Summary
Количественный ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) является эффективным инструментом для диагностики мРНК в разных тканях насекомого и стадии развития. В этом отчете мы показываем использование QRT-PCR установить уровни мРНК в разных тканей личинки и стадии развития инвазивных видов насекомых, изумруд золы буром.
Abstract
Изумрудный золы буром (EAB,
Protocol
Полный протокол с разными шагами изображена на блок-схеме на рисунке 1. Отдельные этапы, составляющие рассечение, РНК добычи, первой цепи кДНК синтеза и QRT-PCR подробно описаны ниже.
И. личинок Dissection
- До начала этой процедуры, место Изумрудный золы буром или EAB, личинки на влажных бумажных салфеток до вскрытия выполняются. Хранить свежеприготовленный 1X фосфатным буферным раствором, или PBS, на льду, чтобы сохранить буфер холодной всей рассечение.
- Во-первых, исправить EAB личинок на вскрытии пластины с мелким контакты рассечение. Затем добавьте холодной 1X PBS для вскрытия пластины.
- Во-первых, обезглавить личинки с прекрасной парой рассечение ножницами. Впоследствии удалить последний сегмент брюшка личинок.
- Использование часовщик пара щипцов, поднимите кутикулу от личиночной туши. Затем надрезать вдоль длины каркаса с помощью пары ножниц. Будьте осторожны, не к разрыву кишечника, как надрез.
- Тщательно изолировать кишки ткани из других тканей, таких как жир тела и соединительной ткани. Затем ополосните ткань в свежем буфере 1X PBS, чтобы гарантировать, что есть не загрязняются fatbody. Передача изолированной кишки до 500 мкл предварительно охлажденное Trizol реагента в трубке 1,5 мл Eppendorf.
- Далее, изолировать жировой ткани тела с помощью щипцов и передачи его в 1,5 мл Eppendorf пробирку 500 мкл охлажденного Trizol реагента.
- Наконец, изолировать кутикулы ткани личиночной туши, избавляясь от каких-либо приставших ткани, заботясь, чтобы не повредить целостности тканей. Промыть изолированные ткани кутикулы в пресной PBS буфера и перенести его на 1,5 мл трубки Эппендорф с 500 мкл охлажденного Trizol реагента.
- Изолированных жировых тканях тела, кутикулу и кишки можно хранить при температуре -80 ° C до выделения РНК.
- В ходе подготовки к добыче РНК, сортировать различные образцы EAB по стадиях развития. Эти этапы включают 1-го, 2-го, 3-го и 4-го возрастов, предкуколок и взрослых.
II. Добыча РНК (как протокол на одного производителя с при использовании Trizol реагент)
Гомогенизация
- Для начала РНК Добыча, первым использованием пластиковых пестики для гомогенизации тканей в Trizol, содержащий 1,5 мл пробирок Эппендорф. После гомогенизации, довести общий объем каждой мл образца ТО1 с Trizol реагента.
- Для стадий развития, гомогенизации целого животного в жидкий азот с помощью ступки и пестика. Затем добавить аликвоту гомогената (50 мкг) в 1 мл Trizol.
Разделение фаз:
- Инкубируйте пробирки с образцами с 1 мл Trizol в течение 15 минут при комнатной температуре.
- После инкубации, добавьте 200 мкл хлороформа в каждую пробирку. Сразу после добавления хлороформа, встряхните труб энергично в течение приблизительно 15 секунд. Затем, инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение еще 2-3 минут.
- Далее, центрифуги образцов при 12000 Xg в течение 15 минут при температуре +2 ° C. После центрифугирования РНК будет в водной фазе. Объем водной фазы должно быть 600 мл, или 60% от общего объема Trizol.
РНК осадков
- Осторожно снимите только водную фазу. Наличие веществ ниже водной фазе вызовет загрязнение извлеченные РНК. Затем перенесите водной фазы в соответствующей маркировкой 1,5 мл трубки Эппендорф.
