Summary
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Abstract
δ - proteobacterium Myxococcus 산투스의 메뚜기는 환경 단서에 대한 응답으로 복잡하고 역동적인 패턴을 만드는 일련의 신호를 통해 집단, 운동 조정 역할을 수백만의 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 패턴은 자기 조직 및 응급되며 이들은 각각의 세포의 동작을 관찰하여 예측할 수 없습니다. 시간 저속 microcinematography 추적 분석을 사용하여, 우리는 M.의 독특한 응급 패턴을 식별 산투스는 소스 한 방향으로 영양 구배까지 메뚜기 떼의 지시 운동으로 정의, chemotaxis를했다.
효율적으로 시간 저속 microcinematography 통해 chemotaxis를 특성화하기 위해, 우리는 매우 수정할 플레이트 복합 개발 (그림 1) 8 현미경 (그림 2), 캡처 시간 경과 비디오의 각 능력의 클러스터를 구축. 분석은 데이터의 일관성 같지는 복제를 허용하는 정도로 엄격하고, 그 결과 동영상은 우리가 메뚜기 동작에 미묘한 변화를 관찰하고 추적할 수 있습니다. 일단 캡처, 동영상은 동영상의 수천을 처리하고 저장하기 위해 충분한 메모리와 분석 / 저장 장치 컴퓨터로 전송됩니다. 이 설정의 유연성이 입증되었습니다 M. 여러 회원에게 유용합니다 산투스 커뮤니티입니다.
Protocol
소모품이 필요 :
- Klett m
- 피펫 및 팁
- 2.5 ML microcentrifuge 튜브
- Microcentrifuge
- CTTYE 미디어 :
- 1.0 %의 Casitone (Difco 연구소), 0.5 % 효모 추출물 (Difco 연구소),
- 10.0 MM 트리스 - HCL (산도 8.0), 1.0 MM KH 2 PO 4, 8.0 MM MgSO 4
- TPM 미디어 :
- 10.0 MM 트리스 - HCL (산도 8.0), 1.0 MM KH 2 PO 4, 8.0 MM MgSO 4
- 아가로 오스
- 물 목욕 55로 설정 ° C
- 유리 현미경 슬라이드
- 대형 유리 coverslips
- 2 X 2cm, 0.5 - mm 두께 실리콘 고무 개스킷 (그레이스 생물 연구소 주식 회사)
- Parafilm (또는 라벨 테이프)
- 집게
- 작은 바인더 클립
- 마이크로 샘플링 피펫 (피셔)
- 100 μl 유리 일회용 팁 (피셔)
- Kimwipes
1 부 : 셀 준비
멸균 환경을 생성하여 시작합니다.
- 깨끗한 작업 공간, 돈 장갑, 가벼운 버너.
- CTTYE의 국물이 들어있는 플라스크에 inoculating과 활발한 소용돌이와 32 ° C에서 어둠 속에 incubated에 의해 세포의 야간 문화를 시작합니다.
- 일단 문화 5 X 10 8 셀 / ML, 2.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫 1 ML 세포의 밀도에 도달했습니다.
- 16,000 XG (또는 최대 속도) 2 분 원심 분리하여 세포 펠렛.
- 가만히 따르다 및 뜨는 폐기.
- 1 ML TPM (소금 균형, 영양 무료 미디어)와 세포 펠렛을 씻으십시오.
- 다시 정지와 소용돌이
- 16,000 XG (또는 최대 속도) 2 분 회전하여 다시 펠릿 세포.
- 가만히 따르다 및 뜨는 폐기.
임계 단계 - 완전히 pipetting과 vortexing의 조합을 사용하여 100 μl TPM 미디어에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
중요 :이 단계는 튜브에 남아있는 세포에 대한 대단히 짧은 시간이 없다는 것을 보장합니다. 이것은 시간이 걸릴 수 있습니다. - 추적 검정 접시를 준비하는 동안 실온에서 별도로 세포를 설정합니다.
2 부 : 아가르 준비
- TPM (검정 미디어)와 CTTYE (영양 디스크) 미디어 모두 50 ML을 준비합니다.
