تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Summary

الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT - PCR) هو أداة فعالة لتشخيص مستويات مرنا في أنسجة الحشرات المختلفة والمراحل التنموية. في هذا التقرير نعرض لاستخدام qRT - PCR إلى مستويات مرنا التأكد اليرقات في الأنسجة المختلفة ، ومراحل تطور من أنواع الحشرات الغازية ، والزمرد الرماد حفار.

Abstract

الزمرد الرماد حفار (MNG ،

Protocol

ويصور بروتوكول الكامل مع الخطوات المختلفة في الرسم البياني في الشكل 1. الخطوات الفردية التي تشكل تشريح ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي تفصيلا ، أولا توليف ستراند [كدنا] وqRT PCR - أدناه.

أولا اليرقات تشريح

1. قبل بدء هذا الإجراء ، حفار مكان الرماد الزمرد ، أو البنك المصري الامريكي ، اليرقات على المناديل الورقية الرطبة حتى يتم إجراء تشريح. إبقاء الفوسفات أعدت حديثا 1X مخزنة المالحة ، أو برنامج تلفزيوني ، على الجليد للحفاظ على البرودة العازلة في جميع أنحاء تشريح.
2. لتبدأ ، إصلاح اليرقات المصري الامريكي على لوحة التشريح مع دبابيس تشريح الغرامة. ثم ، إضافة الباردة 1X PBS إلى لوحة تشريح.
3. الأول ، قطع رأس اليرقات مع زوج الجميلة من مقص تشريح. في وقت لاحق إزالة الجزء الأخير من البطن اليرقات.
4. باستخدام زوج من ساعاتي الملقط ، رفع إهاب من الذبيحة اليرقات. ثم ، إجراء شق على طول الذبيحة باستخدام مقص. الحرص على عدم تمزق في الأمعاء ، حيث يتم إجراء شق.
5. عزل بعناية الأنسجة المعي المتوسط ​​من الأنسجة الأخرى مثل الهيئات الدهون والنسيج الضام. ثم شطف أنسجة جديدة في برنامج تلفزيوني 1X عازلة لضمان عدم وجود تلوث fatbody. نقل المعي المتوسط ​​المعزولة إلى 500 ميكرولتر من قبل المبردة كاشف Trizol في أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
6. المقبل ، عزل نسيج الدهون في الجسم باستخدام ملقط وتحويلها في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 إيبندورف ميكرولتر من كاشف Trizol مبردة.
7. أخيرا ، عزل نسيج بشرة من الذبيحة اليرقات عن طريق التخلص من أي نسيج قبالة الالتزام ، مع الحرص على عدم الاضرار سلامة الأنسجة. شطف الأنسجة المعزولة في إهاب العازلة PBS الطازج ونقله الى أنبوب 1.5 مل إيبندورف مع 500 ميكرولتر من كاشف Trizol مبردة.
8. ويمكن تخزين الدهون في الجسم معزولة ، والمعي المتوسط ​​إهاب الأنسجة -80 درجة مئوية في استخراج الحمض النووي الريبي حتى.
9. تمهيدا لاستخراج الحمض النووي الريبي ، فرز عينات البنك المصري الامريكي وفقا لمختلف المراحل التنموية. وتشمل هذه المراحل 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، وinstars ، prepupae والبالغين.

II. استخراج الحمض النووي الريبي (كما في ليالي بروتوكول المصنعة لاستخدام الكاشف Trizol)

التجانس

1. لبدء استخراج الحمض النووي الريبي ، أولا استخدام المطاحن البلاستيك لتجانس الأنسجة في Trizol أنابيب تحتوي على 1.5 مل إيبندورف. بعد التجانس ، ليصبح إجمالي حجم كل عينة to1 مل مع كاشف Trizol.
2. لمراحل النمو والتجانس كل الحيوانات في النيتروجين السائل مع قذيفة هاون ومدقة. إضافة بعد ذلك من جناسة قسامة (50 ميكروغرام) إلى 1 مل من Trizol.

مرحلة فصل :

3. احتضان أنابيب العينات مع Trizol 1 مل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. التالية الحضانة ، إضافة 200μL من كلوروفورم لكل أنبوب. مباشرة بعد إضافة الكلوروفورم ، يهز بقوة أنابيب لنحو 15 ثانية. ثم احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لدقائق إضافية 2-3.
5. المقبل ، الطرد المركزي العينات في XG 12000 لمدة 15 دقيقة في 2 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي ، وسوف يكون الحمض النووي الريبي في المرحلة مائي. وينبغي أن حجم المرحلة المائية يكون 600 ميكرولتر ، أو 60 ٪ من إجمالي حجم Trizol.

