Summary
Per studiare
Abstract
Uno sciame di δ-proteobacterium Myxococcus xanthus contiene milioni di cellule che agiscono come un collettivo, il movimento coordinamento attraverso una serie di segnali per creare complessi, i modelli dinamici come risposta a stimoli ambientali. Questi modelli sono auto-organizzazione ed emergenti, non può essere previsto osservando il comportamento delle singole celle. Utilizzando un time-lapse analisi monitoraggio microcinematografia, abbiamo identificato un modello distinto emergente in M. xanthus chiamato chemiotassi, definito come il movimento diretto di uno sciame di un gradiente di nutrienti verso la sua sorgente 1.
Al fine di caratterizzare in modo efficiente chemiotassi tramite time-lapse microcinematografia, abbiamo sviluppato un piatto altamente modificabile complesso (Figura 1) e costruito un cluster di 8 microscopi (Figura 2), ciascuno in grado di catturare video time-lapse. Il test è sufficientemente rigorosa per consentire la replicazione coerente di dati quantificabili, e il video risultante ci permettono di osservare e tracciare i cambiamenti sottili nel comportamento sciame. Una volta catturati, i video vengono trasferiti ad una analisi / storage computer con memoria sufficiente per elaborare e memorizzare migliaia di video. La flessibilità di questa configurazione è dimostrato utile a diversi membri della M. xanthus comunità.
Protocol
Forniture necessarie:
- Klett metro
- Pipetta e suggerimenti
- Microprovette 2,5 ml
- Microcentrifuga
- CTTYE media:
- 1,0% Casitone (Laboratori Difco), estratto di lievito 0,5% (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4
- TPM media:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8.0 mM MgSO 4
- Agarosio
- Bagnomaria regolato a 55 ° C
- Vetrini per microscopio
- Coprioggetto di vetro di grandi dimensioni
- 2 x 2 cm, 0.5 mm di spessore guarnizione in gomma di silicone (Grazia Bio-Lab Inc.)
- Parafilm (o nastro etichettatura)
- Forcipe
- Clip legante piccoli
- Micro-campionamento pipetta (Fisher)
- 100 microlitri punta di vetro monouso (Fisher)
- Kimwipes
Parte 1: Preparazione cellulare
Iniziamo creando un ambiente sterile.
- Pulire lavoro, indossare guanti, e bruciatore luce.
- Avviare una cultura durante la notte di cellule da inoculare in un pallone contenente brodo CTTYE e incubate al buio a 32 ° C, rimestando vigoroso.
- Una volta che la cultura ha raggiunto una densità di 5 x 10 8 cellule / ml, pipetta da 1 ml di cellule in una provetta 2,5 ml.
- Celle a pellet per centrifugazione per 2 minuti a 16.000 xg (o la velocità max).
- Decantare il surnatante e gettarlo.
- Lavare il pellet con 1 ml di TPM (sale-bilanciato, nutriente senza media).
- risospendere e vortice
- Re-pellet cellule facendo girare per 2 minuti a 16.000 xg (o la velocità max).
- Decantare il surnatante e gettarlo.
PUNTO CRITICO - Completamente risospendere pellet in 100 mezzi TPM microlitri utilizzando una combinazione di pipettaggio e vortex.
IMPORTANTE: Questo passaggio garantisce che non ci siano grumi di cellule sinistra nel tubo. Questa operazione potrebbe richiedere un po '. - Impostare le celle da parte a temperatura ambiente durante la preparazione delle piastre test di monitoraggio.
Parte 2: Preparazione Agar
- Preparare 50 ml di entrambi i TPM (saggio di media) e CTTYE (disco nutritivo) dei media.
- Aggiungere 0,5 g di agarosio ad ogni (agarosio è meno diffrazione di agar).
- Autoclave per la sterilizzazione.
- Dopo la sterilizzazione, mantenere i media a 55 ° C in un incubatore (o bagnomaria), mentre la costruzione del monitoraggio complessi micropiastra.
Parte 3: Costruzione del disco Nutritive
- Inserire una sterile 0,5 mm di spessore guarnizione in gomma siliconica sulla cima di una fiamma sterilizzato vetrino microscopio, formando un piccolo pozzo.
- Pipettare ~ 300 microlitri della 55 ° C CTTYE media / agarosio nel pozzo creato dalla guarnizione della diapositiva e contenente il disco nutritive. I media CTTYE / agarosio deve tumulo alto.
- Posizionare un vetrino sterilizzato fiamma (senza guarnizione) sulla parte superiore del supporto CTTYE / agarosio.
IMPORTANTE: Questa diapositive devono essere stabilite con un angolo per evitare la formazione di bolle. - Una volta che la diapositiva è a posto, bloccare il complesso insieme legante mini clip - uno su ciascun lato.
