Summary
Zur Untersuchung
Abstract
Ein Schwarm der δ-Proteobakterium Myxococcus xanthus enthält Millionen von Zellen, die als Kollektiv, die Koordination der Bewegung durch eine Reihe von Signalen bis hin zu komplexen, dynamischen Muster als Reaktion auf Umweltreize zu schaffen zu handeln. Diese Muster sind sich selbst organisierende und emergente, sie können nicht durch die Beobachtung des Verhaltens der einzelnen Zellen vorhergesagt werden. Mit einem Zeitraffer-microcinematography Tracking-Assay identifizierten wir eine deutliche emergent Muster in M. xanthus als Chemotaxis, definiert als die gerichtete Bewegung von einem Schwarm eine Nährstoff-Gradienten in Richtung seiner Quelle 1.
Um effizient zu charakterisieren Chemotaxis über Zeitraffer-microcinematography, entwickelten wir eine stark modifizierbar Platte Komplex (Abbildung 1) und konstruiert ein Cluster von 8 Mikroskope (Abbildung 2), die jeweils für den Fang von Zeitraffer-Videos. Der Test ist streng genug, um konsistente Replikation von quantifizierbaren Daten zu ermöglichen, und die daraus resultierenden Videos ermöglichen es uns, zu beobachten und zu verfolgen subtile Veränderungen in Schwarmverhalten. Einmal erfasst, sind die Videos auf einer Analyse / Lagerung Computer mit genügend Arbeitsspeicher zur Verarbeitung und Speicherung Tausende von Videos übertragen. Die Flexibilität dieser Einrichtung hat sich bewährt, mehrere Mitglieder der M. xanthus Gemeinschaft.
Protocol
Zubehör benötigt:
- Klett-Meter
- Pipette und Spitzen
- 2,5 ml Reaktionsgefäße
- Microcentrifuge
- CTTYE Medien:
- 1,0% Casitone (Difco Laboratories), 0,5% Hefeextrakt (Difco Laboratories),
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- TPM-Medien:
- 10,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1,0 mM KH 2 PO 4, 8,0 mM MgSO 4
- Agarose
- Wasserbad gesetzt, um 55 ° C
- Glasobjektträger
- Große Deckgläser
- 2 x 2 cm, 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung (Grace Bio-Lab Inc.)
- Parafilm (oder Etikettierung Band)
- Zange
- Kleine Binder Clips
- Micro-Sampling Pipette (Fisher)
- 100 ul Glas Einweg-Spitze (Fisher)
- Kimwipes
Teil 1: Cell Preparation
Erstellen Sie zunächst eine sterile Umgebung.
- Saubere Arbeitsbereich, don Handschuhe und Licht-Brenner.
- Starten Sie eine Übernacht-Kultur von Zellen durch Impfen in einen Kolben mit CTTYE Brühe und im Dunkeln inkubiert bei 32 ° C unter kräftigem Rühren.
- Sobald die Kultur erreicht eine Dichte von 5 x 10 8 Zellen / ml, 1 ml Zellen in ein 2,5 ml Reaktionsgefäß.
- Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit).
- Dekantieren und Überstand verwerfen.
- Wash Zellpellet mit 1 ml TPM (Salz-ausgewogene, nährstoffreiche freien Medien).
- resuspendieren und vortexen
- Re-Pellet-Zellen durch Spinnen für 2 min bei 16.000 xg (oder max Geschwindigkeit).
- Dekantieren und Überstand verwerfen.
Entscheidender Schritt - Komplett neu einzustellen Pellet in 100 ul TPM Medien mit einer Kombination aus Pipettieren und Vortexen.
WICHTIG: Dieser Schritt stellt sicher, dass es keine Zellklumpen in die Röhre gelassen. Dies kann eine Weile dauern. - Stellen Sie die Zellen neben bei Raumtemperatur während der Vorbereitung der Tracking-Assay-Platten.
Teil 2: Agar Vorbereitung
- Bereiten Sie 50 ml der beiden TPM (Assay Medien) und CTTYE (nutritive Disk)-Medien.
- Geben Sie 0,5 g Agarose jedem (Agarose ist weniger als diffraktive Agar).
- Autoklaven sterilisieren.
