Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr ( Agrilus planipennis) Med kvantitativa realtid-PCR

Summary

Kvantitativa realtids-PCR (QRT-PCR) är ett effektivt verktyg för att diagnostisera mRNA nivåer i olika insekter vävnader och utvecklingsstadier. I denna rapport visar vi att använda QRT-PCR för att fastställa mRNA nivåer i olika larver vävnader och utvecklingsstadier av de invasiva insektsarter, smaragd aska borr.

Abstract

Emerald aska borr (EAB,

Protocol

Den kompletta protokoll med olika steg skildras i flödesschemat i figur 1. Enskilda steg som utgör dissektion, är RNA-extraktion, First Strand cDNA syntes och QRT-PCR nedan.

I. Larvernas Dissection

1. Inför starten av detta förfarande, placera Emerald aska borr, eller EAB, larver på fuktigt mjukpapper tills dissektioner utförs. Håll nyberedd 1X fosfatbuffrad saltlösning eller PBS, på is för att hålla bufferten kallt i hela dissekering.
2. Till att börja fixa EAB larver på dissekering plattan med fina dissektion stift. Lägg sedan till kallt 1X PBS till dissekering plattan.
3. Först halshugga larver med ett fint par dissektion sax. Därefter ta bort de sista buken delen av larver.
4. Med hjälp av en urmakare pincett, lyfta nagelband från larver stommen. Sedan gör ett snitt längs med kroppen med hjälp av en sax. Se till att inte brista i tarmen som snitt görs.
5. Försiktigt isolera midgut vävnad från andra vävnader såsom fett organ och bindväv. Sedan, skölj vävnaden i färskt 1X PBS-buffert för att säkerställa att det inte finns någon förorening av fatbody. Överför isolerade midgut till 500 mikroliter av pre-kylda Trizol reagens i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
6. Därefter isolera fett kroppens vävnader med hjälp av pincett och överföra det till ett 1,5 ml Eppendorf-rör som innehåller 500 mikroliter av kylda Trizol reagens.
7. Slutligen isolera nagelband vävnad från larver djurkroppen genom skrotning av allt fastsittande vävnader, till att inte skada vävnader integritet. Skölj den isolerade fjällskiktet vävnaden i färsk PBS-buffert och överför den till ett 1,5 ml Eppendorf-rör med 500 mikroliter av kylda Trizol reagens.
8. De isolerade fett kroppen, nagelband och midgut vävnader kan förvaras vid -80 ° C till dess RNA-extraktion.
9. Som förberedelse för RNA-extraktion, sortera de olika EAB prov enligt utvecklingsstadier. Dessa skeden är 1: a, 2: a-, 3: e-, och 4: e-instars, prepupae och vuxna.

II. RNA-extraktion (enligt tillverkarens s protokoll för att använda Trizol Reagent)

Homogenisering

1. Till att börja RNA-extraktion, först använda plast pestles att homogenisera de vävnader i Trizol innehåller 1,5 ml Eppendorf-rör. Efter homogenisering, att den totala mängden av varje prov till1 ml med Trizol reagens.
2. För utvecklingsstadier, homogenisera hela djuret i flytande kväve med en mortel. Tillsätt sedan en alikvot av homogenatet (50 mikrogram) till 1 ml Trizol.

Fasseparation:

3. Inkubera provet rör med 1 mL Trizol i 15 minuter i rumstemperatur.
4. Efter inkubationen, tillsätt 200μL kloroform till varje rör. Omedelbart efter att du lagt kloroform och skaka rören kraftigt i ungefär 15 sekunder. Sedan inkubera rören i rumstemperatur i ytterligare 2-3 minuter.
5. Därefter centrifugeras proverna vid 12.000 xg under 15 minuter vid 2 ° C. Efter centrifugering, kommer RNA i vattenfasen. Volymen i vattenfasen bör vara 600 l, eller 60% av den totala Trizol volymen.

