Overview
यह वीडियो सी एलिगेंसकी उम्र को मापने की एक पारंपरिक, प्लेट-आधारित विधि का वर्णन करता है। उदाहरण प्रोटोकॉल आरएनएआई के साथ इलाज किए गए कीड़े की उम्र को मापता है।
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल कॉर्नवेल एट अल,प्रतिकृति सेट विधि से एक अंशहै: मात्रात्मक रूप से कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस आजीवन कारावास, जे विस एक्सपीके लिए एक उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण। (2018).
1. 5-फ्लोरो-2'-डिऑक्सीयूरिडीन (फ्यूडीआर) के अलावा संतान उत्पादन को रोकना
- 20 डिग्री सेल्सियस पर L4 चरण तक जानवरों को बढ़ाएं। यह देखने के लिए देखें कि क्या सिंक्रोनाइज्ड जानवरों ने सीडिंग (चरण 2.1.7) के बाद एल 44 को लगभग 40 घंटे विकसित किया है या नहीं।
नोट: सी elegans विकास के समय अलग तापमान और उत्परिवर्ती जानवरों की विकास दर है जिसके लिए दरों की विशेषता नहीं किया गया है पर भिंन होगा अनुभवजन्य परीक्षण किया जाना चाहिए ।- L4 जानवरों के साथ प्रत्येक 6 सेमी प्लेट में 50x FUdR के 160 μL जोड़ें।
नोट: यह L4 चरण में FUdR जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । सुविधा के लिए, 1 ग्राम एफडीआर को 10 एमएल अल्ट्रापुरे एच2ओ में भंग करके एफयूडीआर के 1,000x स्टॉक बनाएं। 0.2 माइक्रोन फिल्टर और 10 सीसी की सिरिंज के साथ फ़िल्टर-स्टरलाइज स्टॉक फ्यूडीआर। अलीकोट ~ 1 एमएल स्टॉक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में। फ्रीज और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- L4 जानवरों के साथ प्रत्येक 6 सेमी प्लेट में 50x FUdR के 160 μL जोड़ें।
- पुरुष सी एलिगेंस की उपस्थिति के लिए प्लेटों का निरीक्षण करें। सभी पुरुषों को हटा दें।
नोट: उम्र आमतौर पर हर्मेफ्रोडाइट्स के लिए मापी जाती है न कि पुरुषों के लिए। हर्मेफ्रोडाइट्स जो दोस्त को बिना धूर्त जानवरों की तुलना में कम रहते हैं, यहां तक कि FUdR की उपस्थिति में भी। नर हर्मेफ्रोडाइट्स की तुलना में छोटे और पतले होते हैं और आसानी से एक विशिष्ट कांटे की पूंछ से पहचाने जा सकते हैं। - बॉक्स वापस ज़िप-लॉक बैग में रखो। 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर लौटें।
2. स्कोरिंग व्यवहार्यता
- प्लैटिनम तार या बरौनी के साथ सिर पर जानवर को धीरे-धीरे छूकर दैनिक व्यवहार्यता स्कोर करें। उन जानवरों को स्कोर करें जो मृत के रूप में स्थानांतरित करने में विफल होते हैं और उन्हें प्लेट(चित्रा 1A)से हटा देते हैं। हर अवलोकन समय बिंदु के लिए प्रत्येक स्थिति के लिए मृत देखी गई संख्या रिकॉर्ड करें।
नोट: स्कोरिंग पूर्वाग्रह के जोखिम को कम करने के लिए, प्रयोगकर्ता को प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए अंधा रहना चाहिए और इसी तरह स्कोरिंग के दौरान पिछले समय अंकों से परिणामों का संदर्भ नहीं देना चाहिए । - उन जानवरों को सेंसर करें जो टूटते हैं, अन्य स्पष्ट विकास दोषों से मरते हैं, या पकवान के किनारे क्रॉल करते हैं: इन जानवरों को हटा दें और सांख्यिकीय विश्लेषण में विचार के लिए प्रत्येक मनाया समय बिंदु पर संख्या रिकॉर्ड करें। इसके अतिरिक्त, यदि पुरुष पाए जाते हैं, तो उन्हें हटा दें और देखी गई संख्या को रिकॉर्ड करें।
- जब तक कोई जानवर जीवित न रह जाए तब तक दैनिक चरण 2.1 से दोहराएं।
नोट: ई. कोलाई के लॉन काफी कम करना चाहिए या कवक थाली पर विकसित करने के लिए शुरू होता है, उचित RNAi और FUdR के साथ एक ताजा थाली में सभी शेष जानवरों के हस्तांतरण ।
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Representative Results
चित्रा 1: C.elegans उम्र (ए) स्कोरिंग के लिए पारंपरिक और प्रतिकृति सेट विधि । सी elegans उम्र स्कोरिंग के लिए पारंपरिक विधि । समय के साथ प्रति स्थिति आइसोजेनिक जानवरों की कई छोटी सिंक्रोनाइज्ड आबादी का पालन किया जाता है। पूरे अध्ययन पाठ्यक्रम में जानवरों की एक ही आबादी का पालन किया जाता है। व्यवहार्यता का मूल्यांकन आंदोलन द्वारा किया जाता है, जिसे कोमल उकसाने से प्रेरित किया जा सकता है। जानवरों को स्थानांतरित करने में विफल मृत के रूप में रन बनाए जाते है और हटा रहे है (आकांक्षा दिखाया) जब तक कोई व्यवहार्य जानवरों रहते हैं । (ख) सी एलिगेंस उम्र के स्कोरिंग के लिए प्रतिकृति सेट विधि । उम्र-सिंक्रोनाइज्ड आइसोजेनिक जानवरों की एक बड़ी आबादी को कई समान दोहराने वाली प्लेटों में वितरित किया जाता है। हर समय बिंदु पर, एक ही दोहराने का स्कोर किया जाता है: एक हल्का बफर समाधान (M9) जोड़ा जाता है, जो आंदोलन को उत्तेजित करता है। जानवरों कि बाढ़ कुओं के बाद अनायास स्थानांतरित करने में विफल भी स्पर्श उत्तेजना के माध्यम से मूल्यांकन कर रहे हैं । प्रयोग के लिए स्कोरिंग अवधि शुरू होने से पहले निर्धारित की जाती है। प्रत्येक जानवर केवल एक बार रन बनाए जाते हैं और बड़ी आबादी के लिए दीर्घायु कई स्वतंत्र टिप्पणियों से प्राप्त होती है। (ग) प्रतिकृति सेट दृष्टिकोण सी एलिगेंस उम्र को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक उच्च थ्रूपुट विधि है। 100 या अधिक स्वतंत्र आरएनएआई क्लोन को एक साथ ट्रैक किया जा सकता है। HT115 ई. कोलाई एक दिया RNAi क्लोन के लिए dsRNA व्यक्त दिखाया गया है । व्यावहारिक रूप से, ९६-अच्छी थाली से हर 24 नमूनों को एक 24-अच्छी प्लेट में विभाजित किया गया है । प्रत्येक परिणामी 24-अच्छी प्लेट में एक नकारात्मक(यानी खाली वेक्टर, लाल वेल) और सकारात्मक नियंत्रण (ग्रीन वेल) बेतरतीब ढंग से आरएनएआई क्लोन (पीले कुओं) के संग्रह के भीतर वितरित किया जाता है। आमतौर पर, एक संग्रह में पहली अच्छी तरह से (A1) एक खाली वेक्टर शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
