Analisi dell'espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Summary

Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) è un efficace strumento per diagnosticare i livelli di mRNA nei tessuti degli insetti diversi e fasi di sviluppo. In questo rapporto si mostra l'uso di qRT-PCR per accertare i livelli di mRNA in diversi tessuti larvali e gli stadi di sviluppo delle specie di insetti invasivi, smeraldo piralide cenere.

Abstract

Emerald cenere piralide (EAB,

Protocol

Il protocollo completo di diversi passaggi è raffigurato nel diagramma di flusso nella Figura 1. Singole fasi che costituiscono la dissezione, l'estrazione di RNA, la sintesi Strand Prima cDNA e qRT-PCR sono descritti di seguito.

I. larvali Dissection

1. Prima dell'inizio di questa procedura, posto piralide cenere Smeraldo, o EAB, larve su una carta assorbente umida fino dissezioni vengono eseguite. Mantenere fresco preparato 1X tampone fosfato salino, o PBS, sul ghiaccio per mantenere il freddo del buffer durante la dissezione.
2. Per iniziare, fissare le larve EAB sul piatto dissezione con perni dissezione fine. Quindi, aggiungere a freddo PBS 1X alla piastra di dissezione.
3. In primo luogo, decapitare le larve con un bel paio di forbici dissezione. Successivamente rimuovere l'ultimo segmento addominale delle larve.
4. Usando un paio di pinze orologiaio, sollevare la cuticola dalla carcassa larvale. Poi, fare un'incisione per tutta la lunghezza della carcassa con un paio di forbici. Fare attenzione a non rompersi l'intestino, come l'incisione è fatto.
5. Con attenzione isolare il tessuto midgut da altri tessuti come i corpi grassi e tessuto connettivo. Poi, lavare il tessuto in acqua dolce tampone PBS 1X per garantire che non vi è contaminazione di fatbody. Trasferire il midgut isolato a 500 ml di pre-raffreddata reagente Trizol in una provetta 1,5 ml Eppendorf.
6. Prossimo, isolare il tessuto grasso corporeo con pinze e trasferirlo in una provetta 1,5 ml eppendorf contenente 500 ml di freddo reagente Trizol.
7. Infine, isolare il tessuto cuticola dalla carcassa larvale da rottamazione fuori qualsiasi tessuto aderente, avendo cura di non danneggiare l'integrità del tessuto. Sciacquare il tessuto isolato cuticola in tampone PBS fresco e trasferirli in una provetta da 1,5 mL eppendorf con 500 microlitri di acqua refrigerata reagente Trizol.
8. L'isolato tessuti grassi del corpo, cuticola e dell'intestino possono essere conservati a -80 ° C fino all'estrazione dell'RNA.
9. In preparazione per l'estrazione di RNA, ordinare i campioni EAB diverse secondo le fasi di sviluppo. Queste fasi sono di 1 °, 2 °, 3 ° e 4 ° stadi, prepupae e adulti.

II. Estrazione di RNA (Come protocollo del produttore per s per l'utilizzo di reagenti Trizol)

Omogeneizzazione

1. Per iniziare l'estrazione di RNA, utilizzare innanzitutto pestelli di plastica per omogeneizzare i tessuti nel Trizol contenente 1,5 ml provette Eppendorf. Dopo omogeneizzazione, portare il volume totale di ogni campione a 1 ml con il reagente Trizol.
2. Per le fasi di sviluppo, omogeneizzare intero animale in azoto liquido con un mortaio e pestello. Quindi aggiungere una aliquota della omogenato (50 mg) a 1 ml di Trizol.

Separazione di fase:

3. Incubare le provette con 1 ml Trizol per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Dopo l'incubazione, aggiungere 200μL di cloroformio per ogni provetta. Immediatamente dopo l'aggiunta di cloroformio, agitare i tubi vigorosamente per circa 15 secondi. Poi, incubare le provette a temperatura ambiente per un ulteriore 2-3 minuti.
5. Avanti, centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 minuti a 2 ° C. Dopo la centrifugazione, l'RNA sarà nella fase acquosa. Il volume della fase acquosa deve essere 600 microlitri, o 60% del volume totale Trizol.

