ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Hier presenteren we een combinatie van effectieve rattenbeperking en subclavia-aderpunctiemethoden die snelle, veilige en herhaalde bloedafname bij ratten zonder verdoving mogelijk maken.
Abstract
Er zijn verschillende gevestigde methoden voor het verkrijgen van herhaalde bloedmonsters van ratten, waarbij de meest gebruikte methoden laterale staartaderbemonstering zonder verdoving en halsaderbemonstering met anesthesie zijn. De meeste van deze methoden vereisen echter hulp en anesthesieapparatuur en leveren soms problemen op in termen van bloedafname of de slechte kwaliteit van bloedmonsters. Bovendien nemen deze methoden voor bloedafname veel tijd en personeel in beslag wanneer herhaalde bloedafname vereist is voor een groot aantal ratten. Deze studie presenteert een techniek voor herhaalde bloedafname bij niet-verdoofde ratten door een enkel bekwaam individu. Zeer bevredigende bloedmonsters kunnen worden verkregen door de subclavia-ader te doorboren. De methode toonde een indrukwekkend algemeen slagingspercentage van 95%, met een mediane tijd van slechts 2 minuten tussen het fixeren van ratten en het voltooien van de bloedafname. Bovendien brengt het uitvoeren van opeenvolgende bloedafnames binnen het aangegeven bereik geen schade toe aan de ratten. Deze methode is de moeite waard om te promoten voor bloedafname, vooral in grootschalige farmacokinetische onderzoeken.
Introduction
Ratten zijn een van de meest voorkomende proefdieren en er zijn veel manieren om bloedmonsters te verkrijgen. Voor experimenten met een enkele bloedafname in de eindfase kan een voldoende hoeveelheid bloed worden verkregen door middel van een hartpunctie of abdominale aorta-bloedafname1. Sommige onderzoeken vereisen echter herhaalde bloedafname van ratten voor routinematige bloed- of biochemische analyse, vooral in farmacokinetische en toxicologische onderzoeken, waarbij herhaalde bloedafname vereist is om de absorptie, distributie en het metabolisme van geneesmiddelen te bepalen.
Hoewel bloedafname in de staartader momenteel de meest gebruikelijke methode is voor bloedafname bij ratten, ondanks dat er geen anesthesie nodig is, kan deze methode een uitdaging zijn voor herhaalde bloedafname en is het volume van het verzamelde bloed relatief klein 3,4. Bovendien, hoewel bloed kan worden afgenomen uit de saphena en penisaderen, is de hoeveelheid verkregen bloed beperkt en is anesthesie vereist 1,5. Bovendien leveren bloedmonsters die zijn verzameld uit de submandibulaire veneuze plexus, evenals sublinguale, halsslagaders en subclavia-aderen monsters van hogere kwaliteit, maar vereisen meestal anesthesie of de hulp van meerdere personen 1,6,7,8,9. Ten slotte vereist retro-orbitale bloedafname van sinussen/kanalen niet alleen anesthesie, maar kan het mogelijk ook letsel en stress veroorzaken bij de ratten9.