- Nach der Sterilisation, pflegen die Medien bei 55 ° C in einem Inkubator (oder Wasserbad) beim Bau des Tracking Assayplatte Komplexe.
Teil 3: Nutritive Disk-Bau
- Legen Sie eine sterile 0,5-mm-dicke Silikon-Gummi-Dichtung auf einer Flamme sterilisiert Glasobjektträger und bilden eine kleine, gut.
- Pipette ~ 300 ul der 55 ° C CTTYE media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf der Folie erstellt und enthält die Nährstoffe speichern. Die CTTYE media / Agarose sollte Erdhügel auf.
- Legen Sie eine Flamme sterilisiert slide (ohne Dichtung) auf der Oberseite des CTTYE media / Agarose.
WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. - Sobald die Schiene ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite.
- Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen die CTTYE media / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min.
Teil 4: Tracking Assay Vorbereitung - Set Up Platte Komplexe
Montieren Sie die Komponenten, bereiten Sie das Dia-Komplexe, legen Sie die nutritive Festplatte, gießen Sie die TPM media / Agarose, separate und trocknen Platte Komplexe, Platten-Zellen, und montieren Tracking Assayplatte Komplexe.
Montieren Platte komplexe Bauteile
- Für jedes komplexe, schwer einen Glasobjektträger sterilisiert
- Ein autoklaviert Dichtung am oberen Rand der Folie und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies bildet den Boden des Assays.
- Flamme sterilisieren ein Deckglas und legen Sie es auf einem zweiten Glas Objektträger mit Kennzeichnung Band (oder Parafilm) gewickelt und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies ist als Unterstützung Folie, um das Deckglas vor Rissen zu halten verwendet. Diese bilden die Spitze des Assays.
- Flamme sterilisieren ein Drittel Glasobjektträger und beiseite stellen (sterilisiert Seite nach oben). Dies wird verwendet, um die Agarose abflachen werden.
WICHTIG: Sicherstellen, dass die Dichtungen eine Abdichtung mit dem Glas, indem Sie ihn mit einer Pinzette, da sonst die media / Agarose kann austrocknen.
P Spitzen nutritive Festplatte
WICHTIG: Schritte 5 bis 10 muss auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt erfolgen, da sonst die media / Agarose konnte beginnen sich zu verfestigen, was zu schlechter Bildqualität.
- Entfernen Sie die nutritive Festplatte komplexe Form 4 ° C (Schritt 5 von Teil 3) und hebeln auseinander Folien Freilegung der nun verfestigt CTTYE / Agarose.
- Entfernen eines 1 mm Durchmesser "nutritive disk" aus dem CTTYE media / Agarose auch oben mit einem Mikro-Probenahme-Pipette mit einer 100 ul Glas Einweg-Spitze beschrieben und legen Sie sie in die gut von der Dichtung auf das Deckglas (Schritt 3 oben) erstellt .
Platten gießen
Entscheidender Schritt
- Pipette ~ 300 ul der 55 ° C TPM media / Agarose in den Brunnen durch die Dichtung auf dem Deckglas und mit den nahrhaften Festplatte erstellt. Die TPM-media / Agarose sollte Erdhügel auf.
Entscheidender Schritt - Legen Sie die Flamme sterilisiert slide ohne Dichtung (aus Schritt 3) auf der Oberseite des TPM media / Agarose.
WICHTIG: Dieses Bild muss sich in einem Winkel zur Blasenbildung zu verhindern eingestellt werden. - Sobald die Folie (aus Schritt 5) ist vorhanden, klemmen Sie die komplexe zusammen mit Mini-Bindemittel-Clips - auf jeder Seite.
- Legen Sie die abgeschnitten Komplex bei 4 ° C und ermöglichen den Medien / Agarose eingestellt. Dies dauert in der Regel ca. 5 min.
Separate und trocken Platten
WICHTIG: Um die Medien / Agarose vor dem Austrocknen zu verhindern, die Schritte 11 bis 20 sollten nur auf einer Folie komplexe zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden.
WICHTIG: Für beste Ergebnisse, die Schritte 11 bis 13 sollte bei 4 ° C durchgeführt werden
- Nachdem die Medien / Agarose gesetzt hat, entfernen Sie das Bindemittel Clips und drücken Sie die Ende des Komplexes um das Band-gehüllt gleiten zu lösen.
