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Summary
Hier stellen wir eine Kombination aus effektiver Rattenrestriktion und Subclaviavenenpunktionsmethoden vor, die eine schnelle, sichere und wiederholte Blutentnahme bei Ratten ohne Anästhesie ermöglichen.
Abstract
Es gibt mehrere etablierte Methoden zur Gewinnung wiederholter Blutproben von Ratten, wobei die am häufigsten verwendeten Methoden die laterale Schwanzvenenentnahme ohne Anästhesie und die Jugularvenenentnahme mit Anästhesie sind. Die meisten dieser Methoden erfordern jedoch Hilfe und Anästhesiegeräte und werfen manchmal Schwierigkeiten in Bezug auf die Blutentnahme oder die schlechte Qualität der Blutproben auf. Darüber hinaus verbrauchen diese Methoden der Blutentnahme viel Zeit und personelle Ressourcen, wenn bei einer großen Anzahl von Ratten wiederholte Blutentnahmen erforderlich sind. In dieser Studie wird eine Technik zur wiederholten Blutentnahme bei nicht anästhesierten Ratten durch eine einzelne kompetente Person vorgestellt. Sehr zufriedenstellende Blutproben können durch Punktion der Vena subclavia gewonnen werden. Die Methode zeigte eine beeindruckende Gesamterfolgsrate von 95 % mit einer medianen Zeit von nur 2 Minuten von der Fixierung der Ratte bis zum Abschluss der Blutentnahme. Darüber hinaus fügt die Durchführung von aufeinanderfolgenden Blutentnahmen innerhalb des vorgesehenen Bereichs den Ratten keinen Schaden zu. Diese Methode ist es wert, für die Blutentnahme gefördert zu werden, insbesondere in groß angelegten pharmakokinetischen Studien.
Introduction
Ratten gehören zu den häufigsten Versuchstieren, und es gibt viele Möglichkeiten, Blutproben zu gewinnen. Bei Experimenten mit einer einzigen Blutentnahme in der Schlussphase kann eine ausreichende Menge Blut durch Herzpunktion oder Blutentnahme aus der Bauchaorta gewonnen werden1. Einige Studien erfordern jedoch eine wiederholte Blutentnahme von Ratten für routinemäßige Blut- oder biochemische Analysen, insbesondere bei pharmakokinetischen und toxikologischen Studien, bei denen eine wiederholte Blutentnahme erforderlich ist, um die Resorption, Verteilung und den Metabolismus von Arzneimitteln zu bestimmen2.
Obwohl die Blutentnahme aus der Schwanzvene die häufigste Methode für die Blutentnahme von Ratten ist, obwohl keine Anästhesie erforderlich ist, kann diese Methode bei wiederholten Blutentnahmen eine Herausforderung darstellen, und die Menge des entnommenen Blutes ist relativ gering 3,4. Obwohl Blut aus den Stamm- und Penisvenen entnommen werden kann, ist die gewonnene Blutmenge begrenzt und eine Anästhesie ist erforderlich 1,5. Darüber hinaus liefern Blutproben, die aus dem submandibulären Venenplexus sowie aus den Venen sublingual, jugularis und subclavia entnommen werden, qualitativ hochwertigere Proben, erfordern jedoch in der Regel eine Anästhesie oder die Unterstützung mehrerer Personen 1,6,7,8,9. Schließlich erfordert die retroorbitale Sinus-/Kanalblutentnahme nicht nur eine Anästhesie, sondern kann auch zu Verletzungen und Stress bei den Ratten führen9.