De kwaliteit van bloedmonsters die doorgaans uit grote aderen worden verkregen, is over het algemeen van de hoogste standaard1. Op dit moment hebben sommige onderzoeken aangetoond dat continue microbemonstering via de halsader een zeer geschikte methode is voor toxicologisch onderzoek bij ratten, hoewel deze methode meestal halsaderkatheterisatie vereist 10,11,12. Daarom is het de moeite waard om te onderzoeken hoe bloedmonsters van hoge kwaliteit kunnen worden verkregen in overeenstemming met het 3R-principe van dieronderzoek zonder chirurgische ingrepen. Het doel van deze studie was om een methode te presenteren voor het efficiënt afnemen van bloed uit de subclavia-ader bij ratten. Deze techniek maakt het mogelijk om snel bevredigende monsters te verzamelen door middel van een eenpersoonsprocedure zonder dat anesthesie nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie voldeed aan de richtlijnen die zijn uiteengezet in de 8e editie van de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren13. Het onderzoek kreeg goedkeuring van de ethische commissie van het Lanzhou University Second Hospital en werd gedocumenteerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen 2.014. Twaalf gezonde Wistar-ratten (zes mannetjes met een gewicht van 290-330 g en zes vrouwtjes met een gewicht van 250-280 g) in de leeftijd van 12-16 weken werden gedurende 3 dagen vóór het eigenlijke experiment ondergebracht in het GLP Animal Laboratory van de Universiteit van Lanzhou. De gebruikte rattenkooien waren van het type R5, met afmetingen van 545 mm x 395 mm x 200 mm, en waren uitgerust met geautoclaveerd strooisel. Alle ratten kregen onbeperkte toegang tot zowel voedsel als water. Het laboratorium handhaafde een gemiddelde luchtvochtigheid van 25%, een gemiddelde temperatuur van 24 °C en een lichtcyclus die afwisselend dag en nacht (7:00 uur/19:00 uur) was. Aan het einde van het onderzoek werden alle dieren op humane wijze geëuthanaseerd met behulp van een overdosis isofluraan. Voor uitgebreide informatie over de materialen en instrumenten die in dit onderzoek zijn gebruikt, verwijzen wij u naar de Tabel met Materialen.
1. Berekening van de steekproefomvang en selectie van dieren
- Kies de resourcevergelijkingsmethode15 om de steekproefomvang van dieren te schatten met behulp van vergelijking (1).
E = Totaal aantal dieren − Totaal aantal groepen (1)
Waarbij E de mate van vrijheid van variantieanalyse (ANOVA) is en varieert van 10 tot 20.
OPMERKING: In deze studie werden 12 dieren verdeeld in twee groepen A en B (drie mannetjes en drie vrouwtjes per groep). - Definieer de primaire uitkomst van dit onderzoek als het slagingspercentage en de tijdsbesteding van herhaalde bloedafname door een enkele persoon.
- Definieer de secundaire uitkomstmaten als veranderingen in het lichaamsgewicht van ratten, voedsel- en waterinname, evenals de incidentie van bijwerkingen (zoals sleutelbeenfracturen, onderhuidse hematomen, pneumothorax en mortaliteit).
- Definieer succesvolle bloedafname als het voldoen aan de volgende criteria: i) minder dan drie puncties voor een enkele bloedafname; ii) een totale tijd (tussen fixatie van de rat tot voltooiing van de bloedafname) van niet meer dan 5 minuten; en iii) het bereiken van het beoogde bloedvolume bij het verkrijgen van helder plasma. Beschouw elke afwijking van deze criteria als een steekproeffout.
2. Fixatie van dieren en bloedafname
OPMERKING: Bloedmonsters van groep A - en B-ratten werden verzameld door twee ervaren onderzoekers, die beiden ten minste 100 bloedmonsters hadden genomen. Bloedmonsters werden verzameld van beide groepen ratten voor een totaal van 96 keer in de loop van 4 dagen. Deze bloedafnamemethode vereist geen anesthesie of extra fixatiemiddelen voor de ratten. Het vereist echter bedreven hanteringstechnieken.
- Om 8:00 uur op de dag voor bloedafname (dag 1), wijs je elke rat toe aan zijn individuele kooi terwijl zijn voedsel en water worden gewogen. Laat vervolgens een andere onderzoeker, blind voor de metingen, vanaf dag 1 elke dag om 8:00 uur het gewicht, de voedselconsumptie en de waterinname van de ratten noteren.
- Om dit protocol te volgen, neemt u elke dag eerst om 10.00 uur en vervolgens om 22.00 uur bloed af, waarbij u afwisselend 0,15 ml bloed verzamelt uit de subclavia-aderen aan beide zijden.
OPMERKING: De hoeveelheid bloed die moest worden afgenomen, werd bepaald door het maximale volume dat de rat met het laagste gewicht binnen een week kon verdragen. - Spoel een spuit met natriumheparine (25 E/ml) en desinfecteer de injectieplaats met alcohol.
