Summary
实时定量PCR（QRT - PCR）是一种有效的工具来诊断，在不同的昆虫组织和发育阶段的mRNA水平。在这份报告中，我们使用QRT - PCR在不同的幼虫组织确定的mRNA水平和侵入性的昆虫物种，白蜡窄吉丁的发展阶段。
Abstract
白蜡窄吉丁（EAB，
Protocol
完整的协议与不同的步骤是描绘在图1的流程图。构成夹层的各个步骤，第一链cDNA合成，RNA提取和定量RT - PCR详述如下。
一，幼虫解剖
- 在此过程的开始，地方白蜡窄吉丁，或EAB，幼虫在潮湿的纸巾，直到解剖执行。保持新鲜配制的1X的磷酸盐缓冲液在冰，或PBS，以保持整个解剖缓冲区冷。
- 首先，修复的罚款清扫引脚的夹层板的EAB幼虫。然后，添加冷1X PBS夹层板。
- 首先，杀头的清扫剪刀的罚款对幼虫。随后取出幼虫的最后腹节。
- 钟表匠对使用产钳，电梯从幼虫尸体的角质层。然后，沿切口用一把剪刀的尸体的长度。采取切口，小心不要肠道破裂。
- 小心地隔离其他组织如脂肪组织和结缔组织中肠组织。然后，在新鲜的1X PBS缓冲液冲洗组织，以确保没有fatbody污染。孤立肠转移到500μL预冷Trizol试剂1.5 mL Eppendorf管。
- 接下来，隔离脂肪的身体组织，使用镊子，并转移到一个1.5毫升的Eppendorf管含500μL冷冻Trizol试剂。
- 最后，从幼虫尸体隔离杀任何坚持组织照顾，不损伤组织的完整性，角质层组织。在新鲜的PBS缓冲液冲洗隔离角质层组织和500μL冷冻Trizol试剂转移到1.5 mL Eppendorf管。
- 隔离的脂肪体，角质层和肠组织可以储存在-80 ° C直到RNA提取。
- 在RNA的提取准备，各种EAB样本进行排序，根据发展阶段。这些阶段包括第一，第二，第三，第四，龄期，prepupae和成人。
二。 RNA的提取（每制造商为使用Trizol试剂协议）
同质化
- 要开始RNA的提取，首先使用塑料杵均质Trizol试剂含有1.5 mL的Eppendorf管组织。同质化后，带来Trizol试剂每个样品TO1毫升的总量。
- 对于处于发育阶段，同质化在液氮用迫击炮和杵整个动物。然后加入1毫升的Trizol匀浆等分（50微克）。
相分离行为：
- 用1 mL Trizol试剂在室温下15分钟的孵育样品管。
- 孵化后，每管200μL氯仿。立即加入氯仿后，大力摇管约15秒。然后，在室温下孵育管额外2-3分钟。
- 接下来，离心15分钟的样品在2 ° C，12,000 XG离心后，将在水相中的RNA。水相的体积应该是600μL，或60％的总Trizol法体积。
RNA沉淀
- 小心地取出只有水相。以下的水相物质的存在会导致提取的RNA污染。然后，水相转移到一个适当的标记的1.5 mL Eppendorf管。
- 从水相中的RNA沉淀，混合每管0.5毫升的异丙醇。样品在室温下孵育10分钟。孵化后10分钟，离心管，在2 ° C 12000 XG
RNA的洗
- 离心后，弃管的上清液。 RNA是在试管底部形成的凝胶体状的颗粒。用75％乙醇洗涤沉淀，增加至少1毫升75％，每1毫升的Trizol乙醇。混合振荡。然后5分钟，离心管，在2 ° C 7500Xg
RNA的洗脱
- 丢弃上清液管。再次在1分钟的小桌子离心机离心管。从试管中取出，小心吹打任何多余的上清液。离开管打开，让沉淀空气干燥5-10分钟。要小心不要过分干燥的颗粒，因为这将大大降低其溶解度。
- 空气干燥后，重新悬浮颗粒酸二乙酯 ，或DEPC处理，处理后的水。水用于悬浮颗粒的数量将取决于颗粒的大小。使用50μLDEPC处理水为SM全部为大颗粒的沉淀或100μL。让沉淀完全DEPC处理水溶解移动枪头向上和向下几次。
- 一旦沉淀溶解，放置在55 ° C，10分钟的样品。
- 然后，测量每个RNA样品的浓度，使用Nanodrop分光光度计（2μLRNA样品）。
- 的RNA样品存放在-80 ° C，直到进一步的使用。
三。第一链cDNA合成（由于每个制造商使用标第一链合成试剂盒由Invitrogen S协议。）
- 对于每个RNA样品在PCR管中添加以下内容：
