Summary
勉強する
Abstract
δ-プロテオバクテリアMyxococcusザンザスの群れは、環境の手がかりへの応答として、複雑な、動的なパターンを作成するために一連の信号を通じて、集団的、協調運動として作用する細胞の数百万が含まれています。これらのパターンは、自己組織化と創発であり、それらは個々の細胞の挙動を観察することによって予測することはできません。タイムラプスmicrocinematography追跡アッセイを用いて、我々は、M.の明確な緊急のパターンを同定したザンザスは、そのソース1に向けて栄養勾配まで群れの指示運動として定義されて、走化性と呼ばれる。
効率的にタイムラプスmicrocinematographyを経由して走化性を特徴付けるために、我々は高度に変更可能なプレート複合体を開発した（図1）と8顕微鏡（図2）、キャプチャタイムラプスビデオの各能力のクラスタを構築した。アッセイは、定量データの一貫性のある複製を可能にするのに十分厳格であり、結果のビデオは、私たちは群れの行動の微妙な変化を観察し、追跡することができます。一度キャプチャ、ビデオはビデオの何千もの処理および格納するのに十分なメモリと分析/ストレージコンピュータに転送されます。このセットアップの柔軟性は、M.のいくつかのメンバーに役立っていますザンザスコミュニティ。
Protocol
消耗品は必要なもの：
- クレットメートル
- ピペットとヒント
- 2.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ
- マイクロ遠心機
- CTTYEメディア：
- 1.0％Casitone（ディフコ社）、0.5％酵母エキス（ディフコ社）、
- 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を
- TPMメディア：
- 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を
- アガロース
- 55 ° Cに設定したウォーターバス
- 顕微鏡用スライドガラス
- 大きなガラス製カバースリップ
- 2 × 2センチ、0.5 mm厚のシリコーンゴムガスケット（グレースバイオラボ社）
- パラフィルム（またはテープにラベルを付ける）
- 鉗子
- 小さなバインダークリップ
- マイクロサンプリングピペット（フィッシャー）
- 100μlのガラスディスポチップ（フィッシャー）
- キムワイプ
パート1：セルの準備
無菌環境を作成することから始めます。
- クリーンワークスペース、ドン手袋、および光バーナー。
- CTTYEブロスを含むフラスコに接種し、精力的な渦巻きで32℃の暗所でインキュベートして細胞の一晩培養を開始します。
- かつての文化は、2.5 mlマイクロチューブに5 × 10 8細胞/ ml、ピペット1mlの細胞の密度に達した。
- 16000 XG（または最高速度）で2分間の遠心分離により細胞をペレット化する。
- デカントして上清を捨てる。
- 1ミリリットルTPM（塩バランス、栄養培地）で細胞ペレットを洗浄する。
- 再サスペンドと渦
- 16000 XG（または最高速度）で2分間回転させて再細胞をペレット化。
- デカントして上清を捨てる。
重要なステップ - 完全にピペッティングし、ボルテックスの組み合わせを使用して100μlのTPMのメディアでペレットを再懸濁する。
重要：このステップでは、チューブに残っている細胞のない塊がないことを保証します。これには時間がかかることがあります。 - 追跡アッセイプレートを準備しながら、室温で脇にセルを設定します。
パート2：寒天の準備
- TPM（アッセイ培地）とCTTYE（栄養ディスク）メディアの両方を50mlを準備します。
- 各（アガロースは寒天より小さい回折である）で0.5 Gアガロースを追加。
- 滅菌にオートクレーブ。
- 追跡アッセイプレートの複合体を構築しながら滅菌した後、55℃インキュベーターでC（または水浴）でメディアを維持する。
パート3：ニュートリティブディスクの構築
- 小さなウェルを形成、火炎滅菌したガラスの顕微鏡スライドの上に滅菌した0.5 mm厚のシリコーンゴムのガスケットを置きます。
- ピペットでよく、スライド上のガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃CTTYEメディア/アガロースを300μl。 CTTYEメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。
- CTTYEメディア/アガロースの上に火炎滅菌スライドを（なしガスケット付き）に置きます。
重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 - スライドが配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。
