Анализ продолжительности жизни: Измерение долголетия C. elegans

Overview

Это видео описывает традиционный, на основе пластины метод измерения продолжительности жизни C. elegans. Пример протокола измеряет продолжительность жизни червей, обработанных РНК.

Protocol

Следующий протокол является выдержка из Корнуэлл и др., Реплика Установить метод: Высокая пропускная способность Подход к количественной мере Caenorhabditis elegans продолжительность жизни, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Предотвращение производства потомства путем добавления 5-Фтор-2'-дезиуридин (FUdR)

1. Выращивать животных до стадии L4 при 20 градусах Цельсия. Проверьте, развились ли синхронизированные животные до L4 примерно через 40 ч после посева (шаг 2.1.7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: C. elegans время развития будет меняться при различных температурах и темпы роста мутантных животных, для которых ставки не были охарактеризованы должны быть эмпирически проверены.
   1. Добавьте 160 л 50x FUdR к каждой 6-сантиметровой пластине с животными L4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно добавить FUdR на этапе L4. Для удобства сделайте 1000x запасов FUdR путем растворения 1 г FUdR в 10 мл ультрапур H₂O. Фильтр-стерилизовать запас FUdR с фильтром 0,2 мкм и 10 см шприца. Aliquot 1 мл бульона в стерильные трубки 1,5 мл. Заморозить и хранить при -20 градусов по Цельсию.
2. Осмотрите пластины на наличие самца C. elegans. Удалите всех самцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность жизни, как правило, измеряется для гермафродитов, а не мужчин. Гермафродиты, которые спариваются живут короче, чем непревзойденные животные, даже в присутствии FUdR. Самцы меньше и тоньше, чем гермафродиты и могут быть легко идентифицированы отличительные крючковатый хвост.
3. Положите коробку обратно в сумку на молнии. Возвращайся в инкубатор по 20 градусов по Цельсию.

2. Скоринг жизнеспособности

1. Оценка жизнеспособности ежедневно, мягко касаясь животного по голове с платиновой проволокой или ресницами. Оценка животных, которые не в состоянии двигаться, как мертвые и удалить их из пластины( Рисунок 1A). Завехать число наблюдаемых мертвых для каждого состояния для каждой точки времени наблюдения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы уменьшить риск смещения скоринга, экспериментатор должен оставаться слепым к экспериментальным условиям и также не должен ссылаться на результаты предыдущих очков времени во время подсчета очков.
2. Цензор животных, которые разрываются, умирают от других очевидных дефектов развития, или ползти вверх на стороне блюда: удалить эти животные и записывать число в каждый наблюдаемый момент времени для рассмотрения в статистическом анализе. Кроме того, если самцы найдены, удалите их и замитмите наблюдаемое число.
3. Повторяйте шаг 2.1 ежедневно, пока животные не останутся в живых.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если газон кишечной палочки значительно уменьшится или грибок начнет расти на тарелке, перенесите всех оставшихся животных на свежую тарелку с соответствующими РНК и FUdR.

Representative Results

Рисунок 1: Традиционный и реплики Установить метод для забил C.elegans продолжительность жизни (A). Традиционный метод оценки продолжительности жизни C. elegans. Несколько небольших синхронизированных популяций изогенных животных в состоянии следуют с течением времени. Такая же популяция животных следует на протяжении всего курса исследования. Жизнеспособность оценивается движением, которое может стимулироваться нежным подталкиванием. Звери, которые не двигаются, забиваются как мертвые и удаляются (показано стремление) до тех пор, пока не останутся жизнеспособные животные. (B). Метод набора реплик для оценки продолжительности жизни C. elegans. Большая популяция возрастных синхронных изогенных животных распределена по ряду одинаковых пластин репликации. В каждой точке времени, одна репликация забил: мягкий буферный раствор (M9) добавляется, что стимулирует движение. Кроме того, животные, которые не могут самостоятельно передвигаться после затопления колодцев, оцениваются с помощью сенсорного стимула. Продолжительность подсчета очков для эксперимента определяется до начала. Каждое животное забил только один раз и долговечность для большей популяции является производным от многих независимых наблюдений. (C). Подход Replica Set является методом высокой пропускной способности для количественного измерения продолжительности жизни C. elegans. 100 или более независимых клонов РНК можно отслеживать одновременно. Показано HT115 E. coli, выражаюющая dsRNA для данного клона РНК. Практически, каждые 24 образца из 96-хорошо пластины делятся на одну пластину 24 хорошо. Каждая полученная пластина из 24 скважин имеет отрицательный(т.е. пустой вектор, красный колодец) и положительный контроль (зеленый колодец), случайным образом распределенный в пределах коллекции клонов РНК (желтых скважин). Как правило, первая колодец (A1) в коллекции содержит пустой вектор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/