- Aai zachtjes over de rughuid van de rat en knijp herhaaldelijk in zijn nek om de rat te helpen ontspannen (video 1).
- Gebruik de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand om de nekhuid van de rat stevig vast te pakken en op te tillen (Figuur 1A en video 1).
- Gebruik met coördinatie van de dominante hand de resterende drie vingers en de palm van de niet-dominante hand om de rughuid van de rat vast te zetten en zijn voorste ledematen te immobiliseren (Figuur 1B, C en Video 2).
OPMERKING: Als de rat zich verzet of worstelt, kan deze procedure meerdere keren worden herhaald om de rat te helpen wennen aan de behandeling. De volgende stappen zijn de sleutel tot een succesvolle bloedafname. - Gebruik de wijsvinger van de niet-dominante hand om voorzichtig de huid van de kop van de rat naar beneden te duwen, terwijl de andere vingers, samen met de handpalm, helpen bij het naar buiten draaien van het schoudergewricht. Gebruik tijdens dit proces de dominante hand om het schoudergewricht van de rat volledig uit te strekken (Figuur 1D-F en Video 2).
- Pak de rat stevig vast met de niet-dominante hand om de kop en het lichaam van de rat in een rechte lijn uit te lijnen (Figuur 1G,H). Gebruik vervolgens de dominante hand om de positie van het sleutelbeen te lokaliseren en de prikplaats te bevestigen (Figuur 1I, Video 2 en Video 3).
LET OP: Het scheren van de rat is niet nodig. In figuur 1 werd alleen geschoren om het sleutelbeen en de punctiepositie in grotere mate te laten zien. Bij het in bedwang houden van ratten, vooral ratten >350 g, zal het toestaan van de rat om zijn poten op een stevige ondergrond te laten rusten, helpen om hun lichaamsgewicht te ondersteunen. Bovendien moet de weerhouder de ademhalingsfrequentie van elke rat controleren terwijl hij bloed verzamelt om ervoor te zorgen dat de fixatie niet te strak zit, wat ademnood kan veroorzaken. - Houd de spuit evenwijdig aan het lichaam van de rat in de dominante hand, met de punt van de naald naar boven gericht en de schaal van de spuit naar de onderzoeker gericht, en houd een hoek van ongeveer 15° aan met de middellijn van het lichaam van de rat. Steek de naald 0,5 cm onder de inkeping van het sleutelbeen (op de kruising van het proximale derde deel van het sleutelbeen en het borstbeen) en zorg ervoor dat de naald evenwijdig blijft aan het lichaam van de rat (Figuur 1J en video 3).
OPMERKING: Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de hoek en diepte van het inbrengen van de naald om te voorkomen dat het bloedvat wordt doorboord of onbedoelde schade aan aangrenzende bloedvaten wordt veroorzaakt. - Trek de spuit voorzichtig iets terug om een negatieve druk te creëren, vaak vergezeld van een voelbaar gevoel van doorbraak bij het binnendringen van het bloedvat (vooral uitgesproken tijdens de eerste bloedafname). Houd deze positie aan en verzamel indien nodig 0,1-1,0 ml bloed met een constante snelheid (volgens de IACUC-richtlijnen van ongeveer 4-5,3 ml/kg bloed per week1) (Figuur 1K en video 3).
- Als er geen bloed is bij het prikken, probeer dan voorzichtig de hoek en diepte van de naald aan te passen of draai de spuit voorzichtig rond (video 3). Als drie opeenvolgende pogingen aan dezelfde kant niet succesvol zijn, stop dan alle bloedingen en schakel vervolgens over naar de andere kant voor de punctie.
OPMERKING: Een snelle punctie door de huid is raadzaam om te voorkomen dat de rat door ongemak worstelt. - Breng een wattenstaafje aan voor hemostase en breng de rat terug naar zijn kooi (video 4).
- Verwerk de bloedmonsters volgens de experimentele vereisten.