- 4℃をクリップコンプレックスを置き、CTTYEメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。
パート4：追跡アッセイの準備 - プレート錯体を設定
、コンポーネントを組み立てるスライドの複合体を準備し、栄養ディスクを置き、TPMメディア/アガロースを注ぎ、別と乾板の複合体、プレートの細胞を、そして追跡アッセイプレートの複合体を組み立てる。
プレート複雑なコンポーネントを組み立てる
- それぞれ複雑なため、炎がガラスの顕微鏡スライドを滅菌
- スライドの上にオートクレーブガスケットを配置して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アッセイの底部を形成することになる。
- 炎は、ガラスのカバースリップを滅菌し、第2のガラス顕微鏡スライドラベルテープ（またはパラフィルム）で包み、（側を上に滅菌）取っておくの上に置きます。これは、クラッキングからカバースリップを保つためにサポートのスライドとして使用されます。これは、アッセイの上部を形成することになる。
- 炎はサードガラスの顕微鏡スライドを滅菌して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アガロースを平らにするために使用されます。
重要：ガスケットは、鉗子でそれを押すことで、ガラスとのシールを形成することを確認し、そうでなければメディア/アガロースが完全に乾くことがあります。
P栄養ディスクをレース
重要：手順5〜10は、一度に複雑な1枚のスライドに行う必要があります、それ以外のメディア/アガロースは悪いムービーの画質が得固化し始めることができます。
- 栄養ディスク複雑なフォームを削除4 ° C（パート3からステップ5）と、今固化CTTYE /アガロースを公開するスライドを離れてテコで。
- よく100μlのガラス使い捨てチップとマイクロサンプリングピペットを用いて、上記CTTYEメディア/アガロースから直径1mm"栄養ディスク'を削除してもカバースリップ（上記手順3）でガスケットによって作成されたに入れてください。
プレートに注ぎ
重要なステップ
- ピペットでよくカバースリップでガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃TPMメディア/アガロースを300μl。 TPMメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。
重要なステップ - TPMメディア/アガロースの上にないガスケット（ステップ3から）を持つ火炎滅菌スライドを置きます。
重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 - スライドは、（ステップ5から）配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。
- 4で切り取られた複雑なを置き° Cとメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。
独立したと乾板
重要：乾燥からメディア/アガロースを防ぐために、〜20手順11は、一度に一つのスライドの複雑で実行する必要があります。
重要：最良の結果を得るには、11〜13を工程は4で実施されるべき℃の
- メディア/アガロース設定した後、バインダークリップを削除し、テープでラップされたスライドを緩めるために複雑なの終わりを絞る。
- テープラップされたスライドを削除し、後で使用できるようにベンチの上に置きます。
重要なステップ - ウェッジとして鉗子を使用して、サポートのスライド（なしガスケット付き）からカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体を分離し、サポートのスライドを捨てる。
重要：カバースリップ/ガスケット複合体を分離するために詮索好きなモーションを使用しないでください。これにより、カバーガラスの破壊及び/またはメディア/アガロース支持のスライドに付着する可能性があります。 - テープによって包まれたスライドにカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体（ガスケットのある面を上に）配置し、4から削除℃まで以上より1分 - すべて目に見える水分が新たに露出したメディア/アガロース表面から蒸発できるように、バーナーへのこの複雑な横に置きます。
重要：これはM.に影響を与える可能性があるとして長すぎるためにメディア/アガロース乾燥をさせてくださいザンザス群れ行動。
プレートの細胞
重要なステップ
- 一度、余分な水分は、離れて栄養ディスクからメディア/アガロース約1mm上に濃縮された細胞（パート1から手順8）のピペット0.5μlを蒸発している。