- 각 (아가로 오스는 한천 미만 diffractive)로 0.5 g 아가로 오스를 추가합니다.
- 소독을 압력솥.
- 살균 후 55에서 미디어를 유지 ° 인큐베이터에서 C (또는 물 목욕)의 추적 분석 플레이트 단지를 건설하는 동안.
3 부 : 영양 디스크 건설
- 작은 우물을 형성, 불꽃 - 소독 유리 현미경 슬라이드 위에 멸균 0.5 - mm 두께 실리콘 고무 가스켓를 놓습니다.
- 피펫 ~ 55 300 μl ° 아니라 슬라이드에있는 근육에 의해 만들어지고 영양 디스크를 포함하는으로 C CTTYE 미디어 / 아가로 오스. CTTYE 미디어 / 아가로 오스가 마운드해야합니다.
- CTTYE 미디어 / 아가로 오스 위에 화염 소독 슬라이드 (NO 가스켓 포함) 놓습니다.
중요 :이 슬라이드에서 거품 형성을 방지하기 위해 각도로 아래로 설정해야합니다. - 슬라이드가 자리에되면, 미니 바인더 클립과 함께 복잡한 클램프 - 하나를 양쪽에.
- 4 잘린 복잡한 플레이스 ° C 및 CTTYE 미디어 / 아가로 오스가 설정할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 약 5 분 정도 소요됩니다.
4 부 : 추적 분석 준비 - 플레이트 단지를 설정
부품을 조립, 슬라이드 단지를 준비 영양 디스크를 장소, TPM 미디어 / 아가로 오스, 별도의 건조 판 단지, 접시 세포 및 분석 플레이트 단지를 추적 조립을 따라줘.
판 복잡한 구성 요소를 조립
- 각각의 복잡한 경우, 불꽃이 유리 현미경 슬라이드를 살균
- 슬라이드 위에 autoclaved 가스켓을 놓고 (측면을 소독) 따로 설정할 수 있습니다. 이것은 분석의 바닥을 형성합니다.
- 화염 유리 커버 슬립과 장소를 라벨 테이프 (또는 Parafilm)로 감싸 두 번째 유리 현미경 슬라이드 위에와 (측면을 소독) 따로 세트를 소독. 이것은 균열에서 coverslip을 유지하기 위해 지원하는 슬라이드로 사용됩니다. 이것은 분석의 상단을 형성합니다.
- 화염 세 번째 유리 현미경 슬라이드를 소독하고 (측면을 소독) 따로 설정할 수 있습니다. 이것은 아가로 오스를 평평하게하는 데 사용됩니다.
중요 : 가스켓은 집게로 아래로 눌러 유리 인감 양식을 확인하십시오, 그렇지 않으면 미디어 / 아가로 오스 밖으로 건조 수 있습니다.
피 영양 디스크 레이스
중요 : 10까지 5 단계는 한 번에 하나의 슬라이드 복합 수행되어야하며 그렇지 않으면 미디어 / 아가로 오스는 좋지 영화 품질 결과 응고 시작 수 있습니다.
- 영양 디스크 복잡한 형태를 제거 4 ° C (일부 3 ~ 5 단계)와 지금은 경화 CTTYE / 아가로 오스를 노출 슬라이드를 따로 캐내다.
- 물론 100 μl 유리 일회용 팁과 마이크로 샘플링 피펫을 사용하여 위에서 설명한 CTTYE 미디어 / 아가로 오스에서 1mm 직경 '영양 디스크'를 제거하고 잘 커버 슬립 (위 3 단계)에있는 근육에 의해 만들어진에 배치 .
접시를 부어
임계 단계
- 피펫 ~ 55 300 μl ° 잘 커버 슬립과 영양 디스크를 포함하는에있는 근육에 의해 만들어진로 C TPM 미디어 / 아가로 오스. TPM 미디어 / 아가로 오스가 마운드해야합니다.
임계 단계 - TPM 미디어 / 아가로 오스 위에없이 개스킷 (3 단계부터)과 함께 화염 소독을 슬라이드를 삽입합니다.