RNA nederbörd

6. Ta försiktigt bort bara vattenfasen. Förekomst av ämnen under vattenfasen kommer att orsaka förorening av extraherat RNA. Sedan Överför vattenfasen i en motsvarande märkning 1,5 ml Eppendorf-rör.
7. Att fälla ut RNA från vattenfasen, blanda 0,5 ml isopropylalkohol till varje rör. Inkubera proverna i rumstemperatur i 10 minuter. Efter inkubation, centrifugera rören vid 12.000 xgi 10 minuter vid 2 ° C.

RNA Tvätta

8. Efter centrifugering, kasta supernatanten från rören. RNA finns i gel-liknande pellets bildas på botten av röret. Tvätta pelleten med 75% etanol, lägga minst 1 mL av 75% etanol per 1 ml Trizol. Blanda genom att vortexa. Sedan centrifugera rören vid 7500Xg i 5 minuter vid 2 ° C.

RNA eluering

9. Kasta bort vätskefasen från rören. Centrifugera rören igen i litet bord centrifugera i 1 minut. Ta bort eventuella överskott supernatanten från röret genom noggrann pipettering. Låt röret öppnas och låt pellets lufttorka i 5-10 minuter. Var noga med att inte över torrt pelleten eftersom detta kommer att avsevärt minska dess löslighet.
10. Efter lufttorkning, Återsuspendera pelleten i diethylpyrocarbonate eller DEPC, renat vatten. Mängden vatten som används för att suspendera pelleten kommer att bero på storleken av pelleten. Använd 50 mikroliter av DEPC behandlade vattnet för ett SMAlla pellets eller 100 mikroliter för en stor pellet. Låt pelleten löses upp helt i DEPC behandlat vatten genom att flytta pipettspetsen upp och ner flera gånger.
11. När pellets har lösts upp, placera provet vid 55 ° C i 10 minuter.
12. Sedan mäter koncentrationen av varje RNA provet med en Nanodrop spektrofotometer (2 mikroliter av RNA prov).
13. Förvara RNA prover vid -80 ° C tills vidare användning.

III. Första Strand cDNA syntes (enligt tillverkarens s protokoll med Upphöjd first kit del syntesen genom Invitrogen.)

1. För varje RNA provet och tillsätt följande i ett PCR-rör:

   RNA	x l
   10 mM dNTP mix M	1μl
   Oligo (DT) (0,5 mikrogram / l)	1 l
   DEPC behandlat vatten	(8-x) l
   Total volym:	10 l
   OBS: x är volymen av RNA används för cDNA syntes. Beroende på koncentrationen av RNA kommer 2-3 mikrogram av RNA användas för varje reaktion och den totala volymen för varje reaktion bör vara 10 l.

2. Placera ovanstående reaktionsblandningen i en termocykler vid 65 ° C under 4 minuter.
3. Ta bort rören från theromocyler och placera dem på is omedelbart i minst 2 minuter.
4. Förbered första delen Mix Master genom att lägga till följande:

   10X RT Buffer	2μl
   25mm MgCl 2	4 l
   0,1 miljoner DTT	2 l
   RNas ut	1 l

5. Tillsätt 9 ìl av Master Mix till varje rör som innehåller RNA provet, blanda genom pipeting och centrifugera blandningen en kort stund.
6. Placera rören tillbaka i termocykler och inkubera i 2 minuter vid 42 ° C.
7. Pausa termocykler och tillsätt 1 ìl Upphöjd II omvänt transkriptas enzym (Invitrogen) till varje rör. Detta steg bör ske snabbt.
8. Inkubera proverna vid 42 ° C i 1,5 timmar.
9. Avsluta reaktionen vid 70 ° C i 15 minuter.
10. Ta bort rören från termocykler och placera dem på is.
11. Tillsätt 1 l av RNas H till varje rör och placera dem tillbaka i termocykler vid 37 ° C i 20 minuter.
12. Efter att proverna ur termocykler, tillsätt 20 ìl nukleasfritt vatten i varje rör. Volymen av varje prov fördubblas i detta skede.
13. Kontrollera koncentrationen av varje prov med 2 ìl av provet. Ta del av varje prov, för att göra koncentrationen av 20ng/μl för användning i QRT-PCR. Mängden vatten för att ge prov till en koncentration av 20ng/μl beror på den initiala koncentrationen av syntetiserade cDNA.