Die Qualität von Blutproben, die typischerweise aus großen Venen gewonnen werden, entspricht in der Regel dem höchsten Standard1. Gegenwärtig haben einige Studien ergeben, dass die kontinuierliche Mikroprobenahme durch die Halsvene eine sehr geeignete Methode für die toxikologische Forschung an Ratten ist, obwohl diese Methode in der Regel eine Halsvenenkatheterisierung erfordert 10,11,12. Daher lohnt es sich zu erforschen, wie man ohne chirurgischen Eingriff qualitativ hochwertige Blutproben nach dem 3R-Prinzip der Tierversuche gewinnen kann. Das Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur effizienten Entnahme von Blut aus der Vena subclavia bei Ratten vorzustellen. Diese Technik ermöglicht die schnelle Entnahme zufriedenstellender Proben durch ein Ein-Personen-Verfahren, ohne dass eine Anästhesie erforderlich ist.
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Protocol
Diese Studie entsprach den Richtlinien der 8. Auflage des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren13. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Lanzhou University Second Hospital genehmigt und in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien 2.014 dokumentiert. Zwölf gesunde Wistar-Ratten (sechs Männchen mit einem Gewicht von 290-330 g und sechs Weibchen mit einem Gewicht von 250-280 g) im Alter von 12-16 Wochen wurden vor dem eigentlichen Experiment für 3 Tage im GLP-Tierlabor der Universität Lanzhou untergebracht. Die verwendeten Rattenkäfige waren vom Typ R5 mit den Maßen 545 mm x 395 mm x 200 mm und mit autoklaviertem Einstreumaterial ausgestattet. Alle Ratten erhielten uneingeschränkten Zugang zu Futter und Wasser. Das Labor hatte eine durchschnittliche Luftfeuchtigkeit von 25 %, eine Durchschnittstemperatur von 24 °C und einen Lichtzyklus, der zwischen Tag und Nacht wechselte (7:00 Uhr/19:00 Uhr). Am Ende der Studie wurden alle Tiere mit einer Überdosis Isofluran auf humane Weise eingeschläfert. Umfassende Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Materialien und Instrumenten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Berechnung der Stichprobengröße und Auswahl der Tiere
- Wählen Sie die Ressourcengleichungsmethode15 aus, um die Stichprobengröße des Tieres anhand von Gleichung (1) zu schätzen.
E = Gesamtzahl der Tiere − Gesamtzahl der Gruppen (1)
Dabei ist E der Freiheitsgrad der Varianzanalyse (ANOVA) und reicht von 10 bis 20.
HINWEIS: In dieser Studie wurden 12 Tiere in zwei Gruppen A und B eingeteilt (drei Männchen und drei Weibchen pro Gruppe). - Definieren Sie den primären Endpunkt dieser Studie als die Erfolgsrate und den Zeitaufwand der wiederholten Blutentnahme durch eine einzelne Person.
- Definieren Sie die sekundären Endpunkte als Veränderungen des Körpergewichts der Ratte, der Nahrungs- und Wasseraufnahme sowie der Häufigkeit unerwünschter Ereignisse (wie Schlüsselbeinfrakturen, subkutane Hämatome, Pneumothorax und Mortalität).
- Definieren Sie eine erfolgreiche Blutentnahme als Erfüllung der folgenden Kriterien: i) weniger als drei Punktionen für eine einzige Blutentnahme; ii) eine Gesamtzeit (von der Fixierung der Ratte bis zur Beendigung der Blutentnahme) von höchstens 5 Minuten; und iii) das Erreichen des angestrebten Blutvolumens bei gleichzeitiger Gewinnung von klarem Plasma. Betrachten Sie jede Abweichung von diesen Kriterien als Stichprobenfehler.
2. Fixierung der Tiere und Blutentnahme
HINWEIS: Blutproben von Ratten der Gruppen A und B wurden von zwei erfahrenen Forschern entnommen, die beide mindestens 100 Blutproben entnommen hatten. Von beiden Rattengruppen wurden über einen Zeitraum von 4 Tagen insgesamt 96 Mal Blutproben entnommen. Diese Blutentnahmemethode erfordert keine Anästhesie oder zusätzliche Fixiervorrichtungen für die Ratten. Es erfordert jedoch geschickte Handhabungstechniken.