RNA هطول الأمطار

6. إزالة بعناية سوى المرحلة مائي. وجود مواد أدناه المرحلة المائية يتسبب في تلويث الحمض النووي الريبي المستخرج. ثم نقل إلى المرحلة المائية المسمى مناسب 1.5 مل أنبوب إيبندورف.
7. لترسيب الحمض النووي الريبي من المرحلة المائية ، مزيج من 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل لكل أنبوب. احتضان هذه العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. بعد الحضانة ، أنابيب الطرد المركزي في 12000 XG لمدة 10 دقائق في 2 درجة مئوية.

اغسل RNA

8. بعد الطرد المركزي ، وتجاهل طاف من الأنابيب. RNA موجودة في هلام مثل بيليه شكلت في الجزء السفلي من الأنبوب. غسل بيليه مع الايثانول 75 ٪ ، مشيرا الى ما لا يقل عن 1 مل من الإيثانول بنسبة 75 ٪ لكل 1 مل من Trizol. مزيج من قبل vortexing. ثم ، في أنابيب الطرد المركزي 7500Xg لمدة 5 دقائق عند 2 درجة مئوية.

RNA شطف

9. تجاهل طاف من الأنابيب. أنابيب الطرد المركزي مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي طاولة صغيرة لمدة 1 دقيقة. إزالة أي طاف الزائدة من قبل pipetting أنبوب دقيق. ترك الأنبوب مفتوح والسماح للهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقائق. يجب الحرص على عدم جفاف خلال بيليه حيث سيؤدي ذلك إلى انخفاض ملحوظ ذوبانه.
10. بعد تجفيفها في الهواء ، وresuspend بيليه في diethylpyrocarbonate ، أو DEPC ، والمياه المعالجة. فإن كمية المياه المستخدمة لresuspend الكرية تعتمد على حجم الكرية. 50 ميكرولتر من استخدام المياه المعالجة DEPC لSMكل ميكرولتر بيليه أو 100 لبيليه كبيرة. السماح لتذوب تماما في بيليه DEPC المياه المعالجة عن طريق نقل معلومات سرية ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات.
11. بمجرد أن بيليه قد حلت ، ومكان العينة على 55 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
12. ثم ، وقياس تركيز كل عينة الحمض النووي الريبي باستخدام معمل Nanodrop (2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي).
13. تخزين عينات الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

III. أول ستراند التجميعي [كدنا] (كما في ليالي بروتوكول المصنعة باستخدام مرتفع التجميعي الشكل الأول قبل عدة Invitrogen).

1. لكل عينة الحمض النووي الريبي إضافة التالية في أنبوب PCR :

   RNA	س ميكرولتر
   10MM dNTP مزيج M	1μl
   أليغو (DT) (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر)	1 ميكرولتر
   المياه المعالجة DEPC	(8 - X) ميكرولتر
   اجمالى حجم التداول :	10 ميكرولتر
   ملاحظة : x هو حجم استخدام الحمض النووي الريبي لتخليق [كدنا]. اعتمادا على تركيز الحمض النووي الريبي ، سيتم استخدام 2-3 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لكل التفاعل وإجمالي حجم رد الفعل ينبغي أن يكون كل 10 ميكرولتر.

2. ضع مزيج التفاعل أعلاه في thermocycler عند 65 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
3. إزالة أنابيب من theromocyler ووضعها على الجليد على الفور الحصول على ما لا يقل عن 2 دقيقة.
4. يعد أول فرع للماجستير المزيج عن طريق إضافة ما يلي :

   10X RT العازلة	2μl
   25mM MgCl 2	4 ميكرولتر
   0.1M DTT	2 ميكرولتر
   ريبونوكلياز خارج	1 ميكرولتر

5. إضافة 9 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي ، ومزيج من قبل pipeting وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الخليط.
6. مكان الأنابيب مرة أخرى في thermocycler واحتضان لمدة 2 دقيقة على 42 درجة مئوية.
7. وقفة thermocycler وإضافة 1 ميكرولتر الثاني مرتفع الانزيم الناسخ العكسي (Invitrogen) لكل أنبوب. وينبغي القيام بهذه الخطوة بسرعة.
8. احتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
9. إنهاء رد الفعل عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
10. إزالة أنابيب من thermocycler ووضعها على الجليد.
11. إضافة 1 ميكرولتر من H ريبونوكلياز لكل أنبوب ووضعها مرة أخرى في thermocycler في 37 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية.
12. بعد أخذ عينات من thermocycler ، إضافة 20 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه في كل أنبوب. وتضاعف حجم كل عينة في هذه المرحلة.
13. التحقق من تركيز كل عينة باستخدام 2 ميكرولتر من العينة. أخذ عينة من كل قسامة ، لجعل تركيز 20ng/μl لاستخدامها في qRT - PCR. فإن كمية المياه التي تشكل عينات لتركيز 20ng/μl تعتمد على التركيز الأولي للمركبة [كدنا].