- Чтобы осадок РНК из водной фазы, смешать 0,5 мл изопропилового спирта в каждую пробирку. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации, центрифуги трубы при 12000 Xg в течение 10 минут при температуре +2 ° C.
РНК Вымойте
- После центрифугирования супернатант отказаться от труб. РНК присутствует в гелеобразной гранулы образуются в нижней части трубы. Вымойте гранул с 75% этанола, добавив, по крайней мере 1 мл 75% этанола в 1 мл Trizol. Смешайте по вортексе. Затем, центрифуги труб при 7500Xg течение 5 минут при 2 ° С.
РНК элюирования
- Удалите супернатант из труб. Центрифуги трубы снова в небольшой центрифуге таблицу в течение 1 минуты. Удалите излишки супернатант из трубы осторожно пипеткой. Оставьте трубку открытым и позвольте воздуху гранул сухого течение 5-10 минут. Будьте осторожны, не более сухих гранул, так как это значительно уменьшает его растворимость.
- После воздушной сушки, ресуспендируют осадок в diethylpyrocarbonate или DEPC, очищенной воды. Количество воды, используемой для ресуспендирования гранул будет зависеть от размера гранул. Используйте 50 мкл DEPC очищенной воды для смвсе гранулы или 100 мкл для больших гранул. Пусть шарик полностью растворяются в DEPC очищенной воды, перемещая пипетку кончиком вверх и вниз несколько раз.
- Как только осадок не растворится, место образца при 55 ° С в течение 10 минут.
- Затем, измерения концентрации каждого образца РНК с использованием Nanodrop спектрофотометр (2 мкл образца РНК).
- Магазин РНК образцы при -80 ° C до последующего использования.
III. Первая цепь кДНК синтеза (как протокол на одного производителя с использованием Надстрочный аптечку первой Синтез прядь по Invitrogen).
- Для каждого образца РНК добавить следующее в ПЦР-пробирку:
РНК х мкл 10 мМ дНТФ смесь М 1 мкл Олиго (DT) (0,5 мкг / мкл) 1 мкл DEPC очищенной воды (8-х) мкл Общий объем: 10 мкл Примечание: х-объем РНК используется для синтеза кДНК. В зависимости от концентрации РНК, 2-3 мкг РНК будет использоваться для каждой реакции и общий объем каждой реакции должно быть 10 мкл. - Место выше смеси реакция в амплификаторе при 65 ° С в течение 4 минут.
- Удалить труб из theromocyler и разместить их на лед сразу, по крайней мере 2 минуты.
- Подготовка первого нить мастер смесь, добавив следующее:
10X Буфер РТ 2μl 25 мМ MgCl 2 4 мкл 0,1 М ДТТ 2 мкл РНКазы из 1 мкл - Добавить 9 мкл мастер смеси в каждую пробирку с образцом РНК, микс pipeting и центрифуги смесь кратко.
- Место трубы еще в амплификаторе и инкубировать в течение 2 минут при 42 ° C.
- Пауза амплификаторе и добавить 1 мкл Надстрочный II фермента обратной транскриптазы (Invitrogen) в каждую пробирку. Этот шаг должен быть сделан быстро.
- Инкубируйте образцов при 42 ° С в течение 1,5 часов.
- Завершить реакции при 70 ° С в течение 15 минут.
- Удалить труб из амплификаторе и разместить их на льду.
- Добавить 1 мкл РНКазы Н в каждую пробирку и поместите их обратно в амплификаторе при температуре 37 ° С в течение 20 минут.
- После взятия образцов из амплификаторе, добавить 20 мкл нуклеазы без воды в каждую пробирку. Объем каждого образца в два раза на этом этапе.
- Проверьте концентрацию каждого образца с помощью 2 мкл образца. Возьмите аликвоту каждого образца, чтобы концентрация 20ng/μl для использования в QRT-PCR. Количество воды, чтобы составить образцы концентрации 20ng/μl будет зависеть от начальной концентрации кДНК синтезировали.