- Am Tag vor der Blutentnahme (Tag 1) um 8:00 Uhr wird jede Ratte in ihren eigenen Käfig eingeteilt, während Futter und Wasser gewogen werden. Lassen Sie dann einen anderen Forscher, der für die Messungen blind ist, ab Tag 1 jeden Tag um 8:00 Uhr das Gewicht, die Nahrungsaufnahme und die Wasseraufnahme der Ratten aufzeichnen.
- Um dieses Protokoll zu befolgen, nehmen Sie jeden Tag zuerst um 10:00 Uhr und dann um 22:00 Uhr Blut ab, wobei abwechselnd 0,15 ml Blut aus den Venen subclavia auf beiden Seiten entnommen werden.
HINWEIS: Die zu entnehmende Blutmenge wurde durch das maximale Volumen bestimmt, das die Ratte mit dem niedrigsten Gewicht innerhalb einer Woche vertragen konnte. - Spülen Sie eine Spritze mit Natriumheparin (25 U/ml) und desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Alkohol.
- Streicheln Sie vorsichtig über die Rückenhaut der Ratte und kneifen Sie wiederholt in den Hals, um der Ratte zu helfen, sich zu entspannen (Video 1).
- Greifen und heben Sie mit dem Daumen und Zeigefinger der nicht dominanten Hand die Halshaut der Ratte fest an (Abbildung 1A und Video 1).
- Verwenden Sie mit der Koordination der dominanten Hand die verbleibenden drei Finger und die Handfläche der nicht-dominanten Hand, um die Rückenhaut der Ratte zu sichern und ihre vorderen Gliedmaßen zu immobilisieren (Abbildung 1B, C und Video 2).
HINWEIS: Wenn die Ratte Widerstand leistet oder sich wehrt, kann dieser Vorgang mehrmals wiederholt werden, um der Ratte zu helfen, sich an die Handhabung zu gewöhnen. Die folgenden Schritte sind der Schlüssel zu einer erfolgreichen Blutentnahme. - Drücken Sie mit dem Zeigefinger der nicht-dominanten Hand sanft auf die Kopfhaut der Ratte, während die anderen Finger zusammen mit der Handfläche helfen, das Schultergelenk nach außen zu drehen. Verwenden Sie während dieses Vorgangs die dominante Hand, um das Schultergelenk der Ratte vollständig zu strecken (Abbildung 1D-F und Video 2).
- Fassen Sie die Ratte fest mit der nicht-dominanten Hand, um den Kopf und den Körper der Ratte in einer geraden Linie auszurichten (Abbildung 1G,H). Verwenden Sie dann die dominante Hand, um die Position des Schlüsselbeins zu lokalisieren und die Einstichstelle zu bestätigen (Abbildung 1I, Video 2 und Video 3).
HINWEIS: Das Rasieren der Ratte ist nicht notwendig. In Abbildung 1 wurde nur rasiert, um die Schlüsselbein- und Punktionsposition stärker zu zeigen. Bei der Fixierung von Ratten, insbesondere Ratten >350 g, hilft es, der Ratte zu erlauben, ihre Füße auf einer festen Oberfläche abzulegen, um ihr Körpergewicht zu stützen. Darüber hinaus sollte der Fixierer die Atemfrequenz jeder Ratte überwachen, während er Blut entnimmt, um sicherzustellen, dass die Fessel nicht zu fest sitzt, was zu Atemnot führen kann. - Halten Sie die Spritze parallel zum Körper der Ratte in der dominanten Hand, wobei die Nadelspitze nach oben zeigt und die Spritzenskala zum Versuchsleiter zeigt, und halten Sie einen Winkel von etwa 15° zur Mittellinie des Rattenkörpers. Führen Sie die Nadel 0,5 cm unterhalb der Schlüsselbeinkerbe (an der Verbindung des proximalen Drittels des Schlüsselbeins und des Brustbeins) ein und achten Sie darauf, dass die Nadel parallel zum Körper der Ratte bleibt (Abbildung 1J und Video 3).