3. Verwerking van bloedmonsters
- Gooi de naald van de spuit weg in een naaldencontainer. Breng het verzamelde bloed over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml die eerder is gespoeld met heparine. Plaats de buis in een centrifuge, stel deze in op 4 °C en 1.200 x g, en centrifugeer gedurende 10 minuten om het plasma te scheiden. Breng het serum met behulp van een pasteurpipet van 1,0 ml over in een schone microcentrifugebuis en bewaar deze bij -80 °C.
NOTITIE: Om hemolyse als gevolg van druk te voorkomen, verwijdert u indien nodig de punt van de naald. Vermijd tijdens plasma-aspiratie het afnemen van bloedcellen uit de bodem van de buis. Af en toe kan het oppervlak van de spuit rattenbont verzamelen; Zorg ervoor dat er geen vacht in de buis komt, omdat dit tot stolling kan leiden.
4. Statistische analyse
- Presenteer alle gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie en test ze op homogeniteit van variantie.
- Gebruik de exacte test van Fisher om de slagingspercentages tussen groepen te vergelijken.
- Gebruik een onafhankelijke t-toets met twee steekproeven om de totale gemiddelden tussen de twee groepen te vergelijken.
- Gebruik variantieanalyse (ANOVA) voor continue metingen zoals bloedafnametijd, lichaamsgewicht, voedselinname en waterverbruik. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Plasmamonsters van hoge kwaliteit vertonen een lichtgele tint, helderheid en transparantie, zonder enige rode tint of stolling, zoals afgebeeld in figuur 2A. Figuur 2B toont hemolyse (linkerkant) of coagulatie (rechterkant) als gevolg van onjuiste procedures, respectievelijk. In de loop van 96 bloedafnamesessies binnen 4 dagen waren de gemiddelde enkelvoudige bloedafnametijden voor groep A en B respectievelijk 119,87 ± 33,62 s en 123,28 ± 30,96 s. Er was geen significant verschil in de bloedafnametijden tussen de twee groepen op dagelijkse basis (t = 0,66, P = 0,54, tabel 1). De kortste individuele bloedafnametijden waren respectievelijk 78 s en 89 s.
Het gemiddelde aantal pogingen dat nodig was voor een succesvolle enkelvoudige bloedafname was respectievelijk 1,21 en 1,17 voor groep A en B. Er was geen significant verschil in het aantal pogingen tussen de twee groepen (t = 0,58, P = 0,60, tabel 2). De totale slagingspercentages waren respectievelijk 93,8% (45/48) en 95,8% (46/48) voor de groepen A en B, zonder significant verschil in de totale slagingspercentages tussen de twee groepen (P > 0,05, tabel 1). Er was geen significant verschil in het tijdstip van bloedafname in groep B op elk tijdstip. In groep A was de bloedafnametijd op de tweede dag korter dan die op de vierde dag (105,75 ± 14,22 s versus 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, P < 0,01; Tabel 1) . Bovendien duiden meer pogingen en langere lektijden vaak op hogere faalpercentages (Figuur 3A-C). Op de derde dag stuitte groep B op één storing die werd toegeschreven aan hemolyse. Op de vierde dag stuitte groep A op drie mislukkingen: één als gevolg van hemolyse en de andere twee vanwege het onvermogen om bloedmonsters te verkrijgen. Groep B ondervond ook één mislukking vanwege het onvermogen om een bloedmonster te verkrijgen.
In de loop van 4 opeenvolgende observatiedagen vertoonden beide groepen ratten een gestage gewichtstoename. De water- en voedselinname bleef relatief constant bij ratten van hetzelfde geslacht. Gedurende het gehele bloedafnameproces waren er geen gevallen van rattensterfte en werden er ook geen significante complicaties waargenomen, zoals sleutelbeenfracturen, pneumothorax of hematomen op de prikplaats (Figuur 3D-F en Tabel 3).