- Posizionare il complesso tagliato a 4 ° C e lasciare i media CTTYE / agarosio da impostare. Questo richiede di solito circa 5 min.
Parte 4: Preparazione del saggio di monitoraggio - Set Up Complessi Piastra
Assemblare i componenti, preparare i complessi di diapositive, posizionare il disco nutritive, versare i media TPM / agarosio, complessi piastra separata e secco, le cellule piatto, e assemblare il monitoraggio complessi micropiastra.
Assemblare componenti piastra complessi
- Per ogni complesso, fiamma sterilizzato un vetrino per microscopio
- Posizionare una guarnizione in autoclave sulla parte superiore del vetrino e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Ciò costituirà la base del test.
- Fiamma sterilizzare una copertura in vetro antiscivolo e posizionarlo in cima ad una seconda diapositiva microscopio vetro avvolto con nastro etichettatura (o Parafilm) e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Questo viene utilizzato come una diapositiva supporto per mantenere le coprioggetto di cracking. Questa sarà la parte superiore del test.
- Sterilizzate terzo vetrino da microscopio in vetro e mettere da parte (sterilizzato verso l'alto). Questo sarà usato per appiattire l'agarosio.
IMPORTANTE: Assicurarsi che le guarnizioni forma un sigillo con il vetro premendolo verso il basso con pinza, altrimenti la media / agarosio potrebbe seccare.
P pizzo disco nutritive
IMPORTANTE: passaggi da 5 a 10 deve essere fatto per un complesso diapositiva alla volta, altrimenti i media / agarosio potrebbe iniziare a solidificare con conseguente scarsa qualità del film.
- Rimuovere il modulo nutritive disco complesso 4 ° C (passo 5 da parte 3) e indagare separatamente le diapositive esporre l'ormai solidificato CTTYE / agarosio.
- Rimuovere un 1 'disco nutritivi' mm di diametro dai media CTTYE / agarosio ben descritta sopra utilizzando una micro-pipetta di campionamento con una punta di 100 microlitri bicchiere usa e getta e metterla nel pozzo creata dalla guarnizione sul vetrino (punto 3) .
Versare nelle piastre
PUNTO CRITICO
- Pipettare ~ 300 microlitri della 55 ° C TPM media / agarosio nel pozzo creato dalla guarnizione sul vetrino e contenente il disco nutritive. I media TPM / agarosio deve tumulo alto.
PUNTO CRITICO - Posizionare il vetrino fiamma sterilizzato senza guarnizione (dal punto 3) sulla parte superiore del supporto TPM / agarosio.
IMPORTANTE: Questa diapositive devono essere stabilite con un angolo per evitare la formazione di bolle. - Una volta che la diapositiva (dal punto 5) è in posizione, bloccare il complesso insieme legante mini clip - uno su ciascun lato.
- Posizionare il complesso tagliato a 4 ° C e lasciare i mezzi di comunicazione / agarosio da impostare. Questo richiede di solito circa 5 min.
Lastre separate e asciutto
IMPORTANTE: per evitare che i media / agarosio si secchi, i passaggi da 11 a 20 deve essere eseguita solo su un complesso diapositiva alla volta.
IMPORTANTE: Per ottenere i migliori risultati, i passaggi da 11 a 13 deve essere eseguita a 4 ° C.
- Una volta che i media / agarosio ha creato, rimuovere la clip legante e spremere la fine del complesso per allentare il nastro avvolto diapositive.
- Rimuovere il nastro avvolto diapositive e metterlo in panchina per un ulteriore uso.
PUNTO CRITICO - Utilizzando pinze come un cuneo, separare la polizza di copertura / guarnizione / media / agarosio complesso dalla diapositiva di supporto (senza guarnizione) e scartare scivolo supporto.
IMPORTANTE: Non usare un movimento indiscreti per separare la polizza di copertura / complesso guarnizione. Questo potrebbe causare la rottura slittamento copertura e / o il media / agarosio attenersi alla diapositiva supporto. - Collocare il vetrino / guarnizione / media / agarosio complesso sul nastro avvolto scivolo (lato guarnizione in su) e togliere dal 4 ° C. Inserire questo accanto ad un complesso bruciatore per permettere a tutti evaporare l'umidità visibile dalla recente esposizione media / agarosio superficie - non più di 1 min.
IMPORTANTE: Non lasciare che la media / agarosio a secco per troppo tempo in quanto ciò potrebbe influire il M. xanthus sciame comportamento.
Piastra di cellule
PUNTO CRITICO
- Una volta che l'umidità in eccesso è evaporata, pipettare 0,5 l di cellule concentrate (punto 8 da parte 1) sul supporto / agarosio circa 1 mm di distanza dal disco di nutrienti.
IMPORTANTE: E 'estremamente importante assicurarsi che le cellule si depositano spostando la pipetta verso il basso e poi verso l'alto. Questo assicura che lo sciame sarà circolare.