HINWEIS: Besonderes Augenmerk sollte auf den Winkel und die Tiefe der Nadeleinführung gelegt werden, um ein Durchstechen des Blutgefäßes oder eine versehentliche Beschädigung benachbarter Gefäße zu vermeiden. - Ziehen Sie die Spritze vorsichtig leicht zurück, um einen Unterdruck zu erzeugen, der oft von einem spürbaren Durchbruchsgefühl beim Eintritt in das Blutgefäß begleitet wird (besonders ausgeprägt während der anfänglichen Blutentnahme). Halten Sie diese Position und entnehmen Sie bei Bedarf 0,1-1,0 ml Blut mit konstanter Geschwindigkeit (gemäß den IACUC-Richtlinien von ca. 4-5,3 ml/kg Blut pro Woche1) (Abbildung 1K und Video 3).
- Wenn bei der Punktion kein Blut vorhanden ist, versuchen Sie, den Winkel und die Tiefe der Nadel vorsichtig einzustellen oder die Spritze vorsichtig zu drehen (Video 3). Wenn drei aufeinanderfolgende Versuche auf derselben Seite erfolglos sind, stoppen Sie alle Blutungen und wechseln Sie dann für die Punktion auf die gegenüberliegende Seite.
HINWEIS: Eine schnelle Punktion durch die Haut ist ratsam, um zu verhindern, dass die Ratte aufgrund von Beschwerden zu kämpfen hat. - Legen Sie ein Wattestäbchen zur Hämostase an und bringen Sie die Ratte in ihren Käfig zurück (Video 4).
- Bereiten Sie die Blutproben entsprechend den experimentellen Anforderungen auf.
3. Verarbeitung von Blutproben
- Entsorgen Sie die Spritzennadel in einem Behälter für scharfe und scharfe Gegenstände. Das entnommene Blut wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das zuvor mit Heparin gespült wurde. Stellen Sie das Röhrchen in eine Zentrifuge, stellen Sie es auf 4 °C und 1.200 x g ein und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang, um das Plasma abzutrennen. Das Serum wird mit einer 1,0-ml-Pasteurpipette in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -80 °C gelagert.
HINWEIS: Um eine Hämolyse aufgrund von Druck zu verhindern, entfernen Sie bei Bedarf die Nadelspitze. Vermeiden Sie während der Plasmaaspiration die Entnahme von Blutzellen vom Boden des Röhrchens. Gelegentlich kann sich auf der Oberfläche der Spritze Rattenfell sammeln. Achten Sie darauf, dass kein Fell in die Röhre gelangt, da dies zu Gerinnseln führen kann.
4. Statistische Analyse
- Stellen Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dar und testen Sie sie auf Homogenität der Varianz.
- Verwenden Sie den exakten Fisher-Test, um die Erfolgsquoten zwischen den Gruppen zu vergleichen.
- Verwenden Sie einen unabhängigen t-Test mit zwei Stichproben, um die Gesamtmittelwerte zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen.
- Verwenden Sie die Varianzanalyse (ANOVA) für kontinuierliche Messungen wie Blutentnahmezeit, Körpergewicht, Nahrungsaufnahme und Wasserverbrauch. Betrachten Sie P < 0,05 als statistisch signifikant.
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Representative Results
Hochwertige Plasmaproben weisen einen blassgelben Farbton, Klarheit und Transparenz auf, frei von jeglichem Rotstich oder Blutgerinnung, wie in Abbildung 2A dargestellt. Abbildung 2B zeigt die Hämolyse (linke Seite) bzw. die Gerinnung (rechte Seite) als Folge unsachgemäßer Eingriffe. Im Verlauf von 96 Blutabnahmesitzungen innerhalb von 4 Tagen betrugen die durchschnittlichen Einzelblutabnahmezeiten für die Gruppen A und B 119,87 ± 33,62 s bzw. 123,28 ± 30,96 s. Es gab keinen signifikanten Unterschied in den täglichen Blutentnahmezeiten zwischen den beiden Gruppen (t = 0,66, P = 0,54, Tabelle 1). Die kürzesten individuellen Blutentnahmezeiten betrugen 78 s bzw. 89 s.