중요 :이 슬라이드에서 거품 형성을 방지하기 위해 각도로 아래로 설정해야합니다. - 슬라이드 (5 단계에서) 위치에되면, 미니 바인더 클립과 함께 복잡한 클램프 - 하나를 양쪽에.
- 4 잘린 복잡한 플레이스 ° C와 미디어 / 아가로 오스가 설정할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 약 5 분 정도 소요됩니다.
별도의 건조 접시
중요 : 밖으로 건조에서 미디어 / 아가로 오스를 방지하기 위해, 20을 통해 11은 한 번에 하나의 슬라이드 복잡한에서 수행되어야합니다 단계를 반복합니다.
중요 : 최상의 결과를 얻으려면 13을 통해 11 단계 4에서 수행되어야 ° C.
- 미디어 / 아가로 오스가 설정되면, 바인더 클립을 제거하고 테이프 싼 슬라이드를 풀어야하는 복잡의 끝을 쥐어 짜기.
- 테이프 싼 슬라이드를 제거하고 더 사용하기 위해 벤치에 놓으십시오.
임계 단계 - 쐐기로 집게를 사용하여 지원 슬라이드 (NO 가스켓 포함)에서 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 복잡한 분리 및 지원 슬라이드를 폐기하십시오.
중요 : 커버 슬립 / 개스킷 복잡한를 구분 캐고 움직임을 사용하지 마십시오. 이것은 커버 슬립 위반 및 / 또는 미디어 / 아가로 오스 지원 슬라이드를 지키는가 발생할 수 있습니다. - 테이프 싼 슬라이드 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 복합 (가스켓 사이드까지)을 놓고 4 삭제 ° C. 모두 표시 습기가 새로 노출된 미디어 / 아가로 오스 표면에서 증발하도록 버너이 복잡한 옆의 플레이스 - 2 개 이상의 분.
중요 :이 너무 오래를위한 미디어 / 아가로 오스 건조를 못하게하면 M. 영향을 미칠 수 산투스 떼를 동작.
플레이트 세포
임계 단계
- 일단 과잉 수분이 떨어져 영양소 디스크에서 미디어 / 아가로 오스 약 1mm에 집중 세포 (일부 1 ~ 8 단계)의 피펫 0.5 μl를 증발했다.
중요 : 그것은 세포가 곧장 그리고 똑바로 피펫을 이동하여 입금되었는지 확인하기 위해 매우 중요합니다. 이것은 무리가 순환 수 있도록합니다.
중요 : 미디어 / 아가로 오스에 피펫 팁을 터치하지 않는 매우 중요합니다. 이것은 표면에 우울증을 만들고 M.의 동작을 변경합니다 산투스 무리.
팁 : 미디어 / 아가로 오스에 접근하기 전에 피펫 팁을 조준해. 이것은 세포의 드롭은 피펫 팁의 하단에 표시하고 쉽게 세포를 입금 할 수 있습니다. - 세포가 침전되면, 버너에 대한 복잡한 옆에는 셀 자리가 건조 수 있도록 장소 - 아니 20 개 이상의 초.
분석을 조립
- 셀 명소가 건조되면, 커버 슬립 / 가스켓 / 미디어 / 아가로 오스 / 전지 복합 (단계 13 일부터)에 가스켓과 함께 슬라이드 / 가스켓 복잡한 (1 단계) 정렬 부드럽게 도장을 형성하기 위해 함께 누르십시오.
임계 단계 - 슬라이드의 표면을 깨끗이하고 Parafilm로 남아있는 찌꺼기를 제거하는 Kimwipe와 전표를 커버. 완성된 분석은 그림 1과 유사합니다.
- 32 ° C로 유지 열띤 무대에서 완성된 슬라이드 복잡한 플레이스 (슬라이드 아래, 슬립 커버) 결로 양식 형성을 방지하기 위해 (15 단계) 아래로 닦아 즉시. 결로가 생긴 경우, 이미지 수집 소프트웨어를 시작하기 전에 몇 초 동안 가열 무대에서 슬라이드 복잡한 앉아하자.
- 적절한 목표를 (2X 4X 또는 10X)을 선택합니다.