核糖核酸 xμL 10MM的dNTP组合中号 加入1μl 以oligo（dT）（0.5μg/μL的） 1μL DEPC处理水 （8 - X）μL 总成交量： 10μL 注：X是用于cDNA合成的RNA的量。 2-3微克的RNA取决于RNA的浓度，将用于每一个反应，每个反应总体积应该是10μL。 - 将上述反应混合在热循环在65 ° C，4分钟。
- 从theromocyler取出的管子和至少2分钟，立即放在冰上。
- 第一链预混准备加入以下：
10X RT缓冲 2μL 25MM氯化镁2 4μL 0.1M的数码地面电视 2μL 核糖核酸酶进行 1μL - 9预混液添加到每个试管中的RNA样品，由pipeting混合和离心机的混合物简要。
- 管放置在热循环和42 ° C孵育2分钟
- 暂停的热循环，并添加1μL标II逆转录酶（Invitrogen公司），以每管。这一步应该是迅速完成。
- 样品在42℃孵育1.5小时。
- 终止反应，在70℃15分钟。
- 删除从热循环管，并置于冰上。
- 每个试管中加入1μl的RNase H的，将它们放置在热循环在37℃20分钟彗星。
- 热循环仪的样本后，在每管加入20μL无核酸酶水。每个样品量的一倍，在这个阶段。
- 检查使用2μL的样品，每个样品的浓度。每个样品等分，使用QRT - PCR20ng/μl的浓度。适量的水，以弥补样品浓度的20ng/μl将取决于初始浓度的合成cDNA。
四。 QRT - PCR：
参照基因的引物设计和测定
- 与熔融温度为60℃，产品尺寸〜100bp（TM）设计引物。
- AP - PERI1是用来作为本实验的基因利益。一个参考基因或内部控制是需要的数据以供日后分析和正常化。核糖体蛋白（AP - RP1）作为本实验的参考基因。
- 准备将用于引物，包括参照基因5um的股票。
制备标准
- 为了计算标准应被用来引物的效率。
- 制作的cDNA混合从不同的样本，将测试。
- 图中的每个点5倍的系列稀释。四稀释应该足够，但五是高度推荐。
- 多少分多少技术复制正在使用量会有所不同而有所不同。应该有足够使包括参照基因测试每一个基因的标准。
板模板
- 设计模板QRT - PCR板，每孔样品名称。请记住，包括每个基因的标准，至少有两个技术是每个样本重复。
设立循环参数
- QRT - PCR的机器上打开和进入循环参数。这个实验的循环参数如下：
第1步：- 1个循环：95℃3分钟
- 40个循环：95 ° C 15秒60℃30秒，其次是
（可选：包括以下步骤确定熔解曲线） 第3步： - 1个循环：95℃1分钟
- 1个周期：55℃1分钟
- 81个循环：55℃30秒
CFX96（BioRad公司）机板成立
- 准备掌握组合中的每个单独的管（包括参照基因）的基因。每口井，由主混音
核酸免费水 2μL 2.5 × SYBR GREEN 4μL 底漆向前 1μL 底漆反向 1μL 总成交量 8μL - 虽然准备的主结构包括1-2帐户额外的移液错误反应。
- 根据先前设计的模板，添加2μL（20毫微克/μL）的cDNA，每孔。然后，添加8μL的主结构，每孔，导致总量的10％μL反应。
- 移液器向上和向下（2 - 3X），以确保样品充分混合。检查没有液体停留在刀尖。为了避免交叉污染，每个样品使用一个新的提示。
- 一旦整个板块的设置，覆盖板，光学磁带。避免触摸磁带作为油脂的存在可以影响阅读。然后，离心1分钟的转速在500板，以确保所有产品在井是在盘底。
- 离心后，检查有没有冰或水盘底。最后，放置在QRT - PCR机板和运行PCR程序。
五实验图解
图1：流程图描绘的基因表达研究中的步骤的顺序。
图2：一）幼虫的EAB在中间夹层显示肠。二）孤立肠幼虫的EAB
图3：a）平均为peritrophin基因在不同的幼虫组织，包括角质层（铜），肠（MG）和脂肪体（FB），（AP - PERI1）的相对表达值（ REVS）。 EAB特定的核糖体蛋白（以下简称命名，AP - RP1）的正常化感兴趣的基因，AP - PERI1获得的数据作为内部控制。 b）相对倍数变化AP - PERI1幼虫组织。角质层组织表明，至少表达，因此，校准器（1X）样本（Pfaffl 2001年）。
