जी प्रोटीन रिसेप्टर युग्मित spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग सहभागिता के vivo मात्रा में

Summary

एक spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रणाली काम करके, Forster अनुनाद ऊर्जा (झल्लाहट) स्थानांतरण क्षमता के पिक्सेल स्तर के नक्शे झिल्ली रिसेप्टर्स होमोसेक्सुअल oligomeric परिसरों फार्म धारणा व्यक्त की कोशिकाओं के लिए प्राप्त कर रहे हैं. दक्षता नक्शे झल्लाहट, हम अध्ययन के तहत oligomer जटिल के बारे में stoichiometric जानकारी का अनुमान करने में सक्षम हैं.

Protocol

1. प्लाज्मिड डिजाइन

ब्याज की प्रोटीन दो अलग फ्लोरोसेंट लेबल के लिए जुड़े हुए हैं, के रूप में अगले वर्णित. फ्लोरोसेंट लेबल कक्ष के भीतर प्रोटीन का स्थान है, लेकिन यह ^भी 1 प्रोटीन की होमोसेक्सुअल oligomerization के बारे में मात्रात्मक जानकारी के बारे में जानकारी ही उपलब्ध नहीं है . प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा (झल्लाहट) स्थानांतरण ^2-4 की तकनीक प्रोटीन ^5-10 बातचीत के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. झल्लाहट सिद्धांत है कि ऊर्जा के हस्तांतरण एक ऑप्टिकली उत्साहित अणु (आमतौर पर दाता, डी के रूप में कहा गया है) से एक unexcited ^अणु द्विध्रुवीय - द्विध्रुवीय 11 बातचीत के माध्यम से (आम तौर पर स्वीकर्ता, एक रूप में संदर्भित) , हो सकता है इस्तेमाल अगर दो अणुओं एक दूसरे के करीब निकटता में आते हैं. संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग plasmids डिजाइन में, दो प्रमुख विशेषताएं मन में वहन किया जाना चाहिए, इस प्रकार है.

1. फ्लोरोसेंट टैग की एक संगत जोड़ी का चयन अध्ययन झल्लाहट में अत्यंत महत्व का है. दाता टैग के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम और स्वीकर्ता टैग की उत्तेजना स्पेक्ट्रम, और लेजर पल्स स्पेक्ट्रम के केंद्र तरंगदैर्ध्य और उत्तेजना स्पेक्ट्रम के बीच एक बड़े जुदाई के बीच तरंगदैर्य में एक प्रशंसनीय ओवरलैप: आदर्श रूप में, फ्लोरोसेंट टैग संयोजन दो मापदंडों को पूरा करना होगा स्वीकर्ता के (यानी, बड़े स्टोक्स बदलाव). GFP _2: एक ¹⁴ दाता और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) ¹² या इसे का एक संस्करण वीनस ¹⁵ स्वीकर्ता के रूप में बुलाया के रूप में हरी ^{फ्लोरोसेंट} प्रोटीन 12 के ^{दो वेरिएंट,} 13 विशेष रूप से अच्छी तरह से कर रहे हैं करने के लिए इन मानदंडों को पूरा अनुकूल है. आसमानी ¹⁶ भी एक दाता के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हालांकि कुछ अधिक विनम्र के परिणाम के साथ हो.
2. में मात्रात्मक इमेजिंग झल्लाहट यह सबसे अच्छा है अगर एक समय में केवल एक आणविक परिसर में एक दाता उत्साहित है (औसत पर), ताकि कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वही स्वीकर्ता परिसरों कि एक से अधिक दाता और स्वीकर्ता एक होते हैं में ऊर्जा को स्थानांतरित करने के लिए दाताओं के बीच होता है . यह सिद्धांत और डेटा विश्लेषण प्रक्रिया ¹⁷ में सरलीकरण के लिए होता है. इस कारण से, संकेत स्तर आमतौर पर कम है. इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, ब्याज की प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर अपेक्षाकृत उच्च किया जाना चाहिए. उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को एक उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड का उपयोग करने के लिए सेल में प्रोटीन जीन ले द्वारा प्राप्त कर रहे हैं.