- Entfernen Sie das Klebeband umwickelt-Rutsche und legen Sie es auf der Bank zur weiteren Verwendung.
Entscheidender Schritt - Mit einer Pinzette wie ein Keil, separate das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex von der Support-Folie (ohne Dichtung) und entsorgen Sie die Unterstützung gleiten.
WICHTIG: Verwenden Sie keine neugierigen Bewegung das Deckglas / Dichtung komplexen trennen. Dies könnte in das Deckglas zu brechen und / oder der Medien / Agarose Festhalten an der Unterstützung Rutsche führen. - Legen Sie das Deckglas / Dichtung / media / Agarose-Komplex auf dem Band-gehüllt slide (Dichtung nach oben) und entfernen von 4 ° C. Legen Sie diese komplexe neben einem Brenner, damit alle sichtbare Feuchtigkeit aus den neu freigelegten media / Agarose Oberfläche verdunsten - nicht mehr als 1 min.
WICHTIG: Lassen Sie sich nicht den Medien / Agarose trocken zu lange, da dies Auswirkungen auf die M. xanthus Schwarmverhalten.
Platte Zellen
Entscheidender Schritt
- Nachdem die überschüssige Feuchtigkeit verdunstet ist, Pipette 0,5 ul der konzentrierten Zellen (Schritt 8 aus Teil 1) auf das Medium / Agarose ca. 1 mm von der Nährstoff-Festplatte.
WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen, indem Sie die Pipette senkrecht nach unten und dann gerade nach oben abgelegt werden. Dies gewährleistet, dass der Schwarm wird kreisförmig sein.
WICHTIG: Es ist äußerst wichtig, nicht die Pipettenspitze an die Medien / Agarose berühren. Dies wird eine Depression auf der Oberfläche zu machen und das Verhalten des M. xanthus Schwarm.
TIPP: Halten Sie die Pipette vor Annäherung an die Medien / Agarose. Dies ermöglicht einen Rückgang von Zellen auf der Unterseite der Pipettenspitze erscheinen und machen es leichter, die Zellen zu hinterlegen. - Sobald die Zellen abgeschieden werden, statt sich der Komplex neben dem Brenner, damit die Zelle vor Ort, um zu trocknen - nicht mehr als 20 sek.
Assemble-Test
- Sobald die Zelle vor Ort getrocknet ist, richten Sie die Folie / Dichtung Komplex (aus Schritt 1) mit der Dichtung auf das Deckglas / Dichtung / media / Agarose / Zelle-Komplex (aus Schritt 13) und sanft zusammen drücken, um eine Dichtung zu bilden.
Entscheidender Schritt - Reinigen Sie die Oberflächen der Folie und Deckglas mit einem Kimwipe dem Rückstand durch den Parafilm links entfernen. Der ausgefüllte Test sollte Abbildung 1 ähneln.
- Legen Sie das ausgefüllte Dia-Komplex auf der beheizten Bühne bei 32 ° C gehalten (nach unten rutschen, Deckglas nach oben) unmittelbar nach abwischen (Schritt 15), um Kondensation bilden bildung zu verhindern. Wenn sich Kondensation gebildet hat, lassen Sie schieben komplexen sitzen auf der beheizten Bühne für einige Sekunden vor dem Start der Bildaufnahme-Software.
- Wählen Sie das entsprechende Ziel (2X, 4X oder 10X).
Teil 5: Movie Vorbereitung
t "> entscheidender Schritt- Schalten Sie die Kamera und Mikroskop, und überprüfen Sie die Lichtverhältnisse (stellen Sie sicher, das Licht nicht zu intensiv). Starten Sie den Computer und öffnen Sie die Bildaufnahme-Programm.
- Klicken Sie auf das Live-Bild-Fenster und Fokus des Mikroskops. Das Bild sollte in etwa dem in Abbildung 3 zu sehen. Beachten Sie die einheitliche Agaroberfläche.
- Starten Erfassen von Bildern.
Entscheidender Schritt - Prüfen Sie die Fokussierung regelmäßig während der ersten Stunde, wie die Medien / Agar neigt sich absetzen was den Fokus auf Drift.