重要：細胞がまっすぐにまっすぐ下にしてからピペットを移動することによって堆積されていることを確認することが極めて重要です。これは群れが円形になることが保証されます。
重要：これは、メディア/アガロースにピペットの先端に触れないように非常に重要です。これは、表面にうつ病を行い、M.の動作を変更しますザンザス群れ。
ヒント：メディア/アガロースに近づいて前にピペットチップを押圧し。これは、セルのドロップがピペットの先端の下部に表示されるとそれが簡単に細胞を付着させるようにすることができます。 - 一度細胞が堆積され、細胞のスポットを乾燥させるためにバーナーへの複雑な次を配置 - は20を超える秒。
アッセイを組み立てる
- セルのスポットが乾燥した後、カバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース/細胞複合体（ステップ13から）上のガスケットとスライド/ガスケットの複合体を（ステップ1から）に合わせ、ゆっくりと軸シールを形成するために一緒に押します。
重要なステップ - スライドの表面を清掃し、パラフィルムで残留物を除去するためにキムワイプでスリップをカバー。完成したアッセイは、図1のようになります。
- すぐに結露のフォームを防止するために（ステップ15）ワイプの後に32 ° C（スライドダウン、アップスリップカバー）に維持加熱ステージ上で複雑な完成したスライドを置きます。結露が形成されている場合は、複雑なスライドが画像集録ソフトウェアを起動する前に数秒間加熱ステージの上に座ってみましょう。
- 適切な目標を（、2X 4X、または10倍）を選択します。
パート5：ムービーの準備
T">重要なステップ- カメラと顕微鏡の電源をオンにして、（光が強すぎるではないことを確認してください）光のレベルを確認してください。コンピュータを起動し、画像取得プログラムを開きます。
- ライブ画像のウィンドウをクリックして、顕微鏡の焦点を合わせる。画像は、図3に見られるもののように表示されるはずです。均一な寒天の表面に注目してください。
- 画像を取得開始します。
重要なステップ - メディア/寒天がドリフトにフォーカスを引き起こして解決する傾向があるので、1時間の間、定期的にフォーカスを確認してください。
- 作業領域をきれいに。
- 画像の取り込みが完了すると、転送はストレージ用の画像を取得し、一晩90％エタノールに浸漬することによってスライド複合体を分解する。
- 再利用のためにオートクレーブガスケット。
図1。TMプレートの複雑なの漫画イラスト。 （A）分解図と断面図の基本的なTMのプレートコンプレックスを示しています。 （B）より大きいガスケットの使用方法を示します。
図2顕微鏡のクラスタ。各顕微鏡のノードは、（挿入図）ニコンE400顕微鏡、目標、加熱ステージ、インサイトのカメラ、およびノートブックコンピュータで構成されています。各ノードが相互にネットワーク接続し、マスタコントローラのコンピュータにリンクされています。ノードの二つは、EXFO光源二Uniblitzのシャッターで構成される蛍光の機能を使用して設定されます。
図3。追跡アッセイ装置の20倍の画像を一度に= 0。スケールバーは1mm。
図4。TMプレートの複合体の適応性。 M.の（A）100Xの画像1.0％寒天でCTTYE上ザンザス滑走運動。 Pの（B）20Xの画像緑膿菌は運動性をけいれん。 （C）20X画像S.マルセッセンスでは、運動性を分封。両方（B）と（C）は1.0％の寒天のLBで検定した。 M.の（D）40 ×画像スメグマチスは、0.5％寒天のLBで運動をスライディング。この画像は、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して捕獲した。
ビデオ1。追跡アッセイに供群れのタイムラプスビデオ。
M.のビデオ2。タイムラプスビデオ細胞の1％が蛍光標識されているザンザス群れ。交互位相コントラストおよび蛍光画像がキャプチャされ、群れの中で蛍光細胞の位置を明らかにするために重ねていた。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。
M.のビデオ3。タイムラプスビデオザンザス滑走運動。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。
P.のビデオは、4。タイムラプスビデオ緑膿菌は運動性をけいれん。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。
ビデオ5。S.のタイムラプスビデオマルセッセンスでは、運動性を分封。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。