رابعا. qRT - PCR :

التصميم التمهيدي وتحديد الجينات المرجعية

1. الاشعال التصميم مع درجة حرارة انصهار (TM) من 60 درجة مئوية وحجم المنتج من 100bp ~.
2. يستخدم AP - PERI1 مثل الجينات ذات الأهمية لهذه التجربة. وثمة حاجة إلى مرجع أو الجينات الرقابة الداخلية لتحليلها لاحقا ، وتطبيع البيانات. ويستخدم البروتين الريباسي (AP - RP1) والجين مرجعية لهذه التجربة.
3. إعداد 5uM مخزونات العمل في المشارع التي سيتم استخدامها ، بما في ذلك الجين رجوع اليها.

إعداد المعايير

4. من أجل حساب كفاءة الاشعال المستخدمة ينبغي بذل المعايير.
5. جعل مزيج من [كدنا] من العينات المختلفة التي سيتم اختبارها.
6. جعل التخفيفات المتسلسلة 5X لكل نقطة المطلوبة في الرسم البياني. وينبغي أن يكون كافيا أربعة التخفيفات ولكن يوصى بشدة الخمسة.
7. سوف تختلف تبعا لحجم وكم وكيف العديد من النقاط الفنية يعيد يجري استخدامها. يجب أن يكون هناك ما يكفي لجعل معيار لكل الجينات التي يجري اختبارها بما في ذلك الجين المرجعية.

صفيحة القالب

8. تصميم قالب نموذج يبين اسم لكل بئر في لوحة qRT - PCR. تذكر أن تشمل معايير كل الجينات واثنين على الأقل لكل عينة يعيد التقنية.

إعداد المعلمات الدراجات

9. بدوره الجهاز qRT - PCR وأدخل على المعلمات ركوب الدراجات. المعلمات الدراجات لهذه التجربة على النحو التالي :
   الخطوة 1 :
   • دورة 1 : 95 درجة مئوية 3 دقائق
   الخطوة 2 :
   • 40 دورة : 95 درجة مئوية بعد 15 ثانية بنسبة 60 درجة مئوية و 30 ثانية
     (اختياري : لتحديد منحنى ذوبان تشمل الخطوات التالية)
   الخطوة 3 :
   • دورة 1 : 95 درجة مئوية 1 دقيقة
   الخطوة 4 :
   • 1cycle : 55 درجة مئوية 1 دقيقة
   الخطوة 5 :
   • 81 دورات : 55 درجة مئوية و 30 ثانية

لوحة لتعيين ما يصل CFX96 (BioRad) ماكينة

11. تحضير مزيج رئيسية لكل مورثة (جينة بما في ذلك المرجعية) في أنبوب منفصل. لكل بئر ، ويتكون من مزيج الرئيسي

    Nuclease المياه مجانا	2μl
    2.5 X SYBR الخضراء	4 ميكرولتر
    التمهيدي إلى الأمام	1 ميكرولتر
    عكس التمهيدي	1 ميكرولتر
    اجمالى حجم	ميكرولتر 8

12. أثناء إعداد مزيج الرئيسي 1-2 تشمل تفاعلات اضافية لحساب الأخطاء pipetting.
13. وفقا للقالب مصمم مسبقا ، إضافة 2 ميكرولتر (20 نانوغرام / ميكرولتر) من [كدنا] في كل بئر. ثم ، إضافة 8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل بئر ، مما أدى إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 ميكرولتر في رد الفعل.
14. ماصة صعودا وهبوطا (2 - 3X) للتأكد من ان عينة مختلطة أيضا. تأكد من أن السائل لا يبقى على الحافة. لتجنب التلوث المتبادل ، واستخدام معلومات جديدة عن كل عينة.
15. مرة واحدة لوحة بأكمله هو الإعداد ، وغطاء لوحة مع الشريط الضوئي. تجنب لمس الشريط لأن وجود الشحوم يمكن أن تؤثر على القراءة. ثم ، لوحة أجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لضمان أن جميع المنتجات في الآبار في الجزء السفلي من اللوحة.
16. بعد الطرد المركزي ، والتحقق من عدم وجود الثلج أو الماء على الجزء السفلي من اللوحة. أخيرا ، وضع لوحة في الجهاز qRT - PCR وتشغيل البرنامج PCR.

خامسا تمثيل شكلي للتجربة

الشكل 1 : مخطط التدفق تصور ترتيب تسلسلي من الخطوات لدراسة الجينات التعبير.

