y se solidificó de agarosa no entrará en la punta de la pipeta. La agarosa deben equilibrarse en un baño de agua a una temperatura de ~ 55-65 ° C, para entrar en la punta de la pipeta sin solidificar dentro de la punta.
2. Sacar 20 l de Spizizens con el 1% de agarosa derretida en la punta de la pipeta. Pipeta una gota (aproximadamente 2.1 l) de la solución de agarosa en cada diapositiva y (nosotros usamos 15 y diapositivas, ver Tabla 2) de forma superficial las almohadillas de agarosa. La agarosa se solidifica inmediatamente. Diapositivas también se debe realizar inmediatamente antes de la aplicación de las células. Si las pastillas de agarosa se dejan a temperatura ambiente único, que puede deshidratar en cuestión de minutos y se pueden utilizar.
Pastillas de agarosa debe estar centrado y llene cada uno bien, pero tienen una altura mínima para evitar interrumpir el cubreobjetos, y si las gotas son demasiado altos (tipo burbuja) o si la muestra se extienda más allá del límite, así, simplemente pase el limpia bien con un Kimwipe y aplicar una nueva plataforma de agarosa.
3. Aplicar la totalidad de los 300 l de la muestra (ver paso 6) a la diapositiva, distribuidos en la parte superior de cada pad de agarosa. Esta cantidad de células debería ser suficiente para cubrir cada uno y en la diapositiva.
4. Permitir la diapositiva cargado con células reposar a temperatura ambiente (23 ° C) durante aproximadamente diez minutos. Este paso permitirá que las células se depositan en la plataforma de agarosa ser inmóvil y listo para su imagen. Para necesidades especiales, esta temperatura puede ser necesario cambiar, por ejemplo, cuando se realizan experimentos que requieren un cambio de temperatura 4.
5. Aspirar el medio de distancia en exceso de cada pozo sin necesidad de retirar las pastillas de sí mismos.
6. Aplicar el cubreobjetos a la diapositiva, presionando con firmeza y de manera uniforme, pero con cuidado, a través del área de la diapositiva. Asegúrese de que la hoja de la cubierta está en contra de la diapositiva y que la hoja de la cubierta no se eleva por encima de la diapositiva.
La visualización de las células
1. Muchos microscopios de fluorescencia diferentes va a funcionar bien. Es fundamental contar con una lente de aceite de inmersión 100X. El Laboratorio de Simmons utiliza:
- Olympus BX61 microscopio equipado con lentes de 1,45 NA TIRFM petróleo objetivo de inmersión 100X
- Hamamatsu ORCAR 2 CCD refrigerado por cámara
- Lumen 200 de arco de metal (antes) la fuente de luz.
- Para la detección de buenas prácticas agrarias (FITC), la excitación y la emisión de filtro 460-500 510-560
- Para la detección de FM4-64 (TRITC), la excitación y la emisión de filtro 510-560 572-648.
- Las imágenes fueron capturadas utilizando SlideBook 4,2 (Figura 1)
2. Traiga las células en el foco con luz blanca.
3. Capturar la imagen con los filtros adecuados para cada fluoróforo.
Resultados representante
Imágenes representativas se muestran (Figura 1). GFP focos deben estar bien definidos, mientras que FM4-64 tinción debe ser brillante y claro 4-7. Imágenes de las buenas prácticas agrarias o de la membrana puede ser pseudo-color con cualquier color, para permitir la mejor calidad de imagen que se presenta sin perder ningún dato.