RNA precipitazioni

6. Rimuovere con cura solo la fase acquosa. Presenza di sostanze al di sotto della fase acquosa provoca la contaminazione del RNA estratto. Poi, il trasferimento della fase acquosa in un tubo opportunamente etichettato 1,5 ml Eppendorf.
7. Per precipitare l'RNA dalla fase acquosa, mescolare 0,5 ml di alcool isopropilico per ogni provetta. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 12000 xg per 10 minuti a 2 ° C.

Lavare RNA

8. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dai tubi. L'RNA è presente nel gel-like pellet formata sul fondo della provetta. Lavare il pellet con il 75% di etanolo, aggiungendo almeno 1 ml di etanolo 75% per 1 ml di Trizol. Mescolare nel vortex. Poi, centrifugare le provette a 7500Xg per 5 minuti a 2 ° C.

RNA eluizione

9. Scartare il sopranatante dai tubi. Centrifugare le provette nella centrifuga di nuovo tavolino per 1 minuto. Rimuovere eventuali surnatante in eccesso dal tubo pipettando attento. Lasciare il tubo aperto e lasciare che l'aria pellet asciutto per 5-10 minuti. Fare attenzione a non asciugare il pellet in quanto si riduce significativamente la sua solubilità.
10. Dopo l'aria di essiccazione, risospendere il pellet in diethylpyrocarbonate , o DEPC, acqua trattata. La quantità di acqua usata per risospendere il pellet dipende dalla dimensione del pellet. Utilizzare 50 ml di acqua trattata DEPC per un smtutti microlitri pellet o 100 per un pellet grande. Lasciate che il pellet si dissolvono completamente in acqua trattata DEPC spostando la punta della pipetta su e giù parecchie volte.
11. Una volta che il pellet si è sciolta, posto il campione a 55 ° C per 10 minuti.
12. Poi, misura la concentrazione di ogni campione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (2 ml di campione di RNA).
13. Conservare i campioni di RNA a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso.

III. First-Strand cDNA Synthesis (Come protocollo del produttore per s utilizzando SuperScript primo kit di sintesi filo da Invitrogen).

1. Per ogni campione di RNA aggiungere quanto segue in un tubo di PCR:

   RNA	x microlitri
   10mM dNTP mix M	1ml
   Oligo (dt) (0,5 mg / mL)	1 ml
   DEPC acqua trattata	(8-x) microlitri
   Volume totale:	10 microlitri
   Nota: x è il volume di RNA utilizzati per la sintesi del DNA. A seconda della concentrazione del RNA, 2-3 mg di RNA saranno utilizzati per ogni reazione e il volume totale di ogni reazione deve essere di 10 microlitri.

2. Mettere la miscela sopra reazione in un termociclatore a 65 ° C per 4 minuti.
3. Rimuovere i tubi dal theromocyler e disporli sul ghiaccio immediatamente per almeno 2 minuti.
4. Preparare il primo filamento master mix aggiungendo quanto segue:

   RT buffer 10X	2μl
   25mM MgCl 2	4 microlitri
   0.1M DTT	2 microlitri
   RNasi fuori	1 ml

5. Aggiungere 9 ml di master mix a ciascuna provetta contenente il campione di RNA, mescolare pipeting e centrifugare brevemente miscela.
6. Posizionare i tubi indietro nel termociclatore e incubare per 2 minuti a 42 ° C.
7. Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 1 ml di Apice II enzima trascrittasi inversa (Invitrogen) in ciascuna provetta. Questo passo dovrebbe essere fatto in fretta.
8. Incubare i campioni a 42 ° C per 1,5 ore.
9. Terminare la reazione a 70 ° C per 15 minuti.
10. Rimuovere i tubi dal termociclatore e disporli sul ghiaccio.
11. Aggiungere 1 ml di RNasi H a ciascuna provetta e metterli di nuovo nel termociclatore a 37 ° C per 20 minuti.
12. Dopo aver preso i campioni dal termociclatore, aggiungere 20 ml di acqua priva di nucleasi in ciascun tubo. Il volume di ogni campione è raddoppiata in questa fase.
13. Controllare la concentrazione di ogni campione con 2 ml di campione. Prendere aliquota di ciascun campione, per rendere la concentrazione di 20ng/μl per l'uso in qRT-PCR. La quantità di acqua per compensare i campioni ad una concentrazione di 20ng/μl dipende dalla concentrazione iniziale del cDNA sintetizzato.