IMPORTANTE: E 'estremamente importante non toccare la punta della pipetta ai media / agarosio. Questo farà una depressione sulla superficie e cambiare il comportamento del M. xanthus sciame.
SUGGERIMENTO: Premere la punta della pipetta prima di avvicinarsi ai media / agarosio. Questo permetterà una goccia di cellule ad apparire sul fondo la punta della pipetta e rendere più facile per depositare le cellule. - Una volta che le cellule sono depositate, luogo il prossimo complesso al bruciatore per consentire lo spot cellulare a secco - non più di 20 sec.
Assemblare test
- Una volta che lo spot cellulare si è asciugato, allineare la diapositiva / guarnizione complesso (dal punto 1) con la guarnizione sul vetrino / guarnizione / media / agarosio / cellulari complessi (dal punto 13) e premere delicatamente insieme per formare un sigillo.
PUNTO CRITICO - Pulire le superfici del vetrino e coprire scivolare con un Kimwipe per rimuovere i residui lasciati dai Parafilm. Il test completato dovrebbe essere simile a Figura 1.
- Posizionare il complesso scivolo completato la fase di riscaldamento mantenuta a 32 ° C (scivolare verso il basso, coprire scivolare verso l'alto) subito dopo pulire (passo 15) per evitare che forma la formazione di condensa. In caso di formazione di condensa, lasciare riposare complesso scivolare sul palco riscaldato per alcuni secondi prima di avviare il software di acquisizione immagini.
- Scegli l'obiettivo appropriato (2X, 4X o 10X).
Parte 5: Preparazione del film
t "> PUNTO CRITICO- Accendere la fotocamera e il microscopio, e controllare i livelli di luce (assicuratevi che la luce non è troppo intenso). Avviare il computer e aprire il programma di acquisizione delle immagini.
- Fare clic sulla finestra dell'immagine dal vivo e mettere a fuoco il microscopio. L'immagine dovrebbe essere simile a quello visto in Figura 3. Si noti la superficie uniforme agar.
- Avviare l'acquisizione di immagini.
PUNTO CRITICO - Controllare regolarmente la messa a fuoco durante la prima ora, come i media / agar tende a sedimentare causando la messa a fuoco ad andare alla deriva.
- Pulire l'area di lavoro.
- Una volta che l'acquisizione delle immagini è completa, il trasferimento delle immagini acquisite per la conservazione e abbattere il complesso diapositiva immersione in etanolo al 90% durante la notte.
- Guarnizioni autoclave per il riutilizzo.
Figura 1. Cartoon illustrazione del complesso piastra TM. (A) mostra la piastra di base complesso TM in vista esplosa e sezione. (B) mostra l'uso di grandi guarnizioni.
Figura 2. Grappolo microscopio. Ogni nodo microscopio (nel riquadro) è costituito da un microscopio Nikon E400, obiettivi, uno stadio riscaldato, una fotocamera Insight, e un computer portatile. Ogni nodo è in rete tra loro e collegati ad un computer master controller. Due i nodi sono configurati con capacità di fluorescenza che consistono della sorgente di luce EXFO e due ante Uniblitz.
Figura 3. Un 20X immagine di apparati di analisi di tracciamento al tempo = 0. Scala grafica, 1 mm.
Figura 4. Adattabilità del complesso piastra TM. (A) una immagine 100X di M. xanthus scivolando sulla motilità CTTYE a 1,0% agar. (B) un 20X l'immagine di P. aeruginosa spasmi motilità. (C) un 20X immagine S. marcescens brulicante motilità. Entrambi (B) e (C) sono stati analizzati con LB nel 1,0% agar. (D) una immagine 40X di M. smegmatis scorrevole motilità su LB nello 0,5% agar. Questa immagine è stata scattata con la configurazione alternativa test visto in Fig. 1B.
Video 1. Un time-lapse video di uno sciame sottoposto al test di rilevamento.
Video 2. Un time-lapse video di un M. xanthus sciame dove 1% delle cellule sono marcate. Alternando immagini a contrasto di fase e fluorescenti sono stati catturati e sovrapposti per chiarire la posizione delle cellule fluorescenti all'interno dello sciame. Questo video è stato catturato il CTTYE a 1,0% agar.
Video 3. Un time-lapse video di M. xanthus deltaplano motilità. Questo video è stato catturato il CTTYE a 1,0% agar.
Video 4. Un time-lapse video di P. aeruginosa spasmi motilità. Questo video è stato catturato su LB nel 1,0% agar.
Video 5. Un time-lapse video di S. marcescens brulicante motilità. Questo video è stato catturato su LB nel 1,0% agar.