IV. QRT-PCR:
Дизайн Primer и определение полномочий ген
- Дизайн праймеров с температурой плавления (Tm) 60 ° С и продукт размером ~ 100bp.
- AP-PERI1 используется в качестве гена для этого эксперимента. Ген ссылки или внутреннего контроля необходима для последующего анализа и нормализации данных. Рибосомного белка (AP-RP1) используется в качестве ссылки гена для этого эксперимента.
- Подготовка 5um рабочие запасы грунтовки, которая будет использоваться, в том числе справки гена.
Подготовка стандартов
- Для того чтобы рассчитать эффективность грунтовки используются стандарты должны быть сделаны.
- Сделайте смесь кДНК из разных образцов, которые будут проверены.
- Сделать 5X серийных разведений для каждой нужной точки на графике. Четыре разведения должно быть достаточно, но пять мы настоятельно рекомендуем.
- Объем будет варьироваться в зависимости от того, сколько точек и сколько технических повторяет используются. Там должно быть достаточно, чтобы сделать стандартный для каждого гена проходит испытания в том числе ссылки гена.
Пластина шаблона
- Дизайн шаблона указывает наименование образца для каждой скважины в QRT-PCR пластины. Не забудьте включить стандарты для каждого гена и по крайней мере два технических повторяет один образец.
Настройка параметров езда на велосипеде
- Включите QRT-PCR машины и войти в велосипедных параметров. Езда на велосипеде параметры для этого эксперимента заключается в следующем:
Шаг 1:- 1 цикл: 95 ° C 3 мин
- 40 циклов: 95 ° C 15 с последующим 60 ° C 30 сек
(Дополнительно: для определения кривой плавления включает следующие шаги) Шаг 3: - 1 цикл: 95 ° С 1 мин
- 1cycle: 55 ° С 1 мин
- 81 циклов: 55 ° C 30 сек
Пластина создан для CFX96 (BioRad) машины
- Подготовка мастер микса для каждого гена (в том числе ссылки гена) в отдельные трубы. Для каждой скважины, Mix Master состоит из
Нуклеазы свободной воды 2μl 2,5 X SYBR зеленый 4 мкл Грунтовка вперед 1 мкл Грунтовка обратном 1 мкл Общий объем 8 мкл - При подготовке мастер смеси включают 1-2 дополнительных реакций, для учета пипетирования ошибок.
- В соответствии с ранее разработан шаблон, добавить 2 мкл (20 нг / мкл) кДНК в каждую лунку. Затем добавьте 8 мкл мастер смеси в каждую лунку, в результате чего общий объем 10 мкл на реакцию.
- Внесите вверх и вниз (2-3х), чтобы убедиться, образец хорошо перемешивается. Убедитесь, что жидкость не остается на чаевые. Чтобы избежать перекрестного загрязнения, используйте новый наконечник для каждого образца.
- После всей пластине установки, покрытие пластин с оптической ленты. Не прикасайтесь к ленте, как наличие смазки может влиять на чтение. Затем, центрифуги пластины на 500 оборотов в минуту в течение 1 минуты, чтобы гарантировать, что все продукты в скважинах в нижней части пластины.
- После центрифугирования, убедитесь, что нет никакого льда или воды в нижней части пластины. Наконец, поместите пластину в QRT-PCR машины и запустить программу ПЦР.
В. Схематическое изображение эксперимента
Рисунок 1: Схема изображающие последовательно шагов для изучения экспрессии генов.
Рисунок 2:) личиночной EAB вскрытие показывает кишки в середине. B), выделенных средней кишки личинок EAB
Рисунок 3:) Средние относительные значения выражения (оборотах) для гена peritrophin (AP-PERI1) в различных тканях, включая личиночной кутикулы (Cu), средней кишки (МГ) и жира тела (FB). EAB конкретных рибосомных белков (здесь названы, AP-RP1) был использован в качестве внутреннего контроля для нормализации данных, полученных для интересующего гена, AP-PERI1. B) Относительная раз изменение AP-PERI1 тканей личинки. Кутикулы тканей показал, как минимум выражения и поэтому было принято в качестве калибратора (1X) образца (Pfaffl, 2001).
