Summary
Om te studeren
Abstract
Een zwerm van de δ-proteobacterium Myxococcus Xanthus bevat miljoenen cellen die fungeren als een collectief, de coördinatie van beweging door een reeks van signalen om complexe, dynamische patronen te creëren als een reactie op omgevingsfactoren. Deze patronen zijn zelforganiserend en opkomende, ze kunnen niet voorspeld worden door het observeren van het gedrag van de individuele cellen. Met behulp van een time-lapse microcinematography tracking test, identificeerden we een duidelijke opkomst patroon in M. Xanthus genoemd chemotaxis, gedefinieerd als de gerichte beweging van een zwerm van een voedingsstof helling in de richting van de bron 1.
Om efficiënt chemotaxis via time-lapse microcinematography karakteriseren, ontwikkelden we een zeer aanpasbaar plaat complex (figuur 1) en bouwde een cluster van acht microscopen (figuur 2), die elk in staat om het vastleggen van time-lapse video's. De test is streng genoeg om consistente replicatie van kwantificeerbare gegevens mogelijk te maken, en de resulterende video's stellen ons in staat om te observeren en subtiele veranderingen track in zwerm gedrag. Eenmaal gevangen, worden de video's overgedragen aan een analyse / opslag computer met voldoende geheugen om te verwerken en op te slaan duizenden video's. De flexibiliteit van deze opstelling is nuttig gebleken om een aantal leden van de M. Xanthus gemeenschap.
Protocol
Benodigdheden:
- Klett meter
- Pipet en tips
- 2,5 ml microcentrifuge buizen
- Microcentrifuge
- CTTYE media:
- 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% gistextract (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- TPM media:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- Agarose
- Waterbad tot 55 ° C
- Glazen objectglaasjes
- Grote glazen coverslips
- 2 x 2 cm, 0,5 mm dik silicone rubber afdichting (Grace Bio-Lab Inc)
- Parafilm (of de etikettering tape)
- Pincet
- Kleine bindmiddel clips
- Micro-sampling pipet (Fisher)
- 100 pi glas wegwerpnaald (Fisher)
- Kimwipes
Deel 1: celpreparaat
Begin met het creëren van een steriele omgeving.
- Schone werkruimte, don handschoenen, en licht-brander.
- Start een overnachting cultuur van cellen door het enten in een kolf met CTTYE bouillon en geïncubeerd in het donker bij 32 ° C met een krachtige wervelende.
- Zodra de cultuur bereikt een dichtheid van 5 x 10 8 cellen / ml, pipet 1 ml cellen in een 2,5 ml microcentrifugebuis.
- Pellet cellen door centrifugatie gedurende 2 min bij 16.000 xg (of max. snelheid).
- Bezinken en gooi supernatant.
- Was celpellet met 1 ml TPM (zout-balanced, nutriënten-vrije media).
- opnieuw te schorten en vortex
- Re-pellet-cellen door het draaien van 2 min bij 16.000 xg (of max. snelheid).
- Bezinken en gooi supernatant.
Kritische stap - Volledig resuspendeer pellet in 100 ui TPM media met behulp van een combinatie van pipetteren en vortexen.
BELANGRIJK: Deze stap zorgt ervoor dat er geen groepjes van cellen nog in de buis. Dit kan een tijdje duren. - Leg de cellen bij kamertemperatuur, terwijl de voorbereiding van de tracking assay platen.
Deel 2: Agar Voorbereiding
- Bereid 50 ml van beide TPM (assay media) en CTTYE (voedingswaarde schijf) media.
- Voeg 0,5 g agarose aan elke (agarose is minder diffractieve dan agar).
- Autoclaaf steriliseren.
- Na sterilisatie, onderhouden van de media bij 55 ° C in een incubator (of water bad), terwijl de bouw van de tracking testplaat complexen.
Deel 3: Nutritive Disk Bouw
- Plaats een steriele 0,5 mm dik silicone rubber pakking op de bovenkant van een vlam-gesteriliseerde glazen microscoopglaasje, de vorming van een klein goed.
- Pipetteer ~ 300 ul van de 55 ° C CTTYE media / agarose in de put die door de pakking op de glijbaan en met de voedingswaarde schijf. De CTTYE media / agarose moet heuvel op.
- Plaats een vlam gesteriliseerd dia (zonder pakking) op de top van de CTTYE media / agarose.
BELANGRIJK: Deze glijbaan moet worden vastgelegd in een hoek om te bellen voorkomen van de vorming. - Zodra de slide is op zijn plaats, samen klem het complex met mini bindmiddel clips - een aan elke kant.
- Plaats de afgekapt complex bij 4 ° C en laat de CTTYE media / agarose in te stellen. Dit duurt meestal ongeveer 5 minuten.