图4：a）平均为peritrophin基因在不同发育阶段的EAB包括幼虫（第一，第二，第三和第四），prepupae（PP）和成年人（一）（AP - PERI1）的相对表达值（REVS） 。 EAB特定的核糖体蛋白（AP - RP1）的正常化感兴趣的基因，AP - PERI1获得的数据作为内部控制。 b）相对在不同发育阶段的变化对AP - PERI1倍。 PP抽样调查表明mRNA水平的水平，因此，校准器（1X样品）。
六。结论
实时定量PCR（QRT - PCR）是一种有效的工具来诊断，在不同的昆虫组织和发育阶段的mRNA水平。此外，QRT - PCR大多是从高通量基因表达分析，如芯片和新一代的RNA - Seq的产生的数据的主要工具，以验证。
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Discussion
获得每个样品定量RT - PCR板的阈值循环（CT）的价值。为了使标准曲线，Ct值，每个稀释度获得暗算其浓度的日志。实验样品的CT值，然后到这个系列稀释标准曲线的绘制。目标数量分别计算每一个实验，即组织和发育中的表达产生不同的标准曲线。相对表达值（REVS），然后确定内部控制获得的数量（AP - RP1）除以利益的目标序列的数量（在这种情况下，AP - PERI1 ）。计算的意义，每个基因的REVS的日志分析方差（方差分析）通过proc SAS（SAS Institute公司的SAS / STAT使用者指南，版本9.1）的混合程序。表达水平的意义P <0.05 。在组织的情况下，相对倍变化进行了计算校准器（1X样品，Pfaffl，2001）的角质层样品。因此，中肠和脂肪组织中的表达水平是相对的角质层。在发育中的表达情况下，prepupal样品作为校准器。对于这两项研究中，两个生物复制和使用三个技术复制。
我们的实验显示显着（P <0.05），肠组织中AP - PERI1成绩单水平较高（图3）相比，检测到的其他组织。在开发过程中的饲养阶段（即幼虫和成人）均显着（P <0.05）高于prepupae样品（图4）。最少的mRNA水平分别计算角质层和prepupae（图3＆4）。鉴于peritrophins是昆虫中肠，我们的研究结果证实了以前的研究结果在其他昆虫物种（Mittapalli等，2007）的一个组成部分。在发展阶段中观察到的模式，进一步证实AP - PER1消化和相关流程的功能。广泛使用的苏云金芽孢杆菌（Bt）的作物中的毒素，确实的目标和扰乱昆虫下午（Pauchet等，2009）。因此，在这项研究中所取得的成果不能只揭示EAB潜在的控制目标，但也提供侵入昆虫物种如何适应其新环境的基本知识。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们承认卢尔德三角洲Arrueta安特克拉（昆虫学系，美国俄亥俄州立大学/ OARDC，伍斯特，俄亥俄州）提供的实验设置的帮助。我们感谢发送EAB幼虫样品贷瑞莎波兰博士（美国农业部森林服务，网络实名制）。帮助路易斯一个卡纳斯和Nuris中号阿科斯塔博士用显微镜设置赞赏。为这个项目提供了资金由国家拨俄亥俄州农业研究和发展中心，美国俄亥俄州立大学和联邦基金。
References
- Lehane, M. J. Peritrophic matrix structure and function. Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).
- Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say]. Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).
- Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol. 39, 403-413 (2009).
- Pfaffl, W. M. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).
- Tellam, R. L. Biology of the Insect Midgut. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).