IV. qRT-PCR:

Primer Progettazione e Determinazione del gene di riferimento

1. Primer design con una temperatura di fusione (Tm) di 60 ° C e una dimensione del prodotto di ~ 100bp.
2. AP-PERI1 viene utilizzato come gene di interesse per questo esperimento. Un gene di riferimento o di controllo interno è necessario per la successiva analisi e normalizzazione dei dati. Proteina ribosomiale (AP-RP1) viene utilizzato come gene di riferimento per questo esperimento.
3. Preparare 5um scorte di lavoro del primer che verranno utilizzati, tra cui il gene di riferimento.

Elaborazione di norme

4. Per calcolare l'efficienza dei primers utilizzati gli standard dovrebbero essere fatti.
5. Fai un mix di cDNA da diversi campioni che saranno testati.
6. Fai 5X diluizioni seriali per ogni punto desiderato nel grafico. Quattro diluizioni dovrebbe essere sufficiente, ma cinque sono altamente raccomandati.
7. Il volume può variare a seconda di quanti punti e quante tecnico replica vengono utilizzati. Ci dovrebbe essere abbastanza per fare uno standard per ogni gene in fase di test tra cui il gene di riferimento.

Piastra modello

8. Progettare un modello indicante il nome del campione per ciascun bene nel qRT-PCR piatto. Ricordati di includere standard per ogni gene e almeno due tecnici repliche per campione.

Impostare i parametri di ciclismo

9. Girare la qRT-PCR macchina e immettere i parametri ciclismo. I parametri di ciclismo per questo esperimento è la seguente:
   Fase 1:
   • 1 ciclo: 95 ° C 3 min
   Fase 2:
   • 40 cicli: 95 ° C 15 sec seguiti da 60 ° C 30 sec
     (Opzionale: per la determinazione della curva di fusione comprende le seguenti fasi)
   Fase 3:
   • 1 ciclo: 95 ° C 1 min
   Fase 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min
   Fase 5:
   • 81 cicli: 55 ° C 30 sec

Piastra impostato per CFX96 (BioRad) macchina

11. Preparare la master mix per ogni gene (tra cui il gene di riferimento) in tubo separato. Per ogni bene, il master mix è composto da

    Acqua priva di nucleasi	2μl
    2,5 X SYBR green	4 microlitri
    Primer forward	1 ml
    Primer retromarcia	1 ml
    Volume totale	8 microlitri

12. Mentre si prepara la master mix includono 1-2 reazioni in più per tenere conto di errori di pipettamento.
13. Secondo il modello precedentemente progettato, aggiungere 2 microlitri (20 ng / mL) di cDNA in ciascun pozzetto. Poi, aggiungere 8 microlitri della master mix in ciascun pozzetto, risultando in un volume totale di 10 L per reazione.
14. Pipetta su e giù (2-3X) per assicurarsi che il campione sia ben amalgamato. Controllare che nessun liquido rimane sulla punta. Per evitare la contaminazione crociata, utilizzare una nuova punta per ogni campione.
15. Una volta che l'intera piastra è configurato, coprire il piatto con del nastro ottica. Evitare di toccare il nastro come la presenza di grasso possono influenzare la lettura. Poi, centrifugare la piastra a 500 rpm per 1 minuto per garantire che tutti i prodotti nei pozzi si trovano in fondo della piastra.
16. Dopo la centrifugazione, controllare che non ci sia ghiaccio o acqua sul fondo del piatto. Infine, posizionare la piastra nella qRT-PCR macchina ed eseguire il programma PCR.

V. Rappresentazione schematica del Experiment

Figura 1: Diagramma raffigurante l'ordine sequenziale dei passaggi per lo studio dell'espressione genica.