Deel 4: Tracking Assay Voorbereiding - Set Up Plate Complexen
Monteer de componenten, de voorbereiding van de glijbaan complexen, plaats de voedingswaarde schijf, giet de TPM media / agarose, scheiden en droge plaat complexen, plaat-cellen, en monteren tracking testplaat complexen.
Monteren plaat complexe componenten
- Voor elk complex, vlam gesteriliseerd een glas microscoopglaasje
- Plaats een geautoclaveerd pakking op de bovenkant van de dia en zet opzij (gesteriliseerd kant naar boven). Dit zal de bodem van de test.
- Vlam steriliseren een glazen afdekplaat slip en te plaatsen op de top van een tweede glas microscoopglaasje omwikkeld met tape etikettering (of Parafilm) en opzij (gesteriliseerd kant naar boven) in te stellen. Dit wordt gebruikt als een ondersteuning van dia aan het dekglaasje te houden van kraken. Dit zal de top van de test.
- Vlam steriliseren derde glas microscoopglaasje en zet ze opzij (gesteriliseerd kant naar boven). Dit zal gebruikt worden om de agarose plat.
BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de pakkingen vormen een afdichting met het glas door het naar beneden met een pincet, anders zal de media / agarose kan uitdrogen.
P kant voedingswaarde schijf
BELANGRIJK: de stappen 5 tot 10 moet worden gedaan om een dia complex op een moment, anders de media / agarose kon beginnen te stollen wat resulteert in een slechte film kwaliteit.
- Verwijder de voedende schijf complexe vorm 4 ° C (stap 5 uit deel 3) en elkaar de dia's het blootstellen van de inmiddels gestolde CTTYE / agarose wrikken.
- Verwijder een 1 mm diameter 'voedende disk' van de CTTYE media / agarose goed hierboven beschreven met behulp van een micro-sampling pipet met een 100 ui glas disposable tip en plaats het in de put die door de pakking op de cover slip (stap 3 hierboven) .
Giet platen
Kritische stap
- Pipetteer ~ 300 ul van de 55 ° C TPM media / agarose in de put die door de pakking op het deksel glijden en met de voedingswaarde schijf. De TPM-media / agarose moet heuvel op.
Kritische stap - Plaats de vlam gesteriliseerd slide zonder pakking (uit stap 3) op de top van de TPM media / agarose.
BELANGRIJK: Deze glijbaan moet worden vastgelegd in een hoek om te bellen voorkomen van de vorming. - Zodra de dia (van stap 5) is op zijn plaats, samen klem het complex met mini bindmiddel clips - een aan elke kant.
- Plaats de afgekapt complex bij 4 ° C en laat de media / agarose in te stellen. Dit duurt meestal ongeveer 5 minuten.
Afzonderlijke en droge platen
BELANGRIJK: Om de media / agarose uitdroging te voorkomen, de stappen 11 tot en met 20 mogen alleen worden uitgevoerd op een dia complex tegelijk.
BELANGRIJK: Voor de beste resultaten, de stappen 11 tot en met 13 moet worden uitgevoerd bij 4 ° C.
- Zodra de media / agarose heeft, verwijdert u het bindmiddel clips en knijp het einde van het complex aan de tape-wrapped slide los te maken.
- Verwijder de tape omwikkelde schuiven en plaats het op de bank voor verder gebruik.
Kritische stap - Met behulp van een tang als een wig, scheid de dekglas / pakking / media / agarose complex van de ondersteuning dia (zonder pakking) en gooi ondersteuning van dia.
BELANGRIJK: Gebruik geen nieuwsgierige motie om de dekglas / pakking complex te scheiden. Dit kan resulteren in het dekglas breken en / of de media / agarose vasthouden aan de ondersteuning van dia. - Plaats het deksel slip / pakking / media / agarose complex op de tape omwikkelde slide (pakking kant naar boven) en verwijder van 4 ° C. Plaats dit complex naast een brander, zodat alle zichtbare vocht verdampen uit de nieuw blootgesteld media / agarose oppervlakte - niet meer dan een minuut.
BELANGRIJK: Laat de media / agarose droog te lang, omdat dit gevolgen kunnen hebben voor de M. Xanthus zwerm gedrag.
Plaat cellen
Kritische stap
- Zodra het vocht verdampt is, pipetteer 0,5 ul van de geconcentreerde cellen (stap 8 uit deel 1) op de media / agarose ongeveer 1 mm afstand van de voedingsstoffen schijf.
BELANGRIJK: Het is uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat de cellen worden afgezet door het verplaatsen van de pipet recht naar beneden en dan recht omhoog. Dit zorgt ervoor dat de zwerm ronde worden.