제 5 부 : 영화 준비
t "> 임계 단계- 카메라와 현미경 켜고, 그리고 (빛이 너무 강렬하지 있는지 확인) 빛의 레벨을 확인하십시오. 컴퓨터를 시작하고 이미지 수집 프로그램을 엽니다.
- 라이브 이미지 창을 클릭하고 현미경을 집중. 이미지는 그림 3에서 본 것과 유사하게 나타납니다. 유니폼 한천 표면을 확인합니다.
- 이미지를 인수 시작합니다.
임계 단계 - 미디어 / 한천은 포커스가 표류하는 원인 해결하는 경향으로, 첫번째 시간 동안 정기적으로 초점을 확인합니다.
- 작업 공간을 청소하십시오.
- 이미지 수집이 완료되면 전송은 스토리지에 대한 이미지를 획득하여 야간 90 % 에탄올에 몸을 담글하여 슬라이드 복잡한을 파괴.
- 재사용을 위해 압력솥 가스켓.
그림 1. TM 판 복합 만화 그림. (A) 분해도 및 크로스 섹션에서 기본 TM 플레이트 복잡한를 보여줍니다. (B) 큰 가스켓의 사용을 보여줍니다.
그림 2. 현미경 클러스터. 각 현미경의 노드 (삽입된 페이지) 니콘 E400 현미경, 목표, 열띤 무대, 인사이트 카메라 및 노트북 컴퓨터로 구성되어 있습니다. 각 노드는 네트워크와 함께 마스터 컨트롤러 컴퓨터에 연결되어 있습니다. 노드의 두 가지가 EXFO 광원 두 Uniblitz 셔터로 구성되어 형광 기능을 설정할 수 있습니다.
그림 3. 추적 분석 장치의 20X 이미지 번에 = 0. 스케일 바, 1mm.
그림 4. TM 판 복합 적응력. M.의 (A) 100X 이미지 1.0 %의 한천에서 CTTYE에 산투스 글라이딩은 운동성. P.의 (B) 20X 이미지 녹농균이라는 박테리아는 운동성을 꿈틀. (C) 20X 이미지 S. marcescens는 운동성 진을 치고. 모두 (B)와 (C)은 1.0 %의 한천에서 LB에 assayed했다. M.의 (D) 40X 이미지 smegmatis은 0.5 % 한천의 LB에 운동성 슬라이딩. 이 이미지는 그림의 1B에서 본 대안 분석 구성을 사용 생포되었습니다.
비디오 1. 추적 분석의 대상이 무리의 시간 경과 비디오.
M.의 비디오 2. 시간 경과 비디오 산투스 무리 어디 세포의 1 %는 찬란 표시됩니다. 교대 위상 콘트라스트와 형광 이미지 캡처와 무리 내에서 형광 세포의 위치를 명료하게하다에 겹쳐 있었다. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 CTTYE에서 촬영된되었습니다.
M.의 비디오 3. 시간 경과 비디오 산투스 글라이딩 운동성. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 CTTYE에서 촬영된되었습니다.
비디오 4. P.의 시간 경과 비디오 녹농균이라는 박테리아는 운동성을 꿈틀. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 LB에서 촬영된되었습니다.
비디오 5. S.의 시간 경과 비디오 marcescens는 운동성 진을 치고. 이 동영상은 1.0 %의 한천에서 LB에서 촬영된되었습니다.
비디오 6. M.의 시간 경과 비디오 smegmatis는 운동성 슬라이딩. 이 동영상은 그림의 1B에서 본 대안 분석 구성을 사용 0.5 % 한천의 LB에서 촬영된되었습니다.