Die durchschnittliche Anzahl der Versuche, die für eine erfolgreiche Einzelblutentnahme erforderlich waren, betrug 1,21 bzw. 1,17 für die Gruppen A und B. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Versuche zwischen den beiden Gruppen (t = 0,58, P = 0,60, Tabelle 2). Die Gesamterfolgsraten betrugen 93,8 % (45/48) bzw. 95,8 % (46/48) für die Gruppen A und B, wobei es keinen signifikanten Unterschied in den Gesamterfolgsraten zwischen den beiden Gruppen gab (P > 0,05, Tabelle 1). Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Zeit der Blutentnahme in Gruppe B zu jedem Zeitpunkt. In Gruppe A war die Blutentnahmezeit am zweiten Tag kürzer als am vierten Tag (105,75 ± 14,22 s vs. 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabelle 1) aus. Darüber hinaus deuten mehr Versuche und längere Punktionszeiten oft auf höhere Ausfallraten hin (Abbildung 3A-C). Am dritten Tag trat in Gruppe B ein Versagen auf, das auf Hämolyse zurückzuführen war. Am vierten Tag gab es in Gruppe A drei Misserfolge: einen aufgrund von Hämolyse und die anderen beiden aufgrund der Unfähigkeit, Blutproben zu erhalten. In Gruppe B kam es ebenfalls zu einem Ausfall, da keine Blutprobe entnommen werden konnte.
Im Verlauf von 4 aufeinanderfolgenden Beobachtungstagen zeigten beide Rattengruppen eine stetige Gewichtszunahme. Die Wasser- und Nahrungsaufnahme blieb bei Ratten des gleichen Geschlechts relativ konstant. Während des gesamten Blutentnahmeprozesses gab es keine Fälle von Rattensterblichkeit und es wurden auch keine signifikanten Komplikationen wie Schlüsselbeinfrakturen, Pneumothorax oder Hämatome an der Punktionsstelle beobachtet (Abbildung 3D-F und Tabelle 3).
Abbildung 1: Fixations- und Blutentnahmemethoden der Vena subclavia bei Ratten. (A-H) Manipulation der Fixierung; i) Lage der Schlüsselbein- und Blutentnahmestelle; (J-L) der Prozess der Blutentnahme und Hämostase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Erfolgreich und erfolglos entnommene Blutproben. (A) Typische Blutproben und isoliertes Plasma; (B) hämolysierte (links) und koagulierte (rechts) Blutproben Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit der Blutentnahme. (A) Durchschnittliche Zeit der Blutentnahme pro Tag; (B) durchschnittliche Anzahl von Reifenpannen pro Tag; c) die Erfolgs- und Misserfolgsraten der Blutentnahme in beiden Gruppen; (D-F) Veränderungen des Körpergewichts, der Nahrungsaufnahme und der Wasseraufnahme während der Blutentnahme in beiden Gruppen von Ratten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Anatomie der Rattenhalsgefäße. (A) Oberflächliche anatomische Strukturen; (B) tiefe anatomische Strukturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppe | Zeit | Durchschnittliche Blutentnahmezeit(en) | |||
| Tag 1 | Tag 2* | Tag 3 | Tag 4 | ||
| Ein | 10:00 Uhr | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 Uhr | 108,67 ± 10,86 | 111,00 ± 6,95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Durchschnittliche Verweildauer | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138.08 ± 48.07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Erfolgsquote | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Gesamterfolgsquote | 93.8% (45/48) | ||||
| Durchschnittliche Gesamtzeit | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 Uhr | 98,17 ± 7,24 | 110,17 ± 14,33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 Uhr | 106.00 ± 14.35 Uhr | 126,67 ± 17,12 | 123,17 ± 17,50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Durchschnittliche Verweildauer | 102.08 ± 12.02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Erfolgsquote | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Gesamterfolgsquote | 95.8% (46/48) | ||||
| Durchschnittliche Gesamtzeit | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabelle 1: Blutentnahmezeiten und Erfolgsraten der beiden Rattengruppen. *Die Blutentnahmezeit des zweiten Tages war kürzer als die des vierten Tages in Gruppe A (t = 12,39 P < 0,01).