IV. QRT-PCR:

Primer design och fastställande av referens-genen

1. Design primers med en smälttemperatur (Tm) på 60 ° C och en produkt storlek på ~ 100 bp.
2. AP-PERI1 används som genen av intresse för detta experiment. En referens genen eller intern kontroll är nödvändig för senare analys och normalisering av data. Ribosomala protein (AP-RP1) används som referens genen för detta experiment.
3. Förbered 5uM arbetar lager av primers som kommer att användas, inklusive din referens gen.

Beredning av standarder

4. För att beräkna effektiviteten i grundfärger som används standarder som bör göras.
5. Gör en blandning av cDNA från de olika prover som ska testas.
6. Gör 5X seriella spädningar för varje önskad punkt i grafen. Fyra spädningar borde räcka, men fem rekommenderas starkt.
7. Volymen varierar beroende på hur många poäng och hur många tekniska replikat som används. Det borde räcka för att göra en standard för varje gen som ska testas, inklusive referens genen.

Plate Mall

8. Designa en mall som visar prov namn för varje brunn i QRT-PCR-platta. Kom ihåg att inkludera normer för varje gen och minst två tekniska replikat per prov.

Ställ in cykling parametrar

9. Vrid QRT-PCR-maskin på och ange cykling parametrar. Den cykling parametrarna för detta experiment är följande:
   Steg 1:
   • 1 cykel: 95 ° C 3 min
   Steg 2:
   • 40 cykler: 95 ° C 15 sekunder följt av 60 ° C 30 sek
     (Tillval: för att bestämma den smältande kurvan omfatta följande steg)
   Steg 3:
   • 1 cykel: 95 ° C 1 min
   Steg 4:
   • 1cycle: 55 ° C 1 min
   Steg 5:
   • 81 cykler: 55 ° C 30 sek

Plate inställd för CFX96 (BioRad) maskin

11. Förbered Master Mix till varje gen (inklusive referens-genen) i separata rör. För varje brunn består befälhavaren blandning av

    Nukleasfritt fritt vatten	2μl
    2,5 X SYBR gröna	4 l
    Primer framåt	1 l
    Primer omvänd	1 l
    Total volym	8 l

12. Vid utarbetandet av Master Mix inkluderar 1-2 extra reaktioner till svars för pipettering fel.
13. Enligt den tidigare designat mallen, tillsätt 2 mikroliter (20 ng / l) av cDNA i varje brunn. Lägg sedan till 8 mikroliter av Master Mix till varje brunn, vilket ger en total volym på 10 mikroliter per reaktion.
14. Pipettera upp och ner (2-3X) för att säkerställa att provet är väl blandat. Kontrollera att ingen vätska kvar på toppen. För att undvika korskontaminering, använd en ny spets för varje prov.
15. När hela plattan är inställt, täcka plattan med optiska tejp. Undvik att röra bandet som förekomsten av fett kan påverka avläsningen. Sedan, centrifugera plattan vid 500 rpm i 1 minut för att säkerställa att alla produkter i brunnarna ligger i botten av plattan.
16. Efter centrifugering, kontrollera att det inte finns någon is eller vatten på botten av plattan. Slutligen, placera plattan i QRT-PCR-maskin och köra PCR-programmet.

V. Schematisk representation av experimentet

Figur 1: Flödesschema skildrar ordningsföljd av steg för genuttryck studien.