Figuur 1: Fixatie- en bloedafnamemethoden van de subclavia-ader bij ratten. (A-H) Manipulatie van fixatie; i) de plaats waar het sleutelbeen en de bloedafname plaatsvinden; (J-L) het proces van bloedafname en hemostase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Succesvol en zonder succes afgenomen bloedmonsters. (A) Typische bloedmonsters en geïsoleerd plasma; (B) gehemolyseerde (links) en gecoaguleerde (rechts) bloedmonsters Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van de doeltreffendheid en veiligheid van bloedafname. (A) Gemiddelde tijd van bloedafname per dag; B) het gemiddelde aantal lekke banden per dag; (C) de succes- en faalpercentages van bloedafname in beide groepen; (D-F) veranderingen in lichaamsgewicht, voedselinname en waterinname tijdens bloedafname bij beide groepen ratten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Anatomie van halsvaten van ratten. (A) Oppervlakkige anatomische structuren; (B) diepe anatomische structuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groep | Tijd | Gemiddelde bloedafnametijd(en) | |||
| Dag 1 | Dag 2* | Dag 3 | Dag 4 | ||
| Een | 10:00 uur | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117,83 ± 12,02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 uur | 108,67 ± 10,86 | 111,00 ± 6,95 | 158,33 ± 60,47 | 142,40 ± 25,96 | |
| Gemiddelde tijd | 100,75 ± 12,20 | 105,75 ± 14,22 | 138,08 ± 48,07 | 144.5 ± 25.45 | |
| Slagingspercentage | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Algemeen slagingspercentage | 93.8% (45/48) | ||||
| Totale gemiddelde tijd | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 uur | 98,17 ± 7,24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 uur | 106.00 ± 14.35 | 126,67 ± 17,12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Gemiddelde tijd | 102.08 ± 12.02 | 118,42 ± 17,82 | 123,92 ± 25,16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Slagingspercentage | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Algemeen slagingspercentage | 95.8% (46/48) | ||||
| Totale gemiddelde tijd | 123,28 ± 30,96 | ||||
Tabel 1: Bloedafnametijden en slagingspercentages van de twee groepen ratten. *De bloedafnametijd van de tweede dag was korter dan die van de vierde dag in groep A (t = 12,39 P < 0,01).
| Groep | Tijd | Gemiddeld aantal lekke banden | |||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| Een | 10:00 uur | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 uur | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Gemiddeld | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Algemeen gemiddelde | 1.21 | ||||
| B | 10:00 uur | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 uur | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Gemiddeld | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Algemeen gemiddelde | 1.17 | ||||
Tabel 2: Gemiddeld aantal puncties voor bloedafname bij ratten.
| Geslacht | Groep | Gewicht (g) | Voedselinname (g) | Wateropname (g) | |||||||||
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | ||
| ♀ | Een | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5,4 | 278 ± 6,5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12,8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7,0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| T/Q | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Aangepaste P-waarde | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | Een | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14,2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16,9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25,6 ± 1,27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Aangepaste P-waarde | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Tabel 3: Veranderingen in dagelijks lichaamsgewicht, voedselinname en waterinname van ratten.
Video 1: Kalmeren en hanteren van ratten. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Fixatieprocedures voor ratten. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: De bloedafnameprocedure voor ratten. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 4: Hemostatische compressie op de prikplaats. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel bloedafname in de staartader de meest gebruikelijke methode is voor herhaalde bloedafname bij ratten, kan deze worden beïnvloed door anesthesiemiddelen, en vanwege de kleine omvang van de staartader is de hoeveelheid bloed die in één keer kan worden afgenomen beperkt, wat leidt tot een langere bloedafnameduur 4,5. Hoewel high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) -tandem massaspectrometrie (MS/MS) systemen in combinatie met capillaire microsampling (CMS) van rattenstaartaderen de hoeveelheid bloed die bij ratten wordt gebruikt kunnenverminderen11, zijn niet alle instellingen uitgerust met deze dure apparatuur. Bloedafname van de retrobulbaire plexus/sinus veroorzaakt vaak angst en pijn bij ratten, en onjuiste bediening kan zelfs het gezichtsvermogen en de gezondheid van ratten schaden. Daarom wordt deze methode niet aanbevolen voor bloedafname bij ratten9.