BELANGRIJK: Het is uitermate belangrijk dat u de pipettip touch van de media / agarose. Dit zal een depressie op het oppervlak en het gedrag van de M. Xanthus zwerm.
TIP: Druk de pipet tip voor het benaderen van de media / agarose. Dit zal een daling van cellen om te verschijnen aan de onderkant van de pipet tip en het gemakkelijker om de cellen storting te maken. - Zodra de cellen worden gedeponeerd, plaats het complex naast de brander, zodat de cel plek om droog - niet meer dan 20 sec.
Monteer assay
- Zodra de cel plek is opgedroogd, lijnt u de dia / pakking complex (uit stap 1) met de pakking op de cover slip / pakking / media / agarose / cel complex (vanaf stap 13) en voorzichtig samen te drukken om een afdichting te vormen.
Kritische stap - Reinig de oppervlakken van de glijbaan en dekglas met een Kimwipe aan het residu achtergelaten door de Parafilm te verwijderen. De ingevulde test moet Figuur 1 lijken.
- Plaats de ingevulde schuif complex op de verwarmde podium gehandhaafd op 32 ° C (naar beneden schuiven, dekglas up) onmiddellijk na het vegen van (stap 15) om condensatie vormen vorming te voorkomen. Als zich condens heeft gevormd, laten glijden complex zitten op het verwarmde podium voor een aantal seconden voordat het beeld acquisitie software.
- Kies het juiste doel (2x, 4x of 10x).
Deel 5: Voorbereiding Movie
t "> kritieke stap- Zet de camera en de microscoop, en controleer de lichtniveaus (zorg ervoor dat het licht is niet al te intensief). Start de computer en open de afbeelding acquisitie programma.
- Klik op het live-beeld scherm en focus van de microscoop. Het beeld zou moeten lijken op de een gezien in figuur 3. Let op de uniforme agar oppervlak.
- Start het verwerven van beelden.
Kritische stap - Controleer regelmatig de focus tijdens het eerste uur, zoals de media / agar de neiging om zich te vestigen waardoor de focus naar drift.
- Schone werkplek.
- Zodra image acquisitie is afgerond, overdracht verworven beelden voor opslag en breken van de glijbaan af complex door het weken in 90% ethanol 's nachts.
- Autoclaaf pakkingen voor hergebruik.
Figuur 1. Cartoon illustratie van de TM plaat complex. (A) toont de basis TM plaat complex in exploded view en doorsnede. (B) toont het gebruik van grotere pakkingen.
Figuur 2. Microscope cluster. Elke microscoop knooppunt (inzet) bestaat uit een Nikon E400 microscoop, de doelstellingen, een verwarmd podium, een Insight camera en een laptop computer. Elk knooppunt is een netwerk samen en gekoppeld aan een master controller computer. Twee van de knooppunten zijn opgezet met fluorescentie mogelijkheden die bestaan uit de Exfo lichtbron en twee Uniblitz rolluiken.
Figuur 3. 20X Een beeld van tracking test apparatuur op tijd = 0. Schaal bar, 1 mm.
Figuur 4. Aanpassingsvermogen van de TM plaat complex. (A) een 100X beeld van M. Xanthus glijden beweeglijkheid op CTTYE in 1,0% agar. (B) een 20X beeld van P. aeruginosa trillen beweeglijkheid. (C) een 20x image S. marcescens zwermen beweeglijkheid. Beide (B) en (C) werden getest op LB in 1,0% agar. (D) een 40X beeld van M. smegmatis schuiven beweeglijkheid op LB-in 0,5% agar. Dit beeld werd vastgelegd met behulp van de alternatieve test-configuratie te zien in Fig 1B.
Video 1. Een time-lapse video van een zwerm onderworpen aan de tracking test.
Video 2. Een time-lapse video van een M. Xanthus zwerm waarbij 1% van de cellen fluorescent gelabelde. Afwisselend fase-contrast-en tl-beelden werden gevangen genomen en hij overtoog de positie van fluorescerende cellen toe te lichten binnen de zwerm. Deze video werd gevangen op CTTYE in 1,0% agar.
Video 3. Een time-lapse video van M. Xanthus zweefvliegen beweeglijkheid. Deze video werd gevangen op CTTYE in 1,0% agar.
Video 4. Een time-lapse video van P. aeruginosa trillen beweeglijkheid. Deze video werd gevangen op LB in 1,0% agar.
Video 5. Een time-lapse video van S. marcescens zwermen beweeglijkheid. Deze video werd gevangen op LB in 1,0% agar.