| Gruppe | Zeit | Durchschnittliche Anzahl der Reifenpannen | |||
| Tag 1 | Tag 2 | Tag 3 | Tag 4 | ||
| Ein | 10:00 Uhr | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 Uhr | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Durchschnitt | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Gesamtdurchschnitt | 1.21 | ||||
| B | 10:00 Uhr | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 Uhr | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Durchschnitt | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Gesamtdurchschnitt | 1.17 | ||||
Tabelle 2: Mittlere Anzahl der Punktionen zur Blutentnahme bei Ratten.
| Geschlecht | Gruppe | Gewicht (g) | Nahrungsaufnahme (g) | Wasseraufnahme (g) | |||||||||
| Tag 1 | Tag 2 | Tag 3 | Tag 4 | Tag 1 | Tag 2 | Tag 3 | Tag 4 | Tag 1 | Tag 2 | Tag 3 | Tag 4 | ||
| ♀ | Ein | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5,4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| T/Q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Angepasster P-Wert | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | Ein | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25,3 ± 1,1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Angepasster P-Wert | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabelle 3: Veränderungen des täglichen Körpergewichts, der Nahrungsaufnahme und der Wasseraufnahme von Ratten.
Video 1: Beruhigung und Umgang mit Ratten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Eindämmungsverfahren für Ratten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Die Blutentnahme bei Ratten. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 4: Hämostatische Kompression an der Einstichstelle. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Obwohl die Blutentnahme der Schwanzvene die häufigste Methode zur wiederholten Blutentnahme bei Ratten ist, kann sie durch Anästhesiemedikamente beeinflusst werden, und aufgrund der geringen Größe der Schwanzvene ist die Blutmenge, die in einem einzigen Fall entnommen werden kann, begrenzt, was zu einer längeren Blutentnahmedauer führt 4,5. Obwohl Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Systeme in Kombination mit Kapillarmikroprobenahme (CMS) von Rattenschwanzvenen die Blutmenge bei Ratten reduzieren können11, sind nicht alle Einrichtungen mit dieser teuren Ausrüstung ausgestattet. Die Entnahme von Blut aus dem retrobulbären Plexus/Sinus verursacht bei Ratten oft Angst und Schmerzen, und eine unsachgemäße Bedienung kann sogar das Sehvermögen und die Gesundheit von Ratten schädigen. Daher wird diese Methode nicht für die Blutentnahme bei Ratten empfohlen9.
Die Vena subclavia befindet sich zwischen dem Musculus pectoralis major und dem Musculus deltoideus der Ratte und mündet an einem Drittel des inneren Schlüsselbeins in die Vena jugularis (Abbildung 4). In der Studie von Yang et al. betrug die Erfolgsrate der Blutentnahme aus der Vena subclavia bei Ratten unter Narkose etwa 90 % durch einen erfahrenen Operateur, dessen minimale Zeit vom Beginn bis zum Ende der Punktion 65 sbetrug 7. In der Studie von Wang et al. wurden Blutproben aus der Vena subclavia der Ratte mit einem vertikalen Ansatz entnommen. Obwohl ihre Methode keine Anästhesie beinhaltete, erforderte sie die Zusammenarbeit von zwei Individuen, um die Ratte sicher einzuschränken6. Dieses Studienprotokoll zeigt einen guten Vorteil der Blutentnahme. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Rückhaltevorrichtungen oder Anästhesieeinrichtungen. Bei sachgemäßer Handhabung zeigen Ratten in der Regel einen minimalen Widerstand. Die mediane Zeit von der Fixierung der Ratte bis zum Abschluss der Blutentnahme betrug nur 2 Minuten, was zu einer beeindruckenden Gesamterfolgsrate von 95 % führte. Diese Methode schont die menschlichen Ressourcen erheblich und reduziert den Zeitaufwand für die Blutentnahme. Darüber hinaus sind die erhaltenen Plasmaproben klar und transparent, mit minimalem Auftreten von Hämolyse- und Gerinnungsereignissen, wodurch die Wiederholung des Experiments minimiert wird. Die Beherrschung dieser Technik ist besonders wertvoll für die Durchführung von groß angelegten pharmakokinetischen und toxikologischen Experimenten an Ratten, die eine wiederholte Blutentnahme erfordern.