- Saubere Arbeit Bereich.
- Nach der Bildaufnahme beendet ist, erworben Übertragung von Bildern für die Lagerung und zum Abbau der Rutsche Komplex durch Einweichen in 90% Ethanol über Nacht.
- Autoclave Dichtungen für die Wiederverwendung.
Abbildung 1. Cartoon Illustration der TM Platte komplex. (A) zeigt den prinzipiellen TM Platte Komplex in Explosionsdarstellung und Querschnitt. (B) zeigt die Verwendung von größeren Dichtungen.
Abbildung 2. Mikroskop-Cluster. Jedes Mikroskop Knoten (kleines Bild) besteht aus einer Nikon E400 Mikroskop, Ziele, einen beheizten Bühne, ein Insight-Kamera und ein Notebook. Jeder Knoten ist vernetzt und verbunden mit einem Master-Controller-Computer. Zwei der Knoten sind mit Fluoreszenz-Funktionen, die der EXFO Lichtquelle und zwei Uniblitz Fensterläden bestehen gesetzt.
Abbildung 3. A 20X Bild von Tracking-Test Gerät zum Zeitpunkt = 0 ist. Scale-bar, 1 mm.
Abbildung 4. Anpassungsfähigkeit der TM Platte komplex. (A) eine 100x Bild von M. xanthus Gleiten Motilität auf CTTYE in 1,0% Agar. (B) einen 20X Bild von P. aeruginosa Zucken Motilität. (C) einen 20X Bild S. marcescens Schwärmen Motilität. Beide (B) und (C) wurden auf LB in 1,0% Agar untersucht. (D) ein 40X Bild von M. smegmatis Schiebetüren Motilität auf LB in 0,5% Agar. Dieses Bild wurde aufgenommen mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B.
Video 1. Ein Zeitraffer-Video eines Schwarms unterzogen, um die Tracking-Test.
Video 2. Ein Zeitraffer-Video eines M. xanthus Schwarm, wo 1% der Zellen sind fluoreszenzmarkierten. Wechselnde Phasen-Kontrast-und Fluoreszenz-Bilder wurden gefangen genommen und überlagert werden, um die Position der fluoreszierenden Zellen innerhalb des Schwarms zu erläutern. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen.
Video 3. Ein Zeitraffer-Video von M. xanthus Gleiten Motilität. Dieses Video wurde auf CTTYE in 1,0% Agar eingefangen.
Video 4. Ein Zeitraffer-Video von P. aeruginosa Zucken Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen.
Video 5. Ein Zeitraffer-Video von S. marcescens Schwärmen Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 1,0% Agar eingefangen.
Video 6. Ein Zeitraffer-Video von M. smegmatis Schiebetüren Motilität. Dieses Video wurde auf LB in 0,5% Agar mit dem alternativen Assaykonfiguration in Abb. 1B erfasst.
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Discussion
Zeitraffer-microcinematography (TM) hat sich zu einem Standard-Ansatz zur Untersuchung prokaryotischen Motilität 2-7. Traditionell wird TM mit Filterpapier Dochte, dünne Agar-Pads, oder Agar Platten als Substrate 8-11 durchgeführt. Diese Methoden sind ausreichende und kostengünstige, wenn verwendet, um Bildsequenzen für allgemeine Illustrationen von bakteriellen Bewegung zu erzeugen. Allerdings, wenn Bildsequenzen müssen bei der Erzeugung von reproduzierbaren und quantitativen strengen Daten führen, sind diese Methoden zeitaufwendig und etwas unzuverlässig. Zum Beispiel könnten Schwankungen in dieser Techniken durch menschliches Versagen verursacht, um eine breite Palette von Ungenauigkeiten führen, von Unregelmäßigkeiten in der Agar-Oberfläche, die dramatisch beeinflussen könnten das Verhalten der Bakterien wird auf Unterschiede in der Brennebene von einer Seite des Assaysubstrat studiert auf der anderen Seite. Um diese Probleme zu lösen, haben wir eine TM Platte komplex, dass eine ausreichend konstante Qualität, um reproduzierbare Ergebnisse durch den Einsatz von Silikon-Dichtungen, die sowohl kostengünstig und wiederverwendbar (Abb. 1) ergeben soll. Darüber hinaus ist die Platte komplexen stark modifizierbar und hat sich zu bleiben hydratisiert und ausreichend für mehr als eine Woche über eine Vielzahl von Medien und Agar-Konzentrationen mit Sauerstoff versorgt.