Figura 1: Imágenes representativas de las buenas prácticas agrarias B. subtilis proteínas de fusión de traslación. proteínas GFP se muestran en verde, mientras que FM4-64 tinción de membrana se muestra en rojo. La barra de escala blanco indica 3 m (A) MutS-GFP [genotipo relevantes: mutS - GFP (CPE), amyE:: Pspac mutL (cat)]. En presencia de 600 mg / ml de 2-aminopurina y 1 mM IPTG. FM4-64 de la señal no se presenta con el fin de mostrar más claramente los focos MutS-GFP (B) MutL-GFP [genotipo relevantes: mutL:: mutL-GFP (spc)].. En presencia de 2-aminopurine (C) DNAX-GFP [genotipo relevantes: dnaX:: dnaX-GFP (spc)]. (D) Reca-GFP [pertinentes genotipo: Reca:: Reca-GFP (spc)] en presencia de 20 ng / ml de mitomicina C (E) TAGC-GFP [genotipo relevantes: TAGC:: TAGC-GFP (SPC) ] en presencia de 1 mg / ml de mitomicina C.
| Tratamiento / concentración o la cantidad | Función | Tiempo de incubación |
| La mitomicina C (MMC) [20 a 150 ng / ml] | ADN con fármacos alquilantes | 1 hora |
| 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] | desajuste inducir | 1 hora |
| La hidroxiurea (HU) | agota dNTPs | 3 horas |
| la luz ultravioleta (UV) 20 J/m2 | Timina-timina dímeros y fotoproductos 6-4 | varía dependiendo de la fuente, unos 20 segundos |
| grises (radiación ionizante) 5 a 100 Gy | Doble cadena se rompe, se rompe una sola cadena y sitios de base de los daños | varía dependiendo de la fuente |
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Multitest de diapositivas, de 15, así | MP Biomedicals | 6041505E | |
| Microscopio de vidrio cubierta | Pescador | 12 a 544-B | |
| Agarosa | Pescador | BP160-500 | |
| Mitomicina C | Sigma | M0503-2MG | mutágeno, use guantes |
| 2-aminopurine | Sigma | A3509-250MG | guantes |
| Hidroxiurea | Sigma | H8627-25G | guantes |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | sensible a la luz |
Tabla 2. Lista de los reactivos y equipos específicos:
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Discussion
Ensayo y error están obligados a encontrar las condiciones de exposición de las imágenes de mayor calidad para cada cepa, nos encontramos con que una milésima de segundo es apropiado para las imágenes de luz blanca, mientras que las exposiciones de 100 a 2000 ms son apropiados para las buenas prácticas agrarias (FITC) y FM4 64 (TRITC ) imágenes. Tiempo de exposición puede variar en función de los equipos de imágenes utilizados. Se recomienda el uso de una cepa por portaobjetos de microscopio de 15 y para el más simple de imágenes, como la calidad del teclado y la difusión de las células de la frontera con pad podría complicar si la diferenciación de cepas múltiples cepas están presentes en la misma diapositiva. Calidad de la imagen depende directamente de la calidad de la plataforma de agarosa, donde las bacterias están en reposo. Las imágenes de alta calidad serán capturados de las almohadillas de agarosa, donde las bacterias están lado a lado. Pastillas que hacen que las células bacterianas al grupo, la prevención de una monocapa, se producen imágenes de baja calidad. Almohadillas que son demasiado gruesa producirá una señal de fondo fluorescente de alta, mientras que los cojines que están deshidratados no permiten a las células para descansar correctamente. Estos defectos de agarosa almohadilla por lo general resultan en una calidad de imagen muy pobre. Si un pozo está produciendo imágenes de baja, simplemente pasar a la siguiente también. Es ideal para capturar entre 50 y 200 células por la imagen. Microscopía de fluorescencia ha proporcionado una gran cantidad de información detallada sobre las señales celulares que dirigen el montaje de reparación del ADN y las proteínas de replicación en los focos en vivo. Con la práctica, esta técnica puede ser aplicada con éxito a una variedad de complejos de proteínas en muchas especies bacterianas.
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Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los Dres. Philina S. Lee y Alan D. Grossman para la formación inicial en LAS microscopía de fluorescencia. Los autores también agradecen a los Dres. Melanie Berkmen y Kobayashi Hajime ayuda y consejos para la imagen. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Facultad de Literatura, Ciencias y Artes y del Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo en la Universidad de Michigan.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
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| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
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| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
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| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