Video 6. Un time-lapse video di M. smegmatis scorrevole motilità. Questo video è stato catturato su LB nello 0,5% agar utilizzando la configurazione alternativa test visto in Fig. 1B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse microcinematografia (TM) è diventato un approccio standard allo studio della motilità procarioti 2-7. Tradizionalmente, TM viene eseguita utilizzando stoppini carta da filtro, pastiglie agar sottile, o lastre di agar come substrati 8-11. Questi metodi sono adeguati ed economicamente efficace quando usata per generare sequenze di immagini per le illustrazioni generale del movimento dei batteri. Tuttavia, se le sequenze di immagini deve comportare la generazione di dati riproducibili e quantitativamente rigorosa, questi metodi richiedono molto tempo e poco affidabili. Per esempio, variazioni di queste tecniche causate da errori umani potrebbe portare ad una vasta gamma di imprecisioni, dalle irregolarità della superficie agar che potrebbero influenzare notevolmente il comportamento dei batteri in fase di studio delle differenze nel piano focale da un lato del supporto saggio all'altro. Per risolvere questi problemi, abbiamo progettato un complesso piatto TM che è di qualità sufficientemente coerente per ottenere risultati riproducibili utilizzando guarnizioni in silicone che sono sia poco costoso e riutilizzabili (Fig. 1). Inoltre, il complesso piastra è altamente modificabile e ha dimostrato di rimanere idratata e sufficientemente ossigenato per più di una settimana su una varietà di supporti e le concentrazioni di agar.
Per facilitare la creazione di filmati time-lapse, 8 Nikon E400 microscopi sono stati equipaggiati con obiettivi 2X, 4X e 10X ciascuno. Inoltre, una fotocamera Insight (Diagnostic Instruments, Inc.), e uno stadio riscaldato (20/20 Technologies) è stata acquistata per ogni microscopio. Ogni telecamera è collegata ad un computer portatile su cui l'immagine altamente modificabili SPOT acquisizione del software (Diagnostic Instruments, Inc.) era stato installato. Tutti i vari componenti sono stati assemblati in nodi, ognuno composto da un microscopio, tre obiettivi, una telecamera Insight, uno stadio riscaldato, e un computer di controllo. Ognuno degli otto nodi sono stati collegati in rete in un cluster e collegati ad un computer di stoccaggio che viene utilizzato per compilare, analizzare e memorizzare il time-lapse video generato dal cluster (Fig. 2). Il computer di stoccaggio è stato dotato di un sistema RAID 1 terabyte, che è necessario per archiviare la grande quantità di dati generati dal cluster.
Una volta completato, il complesso piatto è posto sul palco riscaldato del microscopio e test di monitoraggio è iniziata. Le immagini vengono acquisite ad intervalli prestabiliti che sono determinate sulla base del tasso motilità delle cellule. Per esempio, i singoli M. xanthus cellule si muovono a una velocità di circa una lunghezza di cellule al minuto. Se le immagini sono acquisite di M. xanthus sciame a quella stessa velocità (una immagine al minuto), il conseguente time-lapse video apparirà liscio durante la riproduzione. Una volta che l'acquisizione delle immagini è completa, le immagini sono raccolte in una matrice sequenziale e riprodotti a un ritmo sufficiente che esse sembrano essere in movimento (Video. 1). Questo time-lapse video possono ora essere analizzati utilizzando una varietà pacchetti software.
Variazioni sul saggio. Il complesso piastra TM è altamente modificabile e può essere utilizzato per visualizzare molti microrganismi diversi in una varietà di condizioni. Visualizzazione sciame può essere effettuata utilizzando la microscopia a contrasto di fase (che registra il comportamento dello sciame come una singola entità), microscopia a fluorescenza (che registra il comportamento delle singole cellule fluorescenti che sono stati diluiti in modo non fluorescente popolazione), o una combinazione di entrambi (che si sovrappone alternata sequenziale a contrasto di fase ed immagini fluorescenti) (Video 2). Il complesso piastra è stata utilizzata per generare con successo time-lapse dei video di alcuni comportamenti procariotiche tra cui M. xanthus deltaplano motilità, Pseudomonas aeruginosa motilità spasmi, marcescens Seratia brulicante motilità, e il romanzo Mycobacterium motilità smegmatis scorrevole (Fig. 4 e Video 3-6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata resa possibile da una carriera premio National Science Foundation (MCB-0746066, Caratterizzazione di attivatori trascrizionali che regolano il comportamento emergente) per RDW
Siamo grati a LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, e HG Taylor per utili discussioni e commenti sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
- Taylor, R. G., Welch, R. D. Chemotaxis as an emergent property of a swarm. J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).
- Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation. J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).
- Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein. Science. 310, 855-857 (2005).
- Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging. Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).
- Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure. J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).
- Dworkin, M., Eide, D. Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients. J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).
- Dworkin, M.
- Wu, S. S., Kaiser, D. Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).
- Bustamante, V. H., Martínez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals. Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).