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Discussion
시간 저속 microcinematography (TM)는 prokaryotic 운동성 2-7를 공부하기 위해 표준 접근되고 있습니다. 전통적으로, TM은 기판 8-11과 같은 필터를 종이로 빅스, 얇은 한천 패드, 또는 한천 슬라브를 사용하여 수행됩니다. 세균성 운동의 일반적인 삽화에 대한 이미지 시퀀스를 생성하는 데 사용하면 이러한 방법은 효과가 적절하고 비용이 있습니다. 그러나, 이미지 시퀀스 재현성 및 양적 엄격한 데이터의 생성 발생해야하는 경우, 이러한 방법은 시간이 소요되고 약간 신뢰할 수있다. 예를 들어, 인간의 오류로 인한 이러한 기술의 변화는 극적으로 분석 기판의 한쪽에서 초점 비행기의 차이로 연구되고있는 박테리아의 행동에 영향을 미칠 수있는 한천 표면에 부정에서 부정 확한 다양한으로 이어질 수 다른. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 (그림 1) 저렴하고 재사용 높은 실리콘 가스켓을 채용하여 재현성 결과를 얻을 충분히 일관성있는 품질입니다 TM 플레이트 단지를 설계했습니다. 또한, 플레이트 단지 높은 수정할 수 있으며 수산화 및 충분한 미디어 종류와 한천 농도의 다양한 이상 일주일 이상 산소있어 입증되었습니다.
시간 경과 영화의 생성을 촉진하기 위하여, 8 니콘 E400 현미경은 2X 4X, 10X 목표 및 각 복되었습니다. 또한, 통계 카메라 (진단 인스 트루먼 트 주식 회사), 그리고 온수 무대 (20분의 20 기술) 각 현미경에 대한 인수되었다. 각 카메라는 높은 수정할 이미지 수집 소프트웨어 스팟 (진단 인스 트루먼 트 주식 회사)가 설치되어 있었다있는 노트북 컴퓨터에 연결했습니다. 모든 다양한 구성 요소가 노드, 현미경, 세 가지 목표와, 인사이트 카메라, 열띤 무대 및 제어 컴퓨터로 구성된 각에 조립했습니다. 8 각 노드는 클러스터에 함께 네트워크하고, 컴파일, 분석 및 클러스터 (그림 2)에 의해 생성되는 시간 경과 비디오를 저장하는 데 사용되는 저장 장치 컴퓨터에 연결되었습니다. 스토리지 컴퓨터가 클러스터에 의해 생성된 데이터의 방대한 양을 저장하기 위해 필요한 1 테라 바이트의 RAID 시스템과 복을했다.
완료되면, 접시 복합은 현미경의 온수 무대에서 위치 및 추적 분석이 시작됩니다. 이미지는 세포의 운동성 속도에 따라 결정됩니다 미리 간격으로 취득하고 있습니다. 예를 들어, 개별 M. 산투스 세포는 분당 약 세포 길이의 속도로 이동합니다. 이미지 M.의 취득한 경우 같은 속도 (분당 하나의 이미지)에서 산투스 메뚜기는, 결과 시간 경과 비디오 재생 중에 원활하게 나타납니다. 이미지 수집가 완료되면 이미지가 순차적 매트릭스로 컴파일하여 그들이 (Video. 1) 이동으로 나타나는 충분한 속도로 재생됩니다. 이 시간 - 저속 비디오는 현재 다양한 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하실 수 있습니다.
어세이에 유사. TM 플레이트 복합 높은 수정할 수 있으며, 다양한 조건에서 여러 가지 미생물을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 메뚜기의 시각화는 위상 대비 현미경 (단일 엔터티로 무리의 행동을 기록하는), 형광 현미경 (비 형광 인구의 희석되어 개별 형광 세포의 동작을 기록하는), 또는 조합을 사용하여 수행할 수 모두 (연속 위상 콘트라스트와 형광 이미지를 교체하는 오버레이) (비디오 2).의 강판 복합이 성공적으로 M. 포함한 여러 prokaryotic 동작 시간 경과 비디오를 생성하는 데 사용되었습니다 산투스 글라이딩 운동성, 녹농균 꿈틀 운동성, 운동성 진을 치고 Seratia의 marcescens, 그리고 소설 Mycobacterium smegmatis 슬라이딩 운동성 (그림 4 및 비디오 3-6).
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 RDW에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (MCB - 0746066, 응급 행동을 규제 Transcriptional Activators의 특성)에 의해 가능하게되었다
우리는 LJ Shimkus, BS 골드만, G. Suen, M. 싱어, LG 웰치, KA 머피 및 원고에 도움이 토론 및 의견을 HG 테일러에게 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
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