Summary
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT-पीसीआर) विभिन्न कीट ऊतकों और विकास के चरणों में mRNA स्तर निदान के लिए एक प्रभावी उपकरण है. इस रिपोर्ट में हम पता लगाने mRNA स्तर के विभिन्न ऊतकों में लार्वा और आक्रामक कीट प्रजातियों, पन्ना राख बोरर के विकास के चरणों के लिए QRT-पीसीआर के उपयोग दिखाओ.
Abstract
पन्ना राख छिद्रक (EAB,
Protocol
विभिन्न चरणों के साथ पूरा प्रोटोकॉल चित्र 1 में प्रवाह चार्ट में दिखाया गया है. व्यक्तिगत कदम गठन विच्छेदन, शाही सेना निकासी, पहले Strand सीडीएनए संश्लेषण और QRT-पीसीआर नीचे विस्तृत रहे हैं.
I. लारवल विच्छेदन
- इस प्रक्रिया की शुरुआत, जगह पन्ना राख बोरर, या EAB, नम टिशू पेपर पर लार्वा से पहले जब तक dissections प्रदर्शन कर रहे हैं. हौसले से तैयार 1X फॉस्फेट रखें खारा buffered या, Pbs, बर्फ पर विच्छेदन भर बफर ठंडा रखने के.
- शुरू करने के लिए, ठीक विच्छेदन पिन के साथ विच्छेदन की थाली पर EAB लार्वा को ठीक. फिर, विच्छेदन थाली ठंड 1X पीबीएस जोड़ने.
- सबसे पहले, विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी के साथ ठीक लार्वा सिर काटना. इसके बाद लार्वा के अंतिम पेट खंड हटा दें.
- संदंश के एक घड़ीसाज़ जोड़ी का उपयोग, लार्वा लोथ से छल्ली लिफ्ट. फिर, कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर लोथ की लंबाई के साथ एक चीरा बनाते हैं. पेट टूटना चीरा के रूप में किया जाता है परवाह नहीं है ले लो.
- ध्यान midgut ऊतक वसा शरीर और संयोजी ऊतक के रूप में अन्य ऊतकों से अलग है. फिर, ताजा 1X PBS बफर में ऊतक कुल्ला करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ fatbody की कोई संदूषण है. पूर्व एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में ठंडा Trizol अभिकर्मक के 500 μL पृथक midgut स्थानांतरण.
- अगला, वसा शरीर संदंश का उपयोग ऊतक अलग है और यह एक 1.5 एमएल Eppendorf ठंडा Trizol अभिकर्मक के 500 μL युक्त ट्यूब में स्थानांतरित.
- अंत में, लार्वा लोथ से बंद किसी भी पालन ऊतक समाप्त, ध्यान लेने के लिए ऊतक की अखंडता को नुकसान नहीं छल्ली ऊतक अलग. ताजा PBS बफर में अलग छल्ली ऊतक कुल्ला और एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब इसे ठंडा Trizol अभिकर्मक के 500 μL के साथ स्थानांतरण.
- पृथक वसा ऊतकों शरीर, छल्ली, और midgut -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है ° सी जब तक शाही सेना निष्कर्षण.
- शाही सेना के निष्कर्षण के लिए तैयार करने में, विकास के चरणों के अनुसार विभिन्न EAB नमूने तरह. इन सभी चरणों में - 1, 2, 3, prepupae और instars-4, और वयस्कों शामिल हैं.
द्वितीय. शाही सेना एक्सट्रैक्शन (Trizol अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए प्रति निर्माता प्रोटोकॉल के रूप में)
Homogenization
- शाही सेना निकालना शुरू करने के लिए, पहली प्लास्टिक pestles उपयोग Trizol युक्त 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूबों में ऊतकों homogenize. Homogenization के बाद, Trizol अभिकर्मक के साथ प्रत्येक नमूना to1 एमएल की कुल मात्रा ले आओ.
- विकास के चरणों के लिए, तरल नाइट्रोजन में एक मोर्टार और मूसल के साथ पूरे जानवर homogenize. फिर Trizol के 1 एमएल homogenate (50 μg) के एक विभाज्य जोड़ें.
चरण जुदाई:
- कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1 एमएल Trizol के साथ नमूना ट्यूबों सेते हैं.
- ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक ट्यूब क्लोरोफॉर्म की 200μL जोड़ने. क्लोरोफॉर्म जोड़ने के तुरंत बाद, ट्यूब के बारे में 15 सेकंड के लिए सख्ती से हिला. फिर, एक अतिरिक्त 2-3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों सेते हैं.
- अगला, 2 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र Centrifugation के बाद, शाही सेना जलीय चरण में होगा. जलीय चरण की मात्रा 600 μl, या कुल Trizol मात्रा का 60% होना चाहिए.
शाही सेना तेज़ी
- ध्यान केवल जलीय चरण हटा दें. जलीय चरण नीचे पदार्थों की उपस्थिति निकाले शाही सेना के संदूषण के कारण होगा. फिर, एक उचित लेबल 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में जलीय चरण हस्तांतरण.
- जलीय चरण से शाही सेना वेग, प्रत्येक ट्यूब isopropyl शराब के 0.5 एमएल मिश्रण. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सेते हैं. ऊष्मायन के बाद, 12,000 XG में 2 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र
शाही सेना धो
- Centrifugation के बाद, ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागने. शाही सेना गोली जेल की तरह ट्यूब के नीचे गठन में मौजूद है. 75% इथेनॉल के साथ गोली धो, Trizol के 1 एमएल प्रति 75% इथेनॉल के कम से कम 1 एमएल जोड़ने. Vortexing द्वारा मिक्स. फिर, 7500Xg में 2 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र
शाही सेना elution
- ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 1 मिनट के लिए छोटी सी मेज अपकेंद्रित्र में ट्यूबों फिर अपकेंद्रित्र. ट्यूब से सावधान pipetting के द्वारा किसी भी अतिरिक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें. छोड़ो ट्यूब खुला और गोली हवा 5-10 मिनट के लिए शुष्क. गोली खत्म नहीं सूखे के रूप में यह काफी अपने विलेयता कम हो जाएगा सावधान रहना.
- हवा सुखाने के बाद, में गोली resuspend diethylpyrocarbonate , या DEPC, इलाज पानी. गोली resuspend किया पानी की मात्रा गोली के आकार पर निर्भर करेगा. एक एस.एम. लिए DEPC इलाज पानी की 50 μLएक बड़ा गोली के लिए सभी गोली या 100 μL. चलो गोली विंदुक टिप चलती ऊपर और नीचे कई बार के द्वारा पूरी तरह DEPC इलाज पानी में भंग.
- एक बार गोली को भंग कर दिया है, 55 ° सी में 10 मिनट के लिए नमूना जगह है.
- फिर, एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आरएनए नमूना के 2 μL) का उपयोग प्रत्येक शाही सेना के नमूने की एकाग्रता को मापने.
- -80 में शाही सेना के नमूने स्टोर डिग्री सेल्सियस तक आगे उपयोग.
III. प्रथम Strand सीडीएनए संश्लेषण (प्रति एस निर्माता Invitrogen द्वारा सुपरस्क्रिप्ट पहली कतरा संश्लेषण किट का उपयोग कर प्रोटोकॉल के रूप में.)
- प्रत्येक शाही सेना नमूना के लिए एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें:
शाही सेना एक्स μl 10mm dNTP मिश्रण एम 1μl (डीटी) oligo (0.5 μg / μl) 1 μl DEPC पानी का इलाज Μl (8-x) कुल मात्रा: 10 μl नोट: x शाही सेना की मात्रा सीडीएनए संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया है. शाही सेना की एकाग्रता पर निर्भर करता है, शाही सेना के 2-3 μg प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाएगा और प्रत्येक प्रतिक्रिया की कुल मात्रा 10 μl होना चाहिए. - 4 मिनट के लिए 65 में thermocycler में उपरोक्त प्रतिक्रिया मिश्रण ° सी रखें.
- Theromocyler से ट्यूबों निकालें और उन्हें बर्फ पर कम से कम 2 मिनट के लिए तुरंत जगह.
- निम्न जोड़कर पहली भूग्रस्त मास्टर मिश्रण तैयार:
10X आरटी बफर 2μl 25mm 2 MgCl 4 μl 0.1M डीटीटी 2 μl RNase बाहर 1 μl - मास्टर मिश्रण के 9 μl प्रत्येक शाही सेना नमूना युक्त ट्यूब, pipeting द्वारा मिश्रण जोड़ें और मिश्रण संक्षिप्त अपकेंद्रित्र.