De subclavia-ader bevindt zich tussen de pectoralis major en de deltaspier van de rat en mondt uit in de halsader op een derde van het inwendige sleutelbeen (figuur 4). In de studie van Yang et al. was het slagingspercentage van bloedafname uit de subclavia-ader bij ratten onder narcose ongeveer 90% door een bekwame operator, wiens minimale tijd van het begin tot het einde van de punctie 65 s7 was. In de studie van Wang et al. werden bloedmonsters verzameld uit de subclavia-ader van de rat met behulp van een verticale benadering. Hoewel hun methode geen anesthesie inhield, vereiste het wel de medewerking van twee personen om de rat veilig te beperken6. Dit onderzoeksprotocol laat een goed voordeel zien van bloedafname. Dit protocol vereist geen speciale fixatiemiddelen of anesthesiefaciliteiten. Bij de juiste behandeling vertonen ratten over het algemeen minimale weerstand. De mediane tijd tussen het fixeren van ratten en het voltooien van de bloedafname was slechts 2 minuten, met een indrukwekkend algemeen slagingspercentage van 95%. Deze methode bespaart aanzienlijk personeel en verkort de tijd die nodig is voor bloedafname. Verder zijn de verkregen plasmamonsters helder en transparant, met een minimaal optreden van hemolyse en stollingsgebeurtenissen, waardoor herhaling van het experiment tot een minimum wordt beperkt. Vaardigheid in deze techniek is bijzonder waardevol voor het beheer van grootschalige farmacokinetiek en toxicologische experimenten bij ratten die herhaalde bloedafname vereisen.
In onze studie was het belangrijkste optreden van mislukte bloedafname op dag 4, wat mogelijk verband houdt met de veneuze schade veroorzaakt door herhaalde puncties. Herhaalde puncties kunnen leiden tot beschadiging van de vaatwand en een ontstekingsreactie uitlokken, waardoor de vaatwand dikker en harder wordt en zelfs vasculaire vernauwing veroorzaakt. Als de hemostase na punctie onvoldoende is, kan het geëxtravaseerde bloed verder weefseloedeem en ontsteking veroorzaken, wat vervolgens leidt tot de vorming van littekenweefsel. Deze littekenweefsels zijn moeilijk te penetreren en kunnen ook trekken en ervoor zorgen dat bloedvaten van positie veranderen, waardoor de bloedvaten moeilijker te lokaliseren en te doorboren zijn. In onze studie werd een spuit van 26 G (0,45 mm) gebruikt voor bloedafname, wat prima is in vergelijking met menselijke aderen, maar nog steeds aanzienlijke schade aan rattenaders veroorzaakt. Dit blijkt uit het duidelijke gevoel van penetratie wanneer de naald door het vat gaat tijdens de eerste bloedafname, die afneemt naarmate het aantal bloedafnames toeneemt, met langere bloedafnametijden en hogere faalpercentages. Daarom raden we aan om een fijnere insulinenaald te gebruiken voor bloedafname, en er moet voldoende druk worden uitgeoefend na bloedafname om hematoomvorming te voorkomen, en er moeten afwisselende bloedafnames worden uitgevoerd om voldoende veneus herstel mogelijk te maken. Onze ervaring is dat een goed opgeleide flebotomist een 26G-naald kan gebruiken om binnen 24 uur afwisselend 8-10 keer bloed af te nemen uit de bilaterale subclavia-aderen van dezelfde rat, met een gemiddeld interval van 2-3 uur tussen elke bloedafname. Het maximale aantal bloedafnames dat een rat kan verdragen, de herstelperiode en de bloedafnamecyclus kunnen echter worden beïnvloed door de gebruikte naaldmeter, de bloedafname-intervallen die nodig zijn voor verschillende experimenten en de vaardigheid van de flebotomist. Deze factoren moeten in toekomstig onderzoek verder worden onderzocht. Voor intensieve bloedafname die nodig is voor farmacokinetische experimenten, is het beter om afwisselend bloed te verzamelen uit de linker en rechter subclavia-aderen. In gevallen waarin het echt niet beschikbaar is, kunnen andere methoden voor bloedafname worden aangevuld.