Zur Erleichterung der Generation der Zeitraffer-Filme wurden 8 Nikon E400 Mikroskope mit 2X, 4X, 10X und Ziele jedes ausgestattet. Darüber hinaus war eine Einsicht Kamera (Diagnostic Instruments, Inc.), und einen beheizten Bühne (20/20 Technologies) für jedes Mikroskop aufgenommen. Jede Kamera war auf einem Notebook-Computer, auf dem die stark modifizierbar Bildaufnahmesoftware SPOT (Diagnostic Instruments, Inc.) installiert worden war verbunden. All die verschiedenen Komponenten wurden in Knoten, die jeweils aus einem Mikroskop, drei Ziele, eine Insight-Kamera, einen beheizten Bühne, und eine Steuerung von Computer zusammengebaut. Jeder der acht Knoten wurden zusammen in einem Cluster vernetzt und mit einem Speicher-Computer, die verwendet werden, um zu kompilieren, analysieren und speichern Sie die Zeitraffer-Videos vom Cluster (Abb. 2) erzeugt wird. Die Speicherung Computer wurde mit einer 1-Terabyte-RAID-System, das benötigt wird, um die riesigen Datenmengen, die vom Cluster erzeugten Shop ist ausgestattet.
Wenn Sie fertig sind, wird die Platte Komplex auf dem Heiztisch des Mikroskops gelegt und Tracking-Test ist gestartet. Die Bilder werden in voreingestellten Intervallen, die aufgrund der Beweglichkeit der Zellen bestimmt werden erworben. Zum Beispiel, individuelle M. xanthus Zellen bewegen sich mit einer Rate von etwa einer Zelle Länge pro Minute. Wenn Bilder eines M. erworben xanthus Schwarm am selben Rate (ein Bild pro Minute), wird die resultierende Zeitraffer-Video glatt erscheinen während der Wiedergabe. Sobald das Bild Akquisition abgeschlossen ist, werden die Bilder in eine sequentielle Matrix zusammengestellt und abgespielt werden mit einer ausreichenden Geschwindigkeit, dass sie sich zu bewegen (Video. 1) erscheinen. Das Zeitraffer-Video kann nun analysiert unter Verwendung einer Vielzahl Softwarepakete werden.
Variationen über Assay. Die TM Platte Komplex ist stark modifizierbar und können verwendet werden, um viele verschiedene Mikroorganismen unter verschiedenen Bedingungen zu visualisieren. Swarm-Visualisierung kann mit Phasenkontrast-Mikroskopie (welche Datensätze das Verhalten des Schwarms als eine Einheit), Fluoreszenz-Mikroskopie (welche Datensätze das Verhalten der einzelnen fluoreszierenden Zellen, die in einem nicht-fluoreszierenden Bevölkerung wurden verwässert), oder eine Kombination der beiden (die Overlays abwechselnd aufeinanderfolgenden Phasen-Kontrast-und Fluoreszenz-Bilder) (Video 2). Die Platte Komplex wurde verwendet, um erfolgreich zu generieren Zeitraffer-Videos von mehreren prokaryotischen Verhaltensweisen einschließlich M. xanthus Gleiten Motilität, Pseudomonas aeruginosa Zucken Motilität, Seratia marcescens Schwärmen Motilität, und der Roman Mycobacterium smegmatis Schiebetüren Motilität (Abb. 4 und Videos 3-6).
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde ermöglicht durch eine National Science Foundation Career Award (MCB-0746066, Charakterisierung von Transkriptionsaktivatoren dass Emergent Verhalten zu regulieren), um RDW
Wir sind dankbar, dass LJ Shimkus, BS Goldman, G. Suen, M. Singer, LG Welch, KA Murphy, und HG Taylor für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0% Casitone | Difco Laboratories | ||
| 0.5% yeast extract | Difco Laboratories | ||
| Micro-sampling pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 μl glass disposable tip | Fisher Scientific | ||
| 2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket | Grace Bio-Lab Inc. |
References
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