In unserer Studie trat das häufigste Versagen der Blutentnahme an Tag 4 auf, was mit den venösen Schäden zusammenhängen könnte, die durch wiederholte Punktionen verursacht wurden. Wiederholte Punktionen können zu einer Schädigung der Gefäßwand führen und eine Entzündungsreaktion hervorrufen, die dazu führt, dass sich die Gefäßwand verdickt und verhärtet und sogar eine Gefäßverengung hervorruft. Wenn die Blutstillung nach der Punktion unzureichend ist, kann das extravasierte Blut weitere Gewebeödeme und Entzündungen verursachen, die in der Folge zur Bildung von Narbengewebe führen. Dieses Narbengewebe ist schwer zu durchdringen und kann auch ziehen und dazu führen, dass sich die Position der Blutgefäße verschiebt, was es schwieriger macht, die Blutgefäße zu lokalisieren und zu punktieren. In unserer Studie wurde eine 26G-Spritze (0,45 mm) für die Blutentnahme verwendet, was im Vergleich zu menschlichen Venen in Ordnung ist, aber immer noch erhebliche Schäden an Rattenvenen verursacht. Dies zeigt sich in dem deutlichen Penetrationsgefühl, wenn die Nadel während der ersten Blutentnahme durch das Gefäß führt, das mit zunehmender Anzahl der Blutentnahmen abnimmt, mit längeren Blutentnahmezeiten und höheren Misserfolgsraten. Daher empfehlen wir, eine feinere Insulinnadel für die Blutentnahme zu verwenden, und nach der Blutentnahme sollte ausreichend Druck ausgeübt werden, um die Bildung von Hämatomen zu verhindern, und es sollten alternative Blutentnahmen durchgeführt werden, um eine ausreichende venöse Reparatur zu ermöglichen. Unserer Erfahrung nach kann ein gut ausgebildeter Phlebotomiker mit einer 26G-Nadel abwechselnd 8-10 Mal innerhalb von 24 Stunden Blut aus den bilateralen Venen des Schlüsselbeins subclavia derselben Ratte entnehmen, mit einem durchschnittlichen Abstand von 2-3 Stunden zwischen den einzelnen Blutentnahmen. Die maximale Anzahl von Blutentnahmen, die eine Ratte tolerieren kann, die Erholungsphase und der Blutentnahmezyklus können jedoch durch die verwendete Nadelstärke, die für verschiedene Experimente erforderlichen Blutabnahmeintervalle und die Kompetenz des Phlebotomisten beeinflusst werden. Diese Faktoren müssen in zukünftigen Forschungen weiter erforscht werden. Für intensive Blutentnahmen, die für pharmakokinetische Experimente erforderlich sind, ist es besser, abwechselnd Blut aus der linken und rechten Vena subclavia zu entnehmen. In Fällen, in denen es wirklich nicht verfügbar ist, können andere Methoden der Blutentnahme ergänzt werden.