Figur 2: A) larver EAB dissekering visar midgut i mitten. B) isolerade midgut av larver EAB

Figur 3: A) genomsnittliga relativa uttryck värden (varvtal) för en peritrophin gen (AP-PERI1) i olika larvernas vävnader inklusive nagelband (Cu), midgut (MG) ​​och fett organ (FB). En EAB specifika ribosomala protein (häri heter, AP-RP1) användes som intern kontroll för att normalisera de uppgifter som erhålls för den gen, AP-PERI1. B) Relativ faldig förändring av AP-PERI1 i larvernas vävnader. Nagelbanden vävnaden visade minsta uttryck och därför togs som kalibratorn (1X) prov (Pfaffl, 2001).

Figur 4: A) genomsnittliga relativa uttryck värden (varvtal) för en peritrophin gen (AP-PERI1) i de olika utvecklingsstadierna i EAB inklusive larver instars 1: a (, 2, 3 och 4), prepupae (PP) och vuxna (A). En EAB specifika ribosomala protein (AP-RP1) användes som intern kontroll för att normalisera de uppgifter som erhålls för den gen, AP-PERI1. B) Relativ faldig förändring av AP-PERI1 i olika utvecklingsstadier. PP prov visade minsta nivå av mRNA nivåer och därför togs som kalibratorn (1X prov).

VI. Slutsats

Kvantitativa realtids-PCR (QRT-PCR) är ett effektivt verktyg för att diagnostisera mRNA nivåer i olika insekter vävnader och utvecklingsstadier. Vidare har QRT-PCR mest varit det viktigaste verktyget för att validera data som genereras från hög uttryck genomströmning gen analyser såsom microarrays och den nya generationen RNA-Seq.

Discussion

Tröskeln cykler (Ct) värde erhålls för varje prov i QRT-PCR-platta. För att göra standardkurvan, var Ct värde som erhålls för varje spädning plottad mot stocken av sin koncentration. Den Ct-värden för de experimentella späddes sedan ritas in på denna spädningsserie standardkurvan. Mål mängder har beräknats från olika standard kurvor genereras för varje experiment, dvs vävnad och utvecklande uttryck. Den relativa uttrycket värden (varv) var bestäms sedan genom att dividera mängden av målet sekvens av intresse (i detta fall AP-PERI1) med den mängd erhålls för intern kontroll (AP-RP1). För beräkningar av betydelse, var stockarna av varvtal för varje gen analyseras med ANOVA (analys av varians) med PROC BLANDAD proceduren i SAS (SAS Institute Inc. SAS / STAT Användare s Guide, version 9.1). Betydelse i uttrycket nivå bestämdes vid p <0,05. Relativ gånger förändringar i fråga om vävnader har beräknats genom att ta nagelbanden provet som kalibratorn (1X prov, Pfaffl, 2001). Därför har uttrycket nivåer i midgut och fett organ i förhållande till nagelbanden. Vid utvecklingsuttryck var prepupal prov tas som kalibrator. För båda studierna replikerar två biologiska och tre tekniska replikat användes.

Vårt experiment visade signifikant (p <0,05) högre nivåer av AP-PERI1 avskrift i midgut vävnad (Fig. 3) jämfört med andra vävnader analyseras. Under utvecklingen utfodring stadier (dvs larver instars och vuxna) var signifikant (p <0,05) högre än prepupae prov (bild 4). De minst mRNA nivåerna beräknades för nagelband och prepupae (bild 3 & 4). Med tanke på att peritrophins är en integrerad del av insekten midgut våra resultat bekräftar tidigare fynd i andra insektsarter (Mittapalli et al. 2007). De mönster som observerades under utvecklingsstadierna ytterligare bekräftas funktionen av AP-PER1 matsmältningen och relaterade processer. Den allmänt använda Bacillus thuringiensis (Bt) toxiner i grödor mål verkligen och störa PM hos insekter (Pauchet et al., 2009). Därför kan resultaten i denna studie inte bara avslöja potentiella kontroll mål för EAB, men också ge grundläggande kunskaper om hur invasiva insektsarter anpassa sig till sina nya miljöer.