- ट्यूबों thermocycler में वापस प्लेस और 42 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए सेते
- Thermocycler रोकें और प्रत्येक ट्यूब करने के लिए सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम (Invitrogen) के 1 μl जोड़ें. यह कदम जल्दी से किया जाना चाहिए.
- 1.5 घंटे के लिए 42 ° सी में नमूने सेते हैं.
- बर्खास्त डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के लिए 70 पर प्रतिक्रिया.
- Thermocycler से ट्यूबों निकालें और उन्हें बर्फ पर जगह.
- प्रत्येक ट्यूब RNase एच 1 μl जोड़ें और उन्हें जगह वापस thermocycler में 37 ° 20 मिनट के लिए सी.
- नमूने thermocycler के बाहर लेने के बाद प्रत्येक ट्यूब में nuclease मुफ्त पानी के 20 μl जोड़ें. इस स्तर पर प्रत्येक नमूने की मात्रा दोगुनी है.
- नमूना के 2 μl का उपयोग करके प्रत्येक नमूने की एकाग्रता की जाँच करें. प्रत्येक नमूना के विभाज्य लो, QRT-पीसीआर में उपयोग के लिए 20ng/μl की एकाग्रता. पानी की मात्रा 20ng/μl के एक एकाग्रता के लिए नमूने कर संश्लेषित सीडीएनए के प्रारंभिक एकाग्रता पर निर्भर करेगा.
चतुर्थ. QRT - पीसीआर:
प्राइमर और संदर्भ जीन का डिजाइन निर्धारण
- 60 डिग्री सेल्सियस और 100bp ~ एक उत्पाद आकार के पिघलने के तापमान (टीएम) के साथ डिजाइन प्राइमरों.
- एपी PERI1 इस प्रयोग के लिए ब्याज की जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है. एक संदर्भ जीन या बाद में और डेटा के विश्लेषण के सामान्यीकरण के लिए आंतरिक नियंत्रण की जरूरत है. Ribosomal प्रोटीन (एपी RP1) इस प्रयोग के लिए संदर्भ जीन के रूप में प्रयोग किया जाता है.
- प्राइमरों आपके संदर्भ के जीन सहित उपयोग किया जाएगा, के 5uM काम कर शेयरों की तैयारी.
मानकों की तैयारी
- आदेश में इस्तेमाल किया जा रहा मानकों बना होना चाहिए प्राइमरों की दक्षता की गणना करने के लिए.
- विभिन्न नमूनों है कि परीक्षण किया जाएगा से सीडीएनए का एक मिश्रण बनाओ.
- ग्राफ में प्रत्येक वांछित बिंदु के लिए 5X धारावाहिक dilutions बनाओ. चार dilutions पर्याप्त हो सकता है लेकिन पाँच अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं चाहिए.
- मात्रा कितने अंक कैसे कई और तकनीकी प्रतिकृति पर इस्तेमाल किया जा रहा निर्भर करता है अलग अलग होंगे. प्रत्येक संदर्भ जीन सहित परीक्षण किया जा रहा जीन के लिए एक मानक बनाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
प्लेट टेम्पलेट
- एक नमूना प्रत्येक के लिए अच्छी तरह QRT-पीसीआर थाली में नाम का संकेत टेम्पलेट डिज़ाइन करें. प्रत्येक जीन के लिए मानकों और कम से कम दो तकनीकी नमूना प्रति replicates शामिल याद रखें.
साइकिल चालन के मापदंडों सेट
- QRT-पीसीआर मशीन पर मुड़ें और साइकिल चालन पैरामीटर दर्ज करें. इस प्रयोग के लिए साइकिल चालन के मापदंडों निम्नानुसार है:
चरण 1:- चक्र 1: 95 मिनट ° 3 सी
- 40 चक्रों: 95 ° C 15 सेकंड 60 सेकंड ° 30 सी के द्वारा पीछा किया
(वैकल्पिक: पिघलने वक्र का निर्धारण करने के लिए निम्नलिखित चरणों में शामिल हैं) चरण 3: - 1 चक्र: 95 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
- 1cycle: 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
- 81 चक्रों: 55 सेकंड ° 30 सी
प्लेट CFX96 (BioRad) मशीन के लिए सेट अप
- अलग ट्यूब में प्रत्येक जीन (संदर्भ जीन सहित) के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, मास्टर मिश्रण के होते हैं
Nuclease मुफ्त पानी 2μl 2.5 एक्स SYBR हरे 4 μl आगे प्राइमर 1 μl प्राइमर रिवर्स 1 μl कुल मात्रा 8 μl - जबकि मास्टर मिश्रण की तैयारी 1-2 pipetting त्रुटियों के लिए खाते में अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं.