ビデオ6。M.のタイムラプスビデオチスは運動性をスライディング。このビデオは、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して、0.5％寒天のLBでキャプチャされました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
タイムラプスmicrocinematography（TM）は、原核生物の運動性2-7を研究するための一般的な手法となっています。伝統的に、TMは、基板8から11のようにろ紙の芯、薄い寒天パッド、または寒天のスラブを使用して実行されます。細菌の運動の一般的なイラストのためのイメージシーケンスを生成するために使用するときにこれらのメソッドは効果が十分とコストです。しかし、イメージシーケンスの再現性と定量的に厳密なデータが生成される必要がある場合は、これらの方法は時間がかかり、やや信頼性に欠けます。例えば、ヒューマンエラーによって引き起こされるこれらの技術の変化は、劇的に測定基板の一方の側から焦点面の違いに研究されている細菌の挙動に影響を与える可能性の寒天表面の不規則性から、不正確な記述の広い配列につながる可能性があります他に。これらの問題を解決するために、我々は、（図1）の両方安価および再利用が可能なシリコンガスケットを採用することにより、再現性のある結果を得るために十分に一貫した品質であるTMプレート複合体を設計しました。さらに、プレートの複合体が高度に変更可能であり、メディアタイプと寒天濃度の様々な上に一週間以上水和と十分に酸素とどまることが証明されています。
タイムラプスムービーの生成を容易にするために、8ニコンE400顕微鏡は、2X 4X、および10倍の目標それぞれに装備された。さらに、インサイトのカメラ（診断インスツルメンツ社）、及び加熱ステージ（20/20テクノロジーズ）は、それぞれの顕微鏡のために買収された。各カメラは、高度に変更可能な画像取得ソフトウエアのSPOT（診断インスツルメンツ社）がインストールされていた先のノートブックコンピュータにリンクされている。すべてのさまざまなコンポーネントは、ノード、顕微鏡、3つの目標は、Insightカメラ、加熱ステージ、および制御コンピュータから構成される各々に組み立てられた。 8つのノードのそれぞれは、クラスタに相互にネットワーク接続して、コンパイルし、分析、およびクラスタ（図2）によって生成されたタイムラプスビデオを保存するために使用されるストレージのコンピュータにリンクされていた。ストレージコンピュータは、クラスタによって生成される膨大なデータを保存するために必要な1テラバイトのRAIDシステム、装備された。
完了したら、板の複合体は、顕微鏡の加熱ステージ上に配置され、追跡アッセイが開始されます。画像は、細胞の運動速度に基づいて決定されている事前に設定された間隔で取得されています。たとえば、個々のM.ザンザス細胞は毎分約つのセルの長さの速度で移動する。画像は、M.が取得されている場合同じ速度（1分ごとに1画像）でザンザス群れは、結果としてタイムラプスビデオは、再生時に滑らかに表示されます。画像の取り込みが完了すると、画像がシーケンシャル行列にコンパイルし、彼らが（Video. 1）動いているように表示されていることを十分な速度で再生されます。この時間経過のビデオは、現在、様々なソフトウェアパッケージを使用して分析することができます。
アッセイのバリエーション。TMプレートの複合体が高度に変更可能であり、さまざまな条件下で多くの異なる微生物を視覚化するために使用することができます。群れの可視化は、位相差顕微鏡（単一のエンティティとして群れの行動を記録する）、蛍光顕微鏡（非蛍光集団で希釈されている個々の蛍光細胞の挙動を記録する）、またはそれらの組み合わせを使用して実行することができます両方（位相コントラストシーケンシャルと蛍光画像を交互に重ね合わせたもの）（ビデオ2）の。プレートの複合体は、正常M.含むいくつかの原核生物の行動のタイムラプスビデオを生成するために使用されていますザンザス滑走運動、 緑膿菌けいれん運動性、運動性をウォーミングSeratiaのマルセッセンス 、そして斬新なマイコバクテリウムスメグマスライド運動性（図4および動画3-6）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、RDWの国立科学財団のキャリア賞（MCB - 0746066、創発行動を規制する転写活性化因子の特性）によって可能となった
私たちは、原稿上で有用な議論やコメントのためのLJシムカス、BSゴールドマン、G.孫、M.歌手、LGウェルチ、KAマーフィー、およびHGテイラーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M.
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
