Analisi della durata della vita: misurazione della longevità di C. elegans

Overview

Questo video descrive un metodo tradizionale basato su lastre per misurare la durata di vita di C. elegans. Il protocollo di esempio misura la durata dei worm trattati con RNAi.

Protocol

Il seguente protocollo è un estratto da Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Prevenire la produzione di progenie con l'aggiunta di 5-Fluoro-2'-deossiuridina (FUdR)

1. Far crescere gli animali fino allo stadio L4 a 20 °C. Verificare se gli animali sincronizzati si sono sviluppati a L4 circa 40 ore dopo la semina (fase 2.1.7).
   NOTA: Il tempo di sviluppo di C. elegans varierà a temperature diverse e i tassi di crescita degli animali mutanti per i quali i tassi non sono stati caratterizzati devono essere testati empiricamente.
   1. Aggiungere 160 μL di 50x FUdR a ogni piastra di 6 cm con animali L4.
      NOTA: È fondamentale aggiungere FUdR nella fase L4. Per comodità, fare 1.000 azioni di FUdR sciogliendo 1 g di FUdR in 10 mL ultrapure H₂O. Sterile del filtro FUdR con un filtro da 0,2 μm e una siringa da 10 cc. Aliquota ~1 ml di magazzino in tubi sterili da 1,5 ml. Congelare e conservare a -20 °C.
2. Ispezionare le piastre per la presenza di C. elegans maschi. Rimuovi tutti i maschi.
   NOTA: La durata della vita è tipicamente misurata per gli ermafroditi e non per i maschi. Gli ermafroditi che si accoppiano vivono più corti degli animali non accoppiati, anche in presenza di FUdR. I maschi sono più piccoli e sottili degli ermafroditi e possono essere facilmente identificati da una caratteristica coda unta.
3. Rimettete la scatola nella borsa con chiusura a zip. Ritorno all'incubatore a 20 °C.

2. Fattibilità del punteggio

1. Ottieni vitalità ogni giorno toccando delicatamente l'animale sulla testa con un filo di platino o una ciglia. Segnare gli animali che non riescono a muoversi come morti e rimuoverli dal piatto (Figura 1A). Registrare il numero di morti osservati per ogni condizione per ogni punto di tempo di osservazione.
   NOTA: Per ridurre il rischio di distorsione del punteggio, lo sperimentatore deve rimanere cieco alle condizioni sperimentali e allo stesso modo non deve fare riferimento ai risultati dei punti di tempo precedenti durante il punteggio.
2. Censura gli animali che si rompono, muoiono per altri evidenti difetti di sviluppo o strisciano sul lato del piatto: rimuovi questi animali e registra il numero in ogni momento osservato per essere preso in considerazione nell'analisi statistica. Inoltre, se vengono trovati maschi, rimuoverli e registrare il numero osservato.
3. Ripeti dal passaggio 2.1 ogni giorno fino a quando nessun animale rimane vivo.
   NOTA: Se il prato di E. coli diminuisce in modo significativo o il fungo inizia a crescere sul piatto, trasferire tutti gli animali rimanenti su un piatto fresco con gli apposti RNAi e FUdR.

Representative Results

Figura 1: Il metodo tradizionale e il metodo del set di repliche per il punteggio della durata della vita dei C.elegans (A). Il metodo tradizionale per segnare la durata della vita di C. elegans. Nel tempo vengono seguite diverse piccole popolazioni sincronizzate di animali isogenici per condizione. La stessa popolazione di animali viene seguita durante tutto il corso di studio. La vitalità è valutata dal movimento, che può essere stimolato da un pungimento delicato. Gli animali che non riescono a muoversi vengono segnati come morti e vengono rimossi (aspirazione mostrata) fino a quando non rimangono animali vitali. (B). Il metodo del set di repliche per il punteggio C. elegans durata. Una grande popolazione di animali isogenici sincronizzati con l'età sono distribuiti su un certo numero di piastre replicate identiche. In ogni momento, viene segnata una singola replica: viene aggiunta una soluzione tamponata lieve (M9), che stimola il movimento. Anche gli animali che non riescono a muoversi spontaneamente dopo aver allagato i pozzi vengono valutati tramite stimolo al tatto. La durata del punteggio per l'esperimento viene determinata prima dell'inizio. Ogni animale viene segnato una sola volta e la longevità per la popolazione più numerosa deriva da molte osservazioni indipendenti. (C). L'approccio del set di repliche è un metodo ad alta velocità effettiva per misurare quantitativamente la durata della vita di C. elegans. 100 o più cloni RNAi indipendenti possono essere monitorati contemporaneamente. Viene mostrato HT115 E. coli che esprime dsRNA per un dato clone di RNAi. In pratica, ogni 24 campioni della piastra da 96 po 'sono divisi in un'unica piastra da 24 po '. Ogni piastra risultante da 24porcile ha un controllo negativo (cioè vettore vuoto, pozzo rosso) e positivo (pozzo verde) distribuito casualmente all'interno di una raccolta di cloni RNAi (pozzi gialli). In genere, il primo pozzo (A1) in una raccolta contiene un vettore vuoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/