Körpergewicht, Wasserverbrauch und Nahrungsaufnahme sind die grundlegendsten und einfachsten Indikatoren zur Beurteilung des Gesundheitszustands von Ratten16. Eine frühe Studie hatte gezeigt, dass eine Blutentnahme über die Halsvene von weniger als 0,9 ml pro Tag die Hämodynamik von Ratten nicht beeinträchtigte und zu keinem signifikanten Gewichtsverlust führte. Wenn die Blutentnahme jedoch 1,5 ml überschreitet, kann dies zu Gewichtsverlust führen17. In der Studie von Yokoya et al. hatte die wiederholte Mikroprobenahme aus der Halsvene (jeweils 50 μl, 6-7x innerhalb von 24 h) keinen Einfluss auf das Körpergewicht oder die Nahrungsaufnahme der Ratte10. Darüber hinaus kann die Art und Weise der Blutentnahme das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme von Ratten beeinflussen. In einer früheren Studie mit sublingualer Venenblutentnahme führte eine 24-stündige Entnahme von 0,5-1,0 ml Blut am ersten Tag zu einer Verringerung des Körpergewichts der Ratte und einer verringerten Nahrungsaufnahme, obwohl der Gewichtsverlust nicht signifikant war18. In dieser Studie nahm das Körpergewicht der Ratten während der Blutentnahme stetig zu, und es gab keine signifikanten Veränderungen in der Nahrungs- und Wasseraufnahme, Komplikationen im Zusammenhang mit der Blutentnahme und Tod der Ratten, was darauf hindeutet, dass diese Methode sicher und zuverlässig ist.
Es ist wichtig zu betonen, dass die Gewöhnung der Ratten an den Fixierungsprozess vor der Blutentnahme wahrscheinlich den Stress bei der Ratte verringert und die Erfolgsrate der Blutentnahme verbessert. Eine unzureichende Fixierung und eine unzureichende Freilegung der Venen können zu Fehlern bei der Blutentnahme führen und sogar zu einem lokalen Venenriss führen, da die Ratten mit Schmerzen zu kämpfen haben. In leichteren Fällen kann dies zu auffälligen subkutanen Hämatomen führen, während es in schweren Fällen zu Rattensterben führen kann. Darüber hinaus kann eine schlechte Fixierung dazu führen, dass Ratten entkommen und Individuen Schaden zufügen. Daher empfehlen wir dringend, die Handhabungstechnik gründlich zu beherrschen, bevor Sie mit der Blutentnahme fortfahren. Darüber hinaus ist es wichtig, mit der Kraft, die für die Rotation des Schultergelenks nach außen ausgeübt wird, vorsichtig zu sein, da ein übermäßiger Druck bei der Ratte zu Schlüsselbeinfrakturen führen kann.
Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass wir die durch diese Blutentnahmemethode induzierten Veränderungen des Stresses bei Ratten nicht systematisch durch Messung der Veränderungen des Corticosteronspiegels oder durch käfigseitiges Monitoring bewertet haben, was in zukünftigen Forschungen untersucht werden muss. Eine weitere Einschränkung dieses Artikels ist das Fehlen alternativer Blutentnahmemethoden als Kontrolle. Vergleiche mit anderen Blutentnahmemethoden hinsichtlich ihrer Vor- und Nachteile werden in zukünftigen Forschungen behandelt. Insgesamt stellt diese Studie eine Methode zur Blutentnahme bei Ratten vor, ohne dass eine Anästhesie erforderlich ist. Dieser Ansatz bietet eine unkomplizierte, schnelle und sichere Möglichkeit, Blutproben von Ratten zu gewinnen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine relevanten finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch das Cuiying Plan Project des Lanzhou University Second Hospital (Grant No. PR0121015) und das Schlüssellabor für die Erforschung von Harnwegserkrankungen der Provinz Gansu (Förderkennzeichen 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
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Diesen Monat in JoVE Ausgabe 201 Ratte Vena subclavia BlutentnahmeErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
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An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
