ניתוח Immunocytochemical של בתאי גזע האדם pluripotent באמצעות מנגנון מתוצרת עצמית Cytospin

Summary

מכתים השעיה immunocytochemical בתאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) על פני קרום התא סמנים (SSEA-3/SSEA-4) הושג על בסיס השימוש במנגנון cytospin מתוצרת עצמית כדי ליצור monolayer של תאים להסתכלות וכימות.

Abstract

אדם בתאי גזע pluripotent (hPSCs) הכוללים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) האדם הנגרמת גזע pluripotent תאים (hiPSCs) הם מקורות תא מרגש עקב התחדשות עצמית שלהם יכולות בלתי מוגבלות הפוטנציאל שלהם להתמיין לסוגי תאים שונים. המדינה pluripotent של hPSCs נבחנת בדרך כלל על ידי טכניקות כגון qPCR, immunocytochemistry, ועל ידי אחרים

Protocol

חלק 1: מכתים השעיה Immunocytochemical

1. תאים נקצרים לתוך ההשעיה תא בודד.
2. התאים מועברים לאחר מכן לתוך 1.5-2ml צינורות microcentrifuge ו centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות.
3. תאים נשטפים החוצה על ידי aspirating supernatant, מחדש תלויה 1mL של PBS - (ללא Mg ^{2 +} ו - Ca ^{2 +)} ולאחר מכן centrifuged שוב למשך 4 דקות 200 גרם. זה צריך להיעשות פעמיים.
4. לאחר כביסה, תאים מקובעים אז paraformaldehyde 1mL של 4% (PFA) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות על ידי השעיית אותם מחדש.
5. תאים נשטפים שוב פעמיים עם 1mL של PBS -.
6. לאחר, על ידי שטיפת התאים לחסום מחדש השעיית אותם 1mL הפתרון בלוק (6% serum/94 PBS% -). דגירה אלה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
7. לאחר, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות לשאוב את הפתרון חסום. Re-להשעות תאים 1mL הפתרון נוגדן ראשוני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ). תאים יכולים להיות מודגרות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה לפני שתמשיך לשלב הבא.
8. תאים נשטפים לאחר מכן פעמיים עם 1mL הפתרון חסום.
9. לאחר, מחדש תאים להשעות 1mL של פתרון נוגדנים משני (עשה עם פתרון בלוק בדילול מומלץ) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
10. אחרי שעה 1, תאים אמור להיות שטף שוב פעמיים עם 1mL הפתרון חסום.
11. אחרי כביסה עם הפתרון בלוק, לכבס שוב עם תאים 1mL של PBS -.
12. לאחר שוטף שונים, מחדש תאים להשעות 1mL של DAPI גרעיני כתם (1:10,000 דילול DAPI ב PBS -) ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
13. אחרי 5 דקות, צנטריפוגה צינורות ב 200 גרם במשך 4 דקות. לשאוב את הפתרון גרעיני DAPI כתם מחדש להשעות תאים 1mL של PBS -.

חלק 2: התאגדות של hPSCs בשקופיות שנוצר באמצעות מנגנון cytospin

1. מגלשות פלסטיק מוכנים ידי הפיכת הסכום הרצוי בהם חורים עם העיתונות תרגיל. הקוטר צריך להיות לכל היותר 1 מ"מ גדול יותר בקוטר הרחב ביותר של קצה micropipette (ים) לשמש.
2. נייר מסנן לחתוך את הפרמטרים של השקופית פלסטיק עם מספריים.
3. חורים נעשים אז בעיתון הסינון. גודלו של החור (ים) צריך להיות גדול מספיק, כי את קצה micropipette (ים) מתאים מלבב דרכו.
4. אחרי אחד שקופיות פלסטיק מוכנים ממוקם על גבי שקופיות הזכוכית ממוקם בחלק התחתון של הנייר לסנן בסלע (איור 1). השכבות מובטחות עם הקלטת.
5. מקסימום של 100μL (תלוי בצפיפות monolayer הרצוי) של ההשעיה תא מוכתם חלק 1 ממוקם מכן לתוך החלק העליון של קצה micropipette (ים).
6. במידת הצורך, המנגנון עם פתרון התא יכול להיות שקל ומאזן נגדית של משקל דומה נוצר.
7. מנגנון cytospin ו לאזן יכול ממוקמות אז בצנטריפוגה שולחניים centrifuged ב 200 גרם במשך 4 דקות.
8. לאחר צנטריפוגה, המנגנון cytospin הוא מפורק בזהירות באופן doesn't לסלק את התאים מן שקופיות הזכוכית.
9. אם יש צורך, PBS שמסביב עודף - בצד זכוכית aspirated החוצה.
10. תאים לאחר מכן ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק אם monolayer תא הרצויה הושגה.

חלק 3: שקופיות הרכבה

1. ירידה של התקשורת הרכבה הרצוי ממוקם ישירות במרכז של כל אזור המכיל תאים.
2. לאחר, להחליק כיסוי הוא הוריד בעדינות על גבי שקופיות מנסה להימנע בועות אוויר אם זה אפשרי.
3. התקשורת הרכבה עודף מוסר אז משקופיות.
4. אחרי, צד של תלושי לכסות חתומות עם מסמר לכה.
5. השקופיות יכולים להישמר בשטח אחסון כהה עד התוצאות הם נצפו ותועדו.