Lichaamsgewicht, waterverbruik en voedselinname zijn de meest elementaire en eenvoudige indicatoren voor het beoordelen van de gezondheidstoestand van ratten16. Een vroege studie had aangetoond dat bloedafname via de halsader van minder dan 0,9 ml per dag geen invloed had op de hemodynamica van ratten en niet resulteerde in significant gewichtsverlies. Wanneer de bloedafname echter hoger is dan 1,5 ml, kan dit leiden tot gewichtsverlies17. In de studie van Yokoya et al. had herhaalde microbemonstering uit de halsader (50 μL per keer, 6-7x binnen 24 uur) geen invloed op het lichaamsgewicht van de rat of de voedselinname10. Bovendien kan de manier van bloedafname van invloed zijn op het lichaamsgewicht en de voedselinname van ratten. In een eerdere studie waarbij gebruik werd gemaakt van sublinguale aderbloedafname, resulteerde een 24-uurs afname van 0,5-1,0 ml bloed op de eerste dag in een vermindering van het lichaamsgewicht van de rat en een verminderde voedselinname, hoewel het gewichtsverlies niet significant was18. In deze studie nam het lichaamsgewicht van de ratten nog steeds gestaag toe tijdens de bloedafnameperiode en waren er geen significante veranderingen in voedsel- en waterinname, bloedafnamegerelateerde complicaties en dood van de ratten, wat aangeeft dat deze methode veilig en betrouwbaar is.
Het is van cruciaal belang om te benadrukken dat het acclimatiseren van de ratten aan het fixatieproces voorafgaand aan het uitvoeren van bloedafname waarschijnlijk de stress bij de rat zal verminderen en het slagingspercentage van de bloedafname zal verbeteren. Onvoldoende fixatie en onvoldoende blootstelling van de ader kunnen leiden tot mislukte bloedafname en zelfs lokale aderbreuk veroorzaken als gevolg van de worsteling van de ratten met pijn. In mildere gevallen kan dit leiden tot merkbare onderhuidse hematomen, terwijl het in ernstige gevallen kan leiden tot de dood van ratten. Bovendien kan een slechte fixatie ertoe leiden dat ratten ontsnappen en schade toebrengen aan individuen. Daarom raden we ten zeerste aan om de behandelingstechniek grondig onder de knie te krijgen voordat u doorgaat met de bloedafnameprocedure. Bovendien is het belangrijk om voorzichtig te zijn met de kracht die wordt uitgeoefend om het schoudergewricht naar buiten te draaien, omdat overmatige druk kan leiden tot sleutelbeenfracturen bij de rat.
Een beperking van deze studie is dat we de veranderingen in stress veroorzaakt door deze bloedafnamemethode bij ratten niet systematisch hebben geëvalueerd door de veranderingen in het corticosteronniveau te meten of door monitoring aan de kooizijde, wat in toekomstig onderzoek moet worden onderzocht. Een andere beperking van dit artikel is het ontbreken van alternatieve bloedafnamemethoden als controle. Vergelijkingen met andere bloedafnamemethoden voor hun voor- en nadelen zullen in toekomstig onderzoek aan de orde komen. Al met al introduceert deze studie een methode voor bloedafname door één persoon van ratten zonder dat anesthesie nodig is. Deze aanpak biedt een eenvoudige, snelle en veilige manier om bloedmonsters van ratten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen relevante financiële of niet-financiële belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door het Cuiying Plan Project van het Lanzhou University Second Hospital (subsidienr. PR0121015) en Gansu Provincial Key Laboratory of Urinary System Disease Research (subsidie nr. 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
Deze maand in JoVE nummer 201 rat subclavia-ader bloedafnameErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