Figura 2: A) larvale dissezione EAB mostrando midgut nel mezzo. B) midgut isolati di larvale EAB

Figura 3: A) I valori medi espressione relativa (giri) per un peritrophin gene (AP-PERI1) in diversi tessuti tra cui cuticola larvale (Cu), dell'intestino (MG) ​​e corpi grassi (FB). Una specifica EAB proteina ribosomiale (qui chiamato, AP-RP1) è stato utilizzato come controllo interno per normalizzare i dati ottenuti per il gene di interesse, AP-PERI1. B) Variazione relativa piega di AP-PERI1 larvale nei tessuti. Il tessuto cuticola ha mostrato la minima espressione e, pertanto, è stato preso come il calibratore (1X) campione (Pfaffl, 2001).

Figura 4: A) I valori medi espressione relativa (giri) per un peritrophin gene (AP-PERI1) nelle varie fasi di sviluppo di EAB tra cui stadi larvali (1a, 2a, 3a e 4a), prepupae (PP) e adulti (A). Un EAB specifica proteina ribosomiale (AP-RP1) è stato utilizzato come controllo interno per normalizzare i dati ottenuti per il gene di interesse, AP-PERI1. B) Variazione relativa piega di AP-PERI1 in vari stadi di sviluppo. Il campione PP ha mostrato il livello minimo dei livelli di mRNA e quindi è stato preso come il calibratore (1X campione).

VI. Conclusione

Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) è un efficace strumento per diagnosticare i livelli di mRNA nei tessuti degli insetti diversi e fasi di sviluppo. Inoltre, qRT-PCR è stata per lo più lo strumento chiave per convalidare i dati generati da analisi di espressione genica di alta velocità come microarray e la nuova generazione di RNA-Seq.

Discussion

I cicli soglia (Ct) il valore si ottiene per ogni campione in qRT-PCR piatto. Per fare la curva standard, il valore Ct ottenuti per ogni diluizione è stato in funzione del log della sua concentrazione. I valori Ct per i campioni sperimentali sono stati poi riportati su questa curva standard di diluizione della serie. Quantità obiettivo sono stati calcolati da separare le curve standard generato per ogni tessuto cioè esperimento e l'espressione dello sviluppo. I valori di espressione relativa (giri) sono stati poi determinato dividendo la quantità di sequenza bersaglio di interesse (in questo caso AP-PERI1) con la quantità ottenuta per il controllo interno (AP-RP1). Per i calcoli di significato, i log dei giri per ogni gene sono stati analizzati mediante ANOVA (analisi della varianza), utilizzando la procedura PROC MIXED di SAS (SAS Institute Inc. SAS / STAT utente s Guide, Versione 9.1). Significato nel livello di espressione è stato determinato con p <0,05. Relativi cambiamenti volte nel caso dei tessuti sono stati calcolati sulla base del campione cuticola come il calibratore (1X campione, Pfaffl, 2001). Pertanto, i livelli di espressione nei corpi midgut e grasso sono state relative alla cuticola. Nel caso di espressione di sviluppo, il campione prepupal è stato preso come il calibratore. Per entrambi gli studi, due repliche biologiche e tre tecnici replica sono stati utilizzati.

Il nostro esperimento ha rivelato in modo significativo (p <0,05) più elevati livelli di AP-PERI1 trascrizione nel tessuto midgut (Fig. 3) rispetto ad altri tessuti analizzati. Durante lo sviluppo le fasi di alimentazione (cioè l'stadi larvali e adulti) erano significativamente (p <0,05) superiore alla prepupae campione (Fig. 4). I livelli di mRNA sono stati calcolati almeno per cuticole e prepupae (fig. 3 e 4). Dato che peritrophins sono parte integrante del midgut insetti nostri risultati confermano precedenti risultati in altre specie di insetti (Mittapalli et al. 2007). Gli andamenti osservati durante le fasi di sviluppo ulteriore conferma della funzione di AP-PER1 nella digestione e relativi processi. La ampiamente utilizzato Bacillus thuringiensis (Bt) tossine nelle piante delle colture effettivamente target e interrompere il PM in insetti (Pauchet et al., 2009). Quindi, i risultati ottenuti in questo studio potrebbe non solo rivelare potenziali obiettivi di controllo per EAB, ma anche fornire conoscenze di base su come invasiva specie di insetti adattarsi al loro nuovo ambiente.