- पहले लिए डिज़ाइन टेम्पलेट के अनुसार, 2 μL (20 एनजी / μL) के प्रत्येक अच्छी तरह सीडीएनए जोड़ें. तब हर अच्छी तरह से करने के लिए मास्टर मिश्रण के 8 μL जोड़ने के लिए, प्रतिक्रिया प्रति 10 μL की कुल मात्रा में जिसके परिणामस्वरूप.
- पिपेट और नीचे (2-3X) सुनिश्चित करें कि नमूना अच्छी तरह से मिश्रित है. जाँच करें कि कोई भी तरल टिप पर रहता है. पार संक्रमण से बचने के लिए, प्रत्येक नमूना के लिए एक नई टिप का उपयोग करें.
- एक बार पूरी थाली सेटअप है, ऑप्टिकल टेप के साथ थाली को कवर. टेप छू तेल की उपस्थिति के रूप में पढ़ने को प्रभावित कर सकते हैं से बचें. फिर, 1 मिनट के लिए 500 rpm पर थाली अपकेंद्रित्र करने के लिए सुनिश्चित करें कि कुओं में सभी उत्पादों के प्लेट के नीचे हैं.
- Centrifugation के बाद, जांच, कि वहाँ कोई थाली के तल पर बर्फ या पानी है. अंत में, QRT-पीसीआर मशीन में जगह थाली और पीसीआर कार्यक्रम चलाने के.
वी. प्रयोग के ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व
चित्रा 1: फ्लो चार्ट जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए कदम के अनुक्रमिक क्रम चित्रण.
चित्रा 2: एक) लार्वा EAB बीच में midgut दिखा विच्छेदन. बी) लार्वा EAB के पृथक midgut
चित्रा 3: एक) (घन) छल्ली, midgut (एमजी) और वसा शरीर (अमेरिकन प्लान) सहित विभिन्न लार्वा ऊतकों में एक peritrophin जीन (एपी PERI1) के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति मान (revs) मीन . एक EAB विशिष्ट ribosomal प्रोटीन (यहाँ नाम, एपी RP1) सामान्य ब्याज की जीन, एपी PERI1 के लिए प्राप्त डेटा के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. बी) लार्वा ऊतकों में सापेक्ष एपी PERI1 गुना परिवर्तन. छल्ली ऊतक कम से कम अभिव्यक्ति दिखाया और इसलिए अंशशोधक (1X) नमूना (Pfaffl 2001) के रूप में लिया गया था.
चित्रा 4: एक) लार्वा instars (1, 2, 3 और 4), prepupae (पीपी) और वयस्कों (ए) सहित विभिन्न विकासात्मक EAB के चरणों में एक peritrophin जीन (एपी PERI1) के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति मान (revs) मतलब . एक EAB विशिष्ट ribosomal प्रोटीन (एपी RP1) सामान्य ब्याज की जीन, एपी PERI1 के लिए प्राप्त डेटा के लिए आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. बी) के विभिन्न विकासात्मक चरणों में सापेक्ष एपी PERI1 गुना परिवर्तन. पीपी नमूना mRNA स्तर के कम से कम स्तर दिखाया और इसलिए अंशशोधक (1X नमूना) के रूप में लिया गया था.
छठी. निष्कर्ष
मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (QRT-पीसीआर) विभिन्न कीट ऊतकों और विकास के चरणों में mRNA स्तर निदान के लिए एक प्रभावी उपकरण है. इसके अलावा, QRT-पीसीआर ज्यादातर कुंजी उपकरण जैसे प्रोटीन और नई पीढ़ी के आरएनए Seq उच्च throughput जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से उत्पन्न डेटा को मान्य किया गया है .