Discussion

לענין במעבדה שלנו, צלחת 35mm של תא גזע תרבויות גדל על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) הוא המוקצב ההליך מכתים immunocytochemical לשימוש עם מנגנון cytospin. התאים נאספים אז באמצעות האנזימטית passaging, הסרת כמה שכבת MEF ככל האפשר, תוך השעיית תא בודד. אם גזע יותר יעיל תא הבידוד מהשכבה MEF הוא הרצוי, מושבות יכול להיות מעוכל לאחר מכן באופן ידני הרים לתוך ההשעיה. אם התנאים מזין חינם משמשים גדל בתאי גזע תרבויות, המושבות יכול להיות פשוט לגרד ו מעוכל לתוך ההשעיה. למרות ההשעיה הראשונית תא בודד הוא אידיאלי, גושים כל הסלולר צריך להיות יעיל שבורים מזה ברחבי שטיפת רבים מחדש ההשעיה צעדים קרא בהליך מכתים immunocytochemical.

וידאו התמקד השימוש סמנים תאיים על hPSCs מכתים. אם מכתים תאיים של hPSCs הוא הרצוי, צעד נוסף לפני התוספת של פתרון בלוק (שלב 1.6) צריך להיעשות שבו התאים נשטפים 1mL הפתרון Permeabilization (50mLs של הצפת מלח גבוהה עם 25μL של Tween 20) שלוש פעמים לפני מחדש השעיית להם פתרון חסום. עוד נקודה קריטית יש לציין כי מתוך 1.9 שלב בהליך, יש להקפיד על מזעור חשיפה לאור על דגימות כדי למנוע הלבנת פלואורסצנציה של הנוגדן משני DAPI גרעיני הכתם.

בגלל שטיפת רבים מחדש ההשעיה השלבים בהליך, מנה 35mm שלם עם כמות טובה של מוכנות למעבר גזע מושבות תאים, מעריכים בסביבות 400k-600k תאים, מומלץ להתעכל בשימוש ההשעיה הראשונית . הדבר נעשה לקראת הפסד כמה תאים בשל אופיו של ההליך. תיאורטית, כמות קטנה בהרבה של תאים ניתן להשתמש ההשעיה הראשונית אבל כמות נוספת של יש להקפיד על מנת להקטין את איבוד נוסף התא. בעת טעינת על המנגנון cytospin לאחר ההליך מכתים immunocytochemical, צפיפות התאים של 10k-50k הוא אידיאלי. יצוין, כי בעוד 100μL הוא הסכום המקסימלי שניתן הועמסו על מנגנון cytopsin המשתמשת קצה 0.1μL 10μL micropipette, כמות קטנה יותר (כ 20μL - 30μL) המכיל את צפיפות התאים אידיאלי מומלץ. זה ממזער הצפת מיותר של נוזלי לשקופית זכוכית. לבסוף, כאשר באמצעות מנגנון cytospin עם בצנטריפוגה, כל עוד מנגנון מאובטח מפני תנועה לרוחב, הכוח שנוצר על ידי צנטריפוגה תוך כדי ריצה יש, למיטב ידיעתנו, לא מספיק לשמור על מנגנון של היפוך או ליפול.

מצרכים עבור פתרונות המשמשים בהליך immunocytochemical:

1. Paraformaldehyde 2% (PFA) / סוכרוז 2%
   1. הוסף 75 מ"ל מים מזוקקים, ומניחים על צלחת ומערבבים מחומם על 56 ° C.
   2. שקול את 2 גרם PFA, ומוסיפים כוס זכוכית.
   3. שקול את 2 גרם סוכרוז, ולהוסיף PFA בכוס זכוכית.
   4. הוסף 2 טיפות של נתרן הידרוקסידי 1M.
   5. לאחר כל ריאגנטים נעלמו לתוך פתרון, להוסיף 10 מ"ל של PBS 10X + +.
   6. התאם את ה-pH של התמיסה על 7.2-7.4.
   7. תביאו את נפח 100 מ"ל עם מים מזוקקים.
      חנות ב 4 ° C, ושימוש בתוך שבוע 1. Aliquots ניתן לאחסן @ -20 ° C במשך חודש 1. צנטריפוגה בקצרה לאחר ההפשרה כדי להסיר כל המשקע.
2. בלוק פתרון (10 מ"ל)
   1. הוסף 9.4 מ"ל PBS -.
   2. הוסף 0.6 מ"ל סרום של PBS -. (זה אולי צריך להיות מותאם עבור כל נוגדן).
      חנות ב 4 ° C, ולהשתמש תוך 48 שעות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab Tek Permanox Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific, Inc.	117437	Material for re-used plastic slides
Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
0.1-10μL Filter Tips	USA Scientific, Inc.	1121-3810
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	120542-B
Cytoseal 280	Richard-Allan Scientific	8311-4	Mounting Medium
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	14190
Normal Goat Serum	Invitrogen	10000C
Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4304	Primary Antibody for SSEA-4 staining
Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody	EMD Millipore	MAB4303	Primary Antibody for SSEA-3 staining
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11029	Secondary Antibody for SSEA-4 staining
Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG	Invitrogen	A11006	Secondary Antibody for SSEA-3 staining
DAPI, Dihydrochloride	Calbiochem	268298