Рисунок 4:) Средние относительные значения выражения (оборотах) для гена peritrophin (AP-PERI1) в разных стадиях развития в том числе EAB личиночных возрастов (1, 2, 3 и 4), предкуколок (ПП) и взрослых (). EAB конкретных рибосомных белков (AP-RP1) был использован в качестве внутреннего контроля для нормализации данных, полученных для интересующего гена, AP-PERI1. B) Относительная раз изменение AP-PERI1 в различных стадиях развития. Образец ПП показал мере уровень мРНК и, следовательно, был взят калибратора (1X образец).
VI. Заключение
Количественный ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) является эффективным инструментом для диагностики мРНК в разных тканях насекомого и стадии развития. Кроме того, QRT-PCR в основном было ключевым инструментом для проверки данных, полученных с высокой пропускной способностью анализ экспрессии генов, такие как микрочипы и новое поколение РНК-Seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Порога циклов (Ct) значения, полученные для каждого образца в QRT-PCR пластины. Для приготовления стандартной кривой, значение Ct, полученных для каждого разведения был заговор против журнала его концентрации. Ct значения для экспериментальных образцов были затем построены на этой стандартной кривой серии разбавления. Целевая количествах были рассчитаны отдельные стандартные кривые, полученные для каждой ткани есть эксперимент и развития выражения. Относительные значения выражения (оборотах) были затем определяется путем деления количества целевой последовательности интереса (в данном случае AP-PERI1) с количеством полученных для внутреннего контроля (AP-RP1). Для расчета значения, журналов оборотах для каждого гена были проанализированы дисперсионного анализа (анализ отклонений) с помощью PROC MIXED процедуры SAS (SAS Institute Inc SAS / STAT Руководство пользователя, версия 9.1). Значение выражения уровне была определена при р <0,05. Относительная раз изменения в случае ткани были рассчитаны, принимая кутикулы образца калибратора (1X образца, Pfaffl, 2001). Таким образом, уровни экспрессии в средней кишки и жира тела были относительно кутикулы. В случае развития выражения, prepupal образец была взята в качестве калибратора. Для обоих исследованиях двух биологических повторяет и повторяет три технических были использованы.
Наш эксперимент показал достоверно (р <0,05) выше уровня AP-PERI1 стенограмму в ткани кишки (рис. 3) по сравнению с другими тканями анализировали. В процессе разработки кормления этапов (т.е. личиночных возрастов и взрослых) были достоверно (р <0,05) выше, чем образца предкуколок (рис. 4). Мере уровней мРНК были рассчитаны для кутикулы и предкуколок (рис. 3 и 4). Учитывая, что peritrophins являются неотъемлемой частью насекомых кишки наши результаты подтверждают ранее полученные данные у других видов насекомых (Mittapalli и соавт. 2007). Моделей наблюдается в стадии развития дальнейшего подтверждения функцию AP-Per1 в пищеварении и процессов, связанных с. Широко используются Bacillus thuringiensis (Bt) токсинов в культурные растения действительно целевые и сорвать PM у насекомых (Pauchet и соавт., 2009). Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, могли бы не только выявить потенциальных целей управления EAB но и дают фундаментальные знания о том, как инвазивные виды насекомых адаптации к новой среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы признаем, помощь, оказанную при Лурдес Delta Arrueta Антекера (кафедра энтомологии Университета штата Огайо / OARDC, Вустер, штат Огайо) в настройке экспериментов. Мы благодарим доктора Терезы Польша (USDA, лесных служб, NRS) для отправки EAB личиночной образцов. Помощь при условии, д-р Луис Канас и Nuris М Акоста с микроскопом установки приветствуется. Финансирование этого проекта была оказана со стороны государства и Федеральной средств, ассигнованных в Огайо сельскохозяйственных исследований и развития центра, университета штата Огайо.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L. Biology of the Insect Midgut. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).