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Discussion
दहलीज चक्र (सीटी) मूल्य QRT-पीसीआर थाली में प्रत्येक नमूना के लिए प्राप्त की है. मानक वक्र बनाने के लिए, सीटी प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए प्राप्त मान अपनी एकाग्रता के प्रवेश के खिलाफ प्लॉट था. प्रयोगात्मक नमूने के लिए सीटी मानों तो इस कमजोर पड़ने श्रृंखला मानक वक्र पर प्लॉट किए जाते थे. टारगेट मात्रा अलग मानक प्रत्येक प्रयोग यानी ऊतक और विकास की अभिव्यक्ति के लिए उत्पन्न घटता से गणना की गई. रिश्तेदार अभिव्यक्ति मान (revs) तो आंतरिक नियंत्रण के लिए प्राप्त मात्रा (एपी RP1) के साथ ब्याज के लक्ष्य अनुक्रम (एपी PERI1 इस मामले में) की मात्रा को विभाजित करके निर्धारित किया गया है. महत्व की गणना के लिए प्रत्येक जीन के लिए revs लॉग एनोवा (विचरण का विश्लेषण) एसएएस (SAS संस्थान इंक गाइड SAS / स्टेट उपयोगकर्ता, संस्करण 9.1) के proc मिश्रित प्रक्रिया का उपयोग कर से विश्लेषण किया गया. अभिव्यक्ति के स्तर में महत्व पी <0.05 पर निर्धारित किया गया था. ऊतकों के मामले में सापेक्ष गुना परिवर्तन अंशशोधक (1X नमूना, Pfaffl, 2001) के रूप में छल्ली नमूना लेने के द्वारा गणना की गई. इसलिए, midgut और वसा शरीर में अभिव्यक्ति के स्तर छल्ली के सापेक्ष थे. विकास अभिव्यक्ति के मामले में, prepupal नमूना अंशशोधक के रूप में लिया गया था. दोनों के अध्ययन के लिए, दो जैविक replicates और तीन प्रतिकृति तकनीकी का इस्तेमाल किया गया.
हमारी प्रयोग काफी पता चला (पी <0.05) अन्य assayed ऊतकों की तुलना में midgut ऊतकों में एपी PERI1 प्रतिलिपि के उच्च स्तर (3 छवि). विकास के दौरान खिला चरणों (यानी लार्वा instars और वयस्क) काफी थे (पी <0.05) prepupae नमूना (4 छवि) की तुलना में अधिक है. कम से कम mRNA स्तर छल्ली और prepupae (Figs. 3 & 4) के लिए गणना की गई. यह देखते हुए कि peritrophins कीट midgut हमारे परिणाम अन्य कीट प्रजातियों में पिछले निष्कर्षों की पुष्टि (2007 Mittapalli एट अल.) के अभिन्न अंग हैं. विकास के चरणों के दौरान मनाया पैटर्न और पाचन और संबंधित प्रक्रियाओं में एपी PER1 के समारोह की पुष्टि करें. व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रकार की फसलों के पौधों में बेसिलस thuringiensis (बीटी) विषाक्त पदार्थों को वास्तव में लक्ष्य और कीड़ों में PM (Pauchet एट अल., 2009) बाधित . इसलिए, इस अध्ययन में प्राप्त परिणामों केवल EAB के लिए संभावित नियंत्रण लक्ष्य प्रकट नहीं लेकिन यह भी सकता है और कैसे आक्रामक कीड़ों की प्रजाति अपने नए वातावरण के लिए अनुकूल के रूप में बुनियादी ज्ञान प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम प्रयोगों के सेटअप में लूर्डेस डेल्टा Arrueta Antequera (कीट विज्ञान विभाग, ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी / OARDC, Wooster, OH) द्वारा प्रदान की मदद को स्वीकार करते हैं. हम डा. Therese पोलैंड (USDA वन सेवा, एनआरएस) EAB लार्वा के नमूने भेजने के लिए धन्यवाद. डॉ. लुइस एक Canas और Nuris एम Acosta द्वारा प्रदान की खुर्दबीन सेटअप के साथ सराहना की है मदद. इस परियोजना के लिए अनुदान राज्य और संघीय ओहियो कृषि अनुसंधान और विकास केंद्र, ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी के लिए विनियोजित धन द्वारा प्रदान की गई थी.
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L. Biology of the Insect Midgut. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).