الشكل 2 : أ) تشريح المصري الامريكي اليرقات تظهر المعى المتوسط ​​في الوسط. B) المعزولة من البنك المصري الامريكي اليرقات المعى المتوسط

الشكل 3 : أ) متوسط ​​القيم التعبير النسبي (الدورات) لجين peritrophin (AP - PERI1) في الأنسجة المختلفة بما في ذلك اليرقات إهاب (النحاس) ، المعي المتوسط ​​(MG) ​​والهيئات الدهون (FB). تم استخدام بروتين معين المصري الامريكي الريباسي (يسمى هنا ، AP - RP1) مثل الرقابة الداخلية لتطبيع البيانات التي تم الحصول عليها عن الجينات في المصالح ، AP - PERI1. ب) تغيير أضعاف النسبية للAP - PERI1 في الأنسجة اليرقات. وأظهرت الأنسجة بشرة الأقل التعبير ، وبالتالي اتخذ مثل معير (1X) عينة (Pfaffl ، 2001).

الشكل 4 : أ) متوسط ​​القيم التعبير النسبي (الدورات) لجين peritrophin (AP - PERI1) في مراحل النمو المختلفة بما في ذلك البنك المصري الامريكي instars اليرقات (1 ، 2 ، 3 و 4) ، prepupae (PP) والكبار (A). تم استخدام البروتين المصري الامريكي الريباسي محددة (AP - RP1) والرقابة الداخلية لتطبيع البيانات التي تم الحصول عليها لهذا الجين من الاهتمام ، AP - PERI1. ب) تغيير أضعاف النسبية للAP - PERI1 في مراحل النمو المختلفة. وأظهرت العينة PP أقل مستوى من مستويات مرنا ، وبالتالي اتخذ مثل معير (1X العينة).

سادسا. استنتاج

الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qRT - PCR) هو أداة فعالة لتشخيص مستويات مرنا في أنسجة الحشرات المختلفة والمراحل التنموية. كذلك ، تم qRT - PCR في الغالب أداة أساسية للتحقق من صحة البيانات التي تم إنشاؤها من تحليلات عالية الإنتاجية التعبير الجيني مثل ميكروأرس والجيل الجديد من RNA تسلسل.

Discussion

دورات العتبة (CT) يتم الحصول على قيمة لكل عينة في لوحة qRT - PCR. لجعل منحنى القياسية ، ورسم الحصول على قيمة ط م لكل تمييع ضد السجل من تركيزه. ثم تم التخطيط القيم ط م للالعينات التجريبية على تخفيف هذا المعيار منحنى السلسلة. وحسبت كميات الهدف من إنشاء منحنيات معيار منفصلة لكل تجربة أي نسيج والتعبير التنموية. ثم تم تحديد قيم التعبير النسبي (الدورات) بقسمة كميات من تسلسل الهدف من الاهتمام (في هذه الحالة AP - PERI1) مع كمية من أجل الحصول على الرقابة الداخلية (AP - RP1). لإجراء العمليات الحسابية من الأهمية ، وجرى تحليل سجلات من الدورات لكل الجينات التي ANOVA (تحليل التباين) باستخدام الإجراء PROC مختلطة من ساس (SAS معهد شركة SAS / STAT المستخدم ليالي دليل ، الإصدار 9.1). تم تحديد أهمية في مستوى التعبير عند 0.05 <ع. وحسبت التغيرات النسبية أضعاف في حالة الأنسجة التي أخذ العينة إهاب كما معير (1X العينة ، Pfaffl ، 2001). ولذلك ، فإن مستويات التعبير في الهيئات المعي المتوسط ​​والدهون بالنسبة للبشرة. في حالة التعبير التنموية ، تم أخذ عينة prepupal كما معير. لكلتا الدراستين ، وهما مكررات البيولوجية واستخدمت التقنية الثلاثة متماثلة.

كشفت تجربتنا بكثير (P <0.05) مستويات أعلى من AP - PERI1 نص في النسيج المعى المتوسط ​​(الشكل 3) مقارنة مع الأنسجة الأخرى يعاير. خلال مراحل التطوير كانت التغذية (أي instars اليرقات والكبار) إلى حد كبير (ع <0.05) أعلى من العينة prepupae (الشكل 4). وحسبت المستويات الأقل مرنا للبشرة وprepupae (الشكلان 3 و 4). بالنظر إلى أن peritrophins هي جزء لا يتجزأ من المعي المتوسط ​​الحشرات نتائجنا تؤيد النتائج السابقة في أنواع الحشرات الأخرى (Mittapalli وآخرون 2007). أنماط وحظ خلال المراحل التنموية تؤكد مواصلة مهمة AP - PER1 في الهضم والعمليات ذات الصلة. وباسيلوس عصية على نطاق واسع (بي تي) السموم في نباتات المحاصيل المستهدفة في الواقع وتعطيل PM في الحشرات (Pauchet وآخرون ، 2009). وبالتالي ، يمكن للنتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة لم تكشف فقط عن أهداف الجمعية والسيطرة المحتملة ، بل أيضا توفير المعارف الأساسية عن كيفية أنواع الحشرات الغازية على التكيف مع بيئتهم الجديدة.