Análise lifespan: Medindo C. elegans Longevidade

Overview

Este vídeo descreve um método tradicional, baseado em placas, de medir a vida útil de C. elegans. O protocolo de exemplo mede a vida útil dos vermes tratados com RNAi.

Protocol

O seguinte protocolo é um trecho de Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Prevenção da produção de progênero pela adição de 5-Fluoro-2'-desoxyuridina (FUdR)

1. Cresça animais até a etapa L4 a 20 °C. Verifique se os animais sincronizados se desenvolveram para L4 aproximadamente 40h após a semeadura (etapa 2.1.7).
   NOTA: O tempo de desenvolvimento de C. elegans variará a diferentes temperaturas e as taxas de crescimento de animais mutantes para os quais as taxas não foram caracterizadas devem ser testadas empiricamente.
   1. Adicione 160 μL de 50x FUdR a cada placa de 6 cm com animais L4.
      NOTA: É fundamental adicionar FUdR na fase L4. Para conveniência, faça estoques de 1.000x de FUdR dissolvendo 1 g de FUdR em 10 mL ultrapure H₂O. Estoque de filtro esterilizado FUdR com um filtro de 0,2 μm e uma seringa de 10 cc. Aliquot ~1 mL de estoque em tubos estéreis de 1,5 mL. Congele e armazene a -20 °C.
2. Inspecione placas para a presença de machos C. elegans. Remova todos os machos.
   NOTA: A vida útil é tipicamente medida para hermafroditas e não para machos. Hermafroditas que acasalam vivem mais curtas que animais não matizados, mesmo na presença de FUdR. Os machos são menores e mais finos que os hermafroditas e podem ser facilmente identificados por uma cauda distinta.
3. Coloque a caixa de volta no saco de zip-lock. Retorne à incubadora de 20 °C.

2. Viabilidade de pontuação

1. Marque viabilidade diariamente tocando suavemente o animal na cabeça com um fio de platina ou cílios. Pontuação de animais que não se movem como mortos e removê-los da placa (Figura 1A). Registo o número observado morto para cada condição para cada ponto de observação.
   NOTA: Para reduzir o risco de viés de pontuação, o experimentador deve permanecer cego a condições experimentais e, da mesma forma, não deve referenciar os resultados dos pontos de tempo anteriores durante a pontuação.
2. Censurar animais que se rompem, morrem de outros defeitos óbvios de desenvolvimento, ou rastejam para cima na lateral do prato: removam esses animais e registrem o número em cada ponto de tempo observado para consideração na análise estatística. Além disso, se os machos forem encontrados, remova-os e regise o número observado.
3. Repita a partir do passo 2.1 diariamente até que nenhum animal permaneça vivo.
   NOTA: Se o gramado de E. coli diminuir significativamente ou o fungo começar a crescer sobre a placa, transfira todos os animais restantes para uma placa fresca com o RNAi e FUdR apropriados.

Representative Results

Figura 1: O Método Tradicional e o Conjunto de Réplicas para pontuação de vida útil C.elegans (A). O Método Tradicional para marcar A vida útil de C. elegans. Várias pequenas populações sincronizadas de animais isogênicos por condição são seguidas ao longo do tempo. A mesma população de animais é acompanhada ao longo do curso de estudo. A viabilidade é avaliada pelo movimento, que pode ser estimulado por um estímulo suave. Os animais que não se movem são pontuados como mortos e são removidos (aspiração mostrada) até que nenhum animal viável permaneça. (B) O Método de Conjunto de Réplicas para pontuação de C. elegans lifespan. Uma grande população de animais isogênicos sincronizados por idade são distribuídos através de uma série de placas de replicação idênticas. A cada ponto, uma única réplica é pontuada: uma solução tamponada leve (M9) é adicionada, o que estimula o movimento. Animais que não se movem espontaneamente após inundações de poços também são avaliados por estímulo ao toque. A duração da pontuação do experimento é determinada antes do início. Cada animal é pontuado apenas uma vez e a longevidade para a população maior é derivada de muitas observações independentes. (C) A abordagem replica set é um método de alto rendimento para medir quantitativamente a vida útil de C. elegans. 100 ou mais clones RNAi independentes podem ser rastreados simultaneamente. HT115 E. coli expressando dsRNA para um determinado clone RNAi é mostrado. Na prática, cada 24 amostras da placa de 96 poços são divididas em uma única placa de 24 poços. Cada placa resultante de 24 poços tem um vetor vazio (ou seja, vetor vazio, bem vermelho) e controle positivo (poço verde) distribuído aleatoriamente dentro de uma coleção de clones RNAi (poços amarelos). Normalmente, o primeiro poço (A1) em uma coleção contém um vetor vazio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/