Video 6. Een time-lapse video van M. smegmatis schuiven beweeglijkheid. Deze video werd gevangen op LB bij 0,5% agar met behulp van de alternatieve test-configuratie te zien in Fig 1B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse microcinematography (TM) is uitgegroeid tot een standaard aanpak voor het bestuderen van prokaryote beweeglijkheid 2-7. Traditioneel wordt TM uitgevoerd met behulp van papieren filter lonten, dun agar pads, of agar platen als substraten 8-11. Deze methoden zijn adequaat en kosteneffectief wanneer gebruikt om de afbeelding reeksen voor algemene illustraties van bacteriële beweging te genereren. Echter, als beeldsequenties moet resulteren in het genereren van reproduceerbare en kwantitatief betrouwbare gegevens, deze methoden zijn tijdrovend en enigszins onbetrouwbaar. Kan bijvoorbeeld variaties in deze technieken wordt veroorzaakt door menselijke fouten leiden tot een breed scala van onjuistheden, van onregelmatigheden in de agar oppervlak dat sterk van invloed kunnen zijn op het gedrag van de bacteriën wordt bestudeerd om de verschillen in het brandvlak van de ene kant van de test substraat naar de andere. Voor het oplossen van deze problemen, hebben we een TM plaat complex dat is voldoende constante kwaliteit om reproduceerbare resultaten op te leveren door het gebruik van siliconen pakkingen die zowel goedkoop en herbruikbaar (afb. 1). Daarnaast is de plaat complex is zeer aanpasbaar en heeft bewezen om gehydrateerd te blijven en voldoende zuurstof voor meer dan een week over een verscheidenheid aan mediatypen en-agar concentraties.
Ter bevordering van het genereren van time-lapse filmpjes, waren acht Nikon E400 microscopen uitgerust met 2X, 4X, 10X en de doelstellingen per stuk. Daarnaast werd een Insight camera (Diagnostic Instruments, Inc), en een verwarmd podium (20/20 Technologies) verworven voor elke microscoop. Elke camera was verbonden met een notebook computer waarop de zeer beïnvloedbare afbeelding acquisitie software SPOT (Diagnostic Instruments, Inc) was geïnstalleerd. Alle verschillende onderdelen werden geassembleerd in knooppunten, die elk bestaan uit een microscoop, drie doelstellingen, een Insight camera, een verwarmd podium, en een controlerende computer. Elk van de acht knooppunten zijn netwerk samen te brengen in een cluster en gekoppeld aan een opslag computer die wordt gebruikt voor het verzamelen, analyseren en de time-lapse video's gegenereerd door de cluster (afb. 2) op te slaan. De opslag computer is uitgerust met een 1 terabyte RAID-systeem, dat nodig is om de enorme hoeveelheid gegevens die zijn gegenereerd door het cluster op te slaan.
Eenmaal voltooid, wordt de plaat complex op de verwarmde tafel van de microscoop en tracking test wordt gestart. De beelden werden op vooraf ingestelde intervallen die worden bepaald op basis van de beweeglijkheid snelheid van de cellen. Bijvoorbeeld individuele M. Xanthus cellen verplaatsen zich met een snelheid van ongeveer een cel lengte per minuut. Als de afbeeldingen worden verworven van een M. Xanthus zwerm op hetzelfde tarief (een beeld per minuut), zal de resulterende time-lapse video vloeiend weergegeven tijdens het afspelen. Zodra het beeld acquisitie is afgerond, worden de beelden samengevoegd tot een sequentiële matrix en speelde terug op een voldoende tarief dat ze lijken te bewegen (Video. 1). Deze time-lapse video kan nu worden geanalyseerd met behulp van een aantal softwarepakketten.
Variaties op assay. TM plaat complex is zeer aanpasbaar en kan gebruikt worden om een groot aantal verschillende micro-organismen te visualiseren onder verschillende voorwaarden. Zwerm visualisatie kan worden uitgevoerd met fase-contrast microscopie (welke records het gedrag van de zwerm als een enkele entiteit), fluorescentie microscopie (welke records het gedrag van individuele fluorescerende cellen die zijn verdund in een niet-fluorescerende populatie), of een combinatie van beide (die overlays afwisselend sequentiële fase-contrast-en tl-beelden) (Video 2). De plaat complex is gebruikt om met succes het genereren van time-lapse video van een aantal prokaryotische gedragingen waaronder M. Xanthus zweefvliegen beweeglijkheid, Pseudomonas aeruginosa twitching beweeglijkheid, Seratia marcescens zwermende beweeglijkheid, en de roman Mycobacterium smegmatis schuiven beweeglijkheid (afb. 4 en video's 3-6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mogelijk gemaakt door een National Science Foundation Career Award (MCB-0746066, Karakterisering van transcriptionele activators die Emergent gedrag te reguleren) naar RDW
We zijn dankbaar voor LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, en HG Taylor voor nuttige discussies en commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M.
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