2. खमीर परिवर्तन

यह सेल ब्याज की प्रोटीन constructs व्यक्त जनसंख्या का प्रतिशत को अधिकतम करने के लिए लाभप्रद है. इस प्रयोजन के लिए, हम खमीर कोशिकाओं (Saccharomyces cerevisiae), दो अलग plasmids, चयन मार्कर tryptophan युक्त और एक मार्कर uracil साथ tryptophan या uracil, उत्पादन करने में असमर्थ के auxotrophic तनाव को बदलने. plasmids भी जीन जो सेल के लिए निर्देश ले लिए दो फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग ब्याज की प्रोटीन व्यक्त होते हैं. बदल कोशिकाओं ठोस मध्यम प्लेटें जो भी tryptophan और uracil कमी पर उगाए जाते हैं. कक्षों की कम से कम तीन प्रकार तब्दील किया जाना चाहिए: ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं फ्लोरोसेंट जांच, केवल दाता फ्लोरोसेंट जांच कोशिकाओं और केवल स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के दोनों प्रकार के के साथ टैग.

1. ठोस मध्यम प्लेटें (1.7 ग्राम / खमीर नाइट्रोजन बेस w / ओ अमीनो एसिड, 1.6 ग्राम / एल खमीर सिंथेटिक ख़ारिज किया हुआ मध्यम uracil w / ओ और tryptophan, 2% [w / ध्] ग्लूकोज, 2% [w / ध्] के एल तैयार ) अगर बदल कोशिकाओं के लिए मध्यम विकास में कम से कम एक सेल परिवर्तन करने के लिए पहले दिन के रूप में इस्तेमाल किया जा. ठोस मध्यम प्लेट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है तैयार करने के बाद दो महीने के लिए यदि वे किसी भी contaminant के मुक्त रहते हैं.
2. प्रत्येक प्लाज्मिड जोड़ी तब्दील हो, एक erlenmeyer फ्लास्क YPD (10 छ / एल Bacto खमीर निकालें, 20 छ / एल Bacto Peptone, और 2% [w / ध्] ग्लूकोज) के 10 एमएल जोड़ें. Auxotrophic खमीर कोशिकाओं के तनाव को तब्दील हो की एक कॉलोनी के साथ YPD Incoluate.
3. Erlenmeyer एक प्रयोगशाला प्रकार के बरतन, जो नमूने पर एक कक्षीय घूमता कार्रवाई प्रदान करता है में खमीर संस्कृति युक्त कुप्पी प्लेस, और 30 में रातोंरात सेते ° सी. निम्नलिखित सुबह, समय - समय की एक छोटी मात्रा को हटाने के द्वारा सेल संस्कृति के विकास की निगरानी शुरू संस्कृति और अपनी ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) के परीक्षण के. सेल संस्कृति के विकास के मध्य लघुगणक चरण में हो, 0.5-1.0 के एक आयुध डिपो यानी चाहिए परिवर्तन के समय में.
4. जमा एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में 5 plasmids के दोनों प्रकार के प्रत्येक प्लाज्मिड जोड़ी के लिए μL तब्दील हो.
5. प्रत्येक प्लाज्मिड जोड़ी तब्दील हो, एक खाली microcentrifuge ट्यूब सामन शुक्राणु डीएनए (5 मिलीग्राम / एमएल) की 5 μL जोड़ें. डूब microcentrifuge पांच मिनट के लिए उबलते पानी में सामन शुक्राणु डीएनए युक्त ट्यूब के नीचे आधा. Popping सेशन से microcentrifuge ट्यूब की टोपी को रोकनेएन केवल डूब microcentrifuge ट्यूबों में पानी के नीचे आधा. उबलते पानी से हटाने के बाद, microcentrifuge ट्यूब बर्फ में कम से कम दो मिनट के लिए सामन शुक्राणु डीएनए युक्त जगह है.
6. प्रत्येक microcentrifuge plasmids युक्त ट्यूब सामन शुक्राणु डीएनए के 5 μL जोड़ें.
7. बढ़ती खमीर संस्कृति के आयुध डिपो उपाय पुष्टि करते हैं कि यह (यानी 0.5 और 1.0 के बीच आयुध डिपो पढ़ने) मध्य लघुगणक चरण तक पहुँच गया है.
8. 1000xg पर दो मिनट के लिए खमीर निलंबन अपकेंद्रित्र.
9. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और निष्फल विआयनीकृत एक भंवर मिश्रक का उपयोग कर पानी में खमीर गोली resuspend.
10. निलंबन एक बार फिर दो मिनट के लिए 1000xg पर अपकेंद्रित्र.
11. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ते में 0.1M LiOAc की एक समाधान में गोली (1.02 छ LiAc, पीएच 7.4 से कम 10 एमएल 1M Tris, और 10 एमएल 8.0 पीएच 0.1 एम EDTA) resuspend. ते में 0.1M LiOAc की मात्रा YPD में मूल खमीर संस्कृति मात्रा 1 / 100 ^वें के बराबर होना चाहिए.
12. Microcentrifuge plasmids युक्त ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए कक्षों की 100 μL वितरित. प्रत्येक ट्यूब धीरे झाड़ क्रम में plasmids के साथ कोशिकाओं मिश्रण.
13. 400 44 [w / ध्] polyethylene glycol ₍₄₀₀₀ खूंटी) microcentrifuge ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए समाधान% की μL जोड़ें .
14. धीरे कोशिकाओं और plasmids के _साथ 4000 खूंटी का मिश्रण. आदेश में कोशिकाओं को तोड़ने से बचने के लिए, इस बिंदु पर एक भंवर मिश्रक का उपयोग नहीं करते. धीरे मिश्रण करने के लिए, पकड़ microcentrifuge टोपी और तर्जनी और अंगूठे के बीच microcentrifuge ट्यूब के नीचे, धीरे धीरे ट्यूब पलटना, और फिर धीरे धीरे ईमानदार स्थिति ट्यूब वापस लाने. ट्यूब अपनी बेलनाकार अक्ष के बारे में 90 ° घुमाएँ और धीरे धीरे फिर से पलटना. इस प्रक्रिया को दोहराएँ बार इतना है कि कोशिकाओं microcentrifuge ट्यूब की दीवारों की पूरी सतह क्षेत्र के नीचे स्लाइड की एक संख्या है.
15. एक 30 ° इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए microcentrifuge ट्यूबों रखें.
16. 45 मिनट के ऊष्मायन के बाद इनक्यूबेटर से कोशिकाओं को हटाने और सौम्य मिश्रण 14 में वर्णित प्रक्रिया को दोहराने.
17. एक 42 ° पानी के स्नान में microcentrifuge ट्यूबों प्लेस और 15 मिनट के लिए सेते हैं. एक बार फिर, केवल पानी में microcentrifuge ट्यूबों के नीचे आधा डूब.
18. 42 ° ऊष्मायन के बाद, microcentrifuge ट्यूबों को निष्फल विआयनीकृत पानी के 1 एमएल जोड़ने.
19. अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए एक tabletop microfuge में ट्यूबों. एक micropipetter का उपयोग ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें.
20. Microcentrifuge ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए निष्फल विआयनीकृत पानी की 100 μL जोड़ें और मिश्रण उलटा प्रक्रिया का उपयोग कर कक्षों के साथ निष्फल विआयनीकृत जल.
21. एक मध्यम विकास की थाली है जो विशेष रूप से उस microcentrifuge ट्यूब को जोड़ा plasmids के लिए चयन करने के लिए एक एकल microcentrifuge ट्यूब की सामग्री जोड़ें. 4-6 निष्फल ग्लास मनकों (1 मिमी व्यास) जोड़ें. तब्दील खमीर क्रम में कोशिकाओं और ग्लास मनकों की छोटी बूंद है कि कोशिकाओं अगर मध्यम विकास की सतह पर फैले हुए हैं युक्त थाली हिलाएँ. बदल कोशिकाओं के प्रत्येक सेट के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
22. 5 दिन - 3 के लिए एक 30 ° इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस. 3-5 दिनों के बाद, 1-3 मिमी व्यास के कई खमीर कालोनियों मध्यम विकास की सतह पर दिखाई जाएगी. इस समय, कोशिकाओं spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोप में imaged किया जा करने के लिए तैयार हैं.

3. Spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोप calibrating

spectrally हल दो photon इन अध्ययनों में इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी में विस्तार किया गया है ¹⁸ कहीं ^{वर्णित, 19.} नीलम लेजर जो ~~ 750 से 830 एनएम से लेकर तरंग दैर्ध्य के femtosecond दालों उत्पन्न: संक्षेप में, एक उच्च शक्ति ठोस राज्य के लेजर निरंतर तरंग के लिए एक बंद - तिवारी मोड पंप प्रयोग किया जाता है. लेजर बीम एक उच्च एनए खुर्दबीन विवर्तन सीमित नमूना पर एक जगह करने के लिए उद्देश्य से ध्यान केंद्रित है. उत्तेजना केवल दो photon उत्तेजना की कम संभावना के कारण बीम के निकट फोकल क्षेत्र में होता है. Orthogonal कंप्यूटर नियंत्रित स्कैनिंग दर्पण की एक जोड़ी के बीम का ध्यान केंद्रित करने के लिए दो अलग अलग दिशाओं (प्रोटोकॉल भर x और y दिशाओं के रूप में संदर्भित) में नमूने के विमान के भीतर अनुवाद किया जाता है. एक संचरण उत्सर्जन की राह में रखा पहले प्रकाश EM-सीसीडी सरणी के पिक्सल पर घटना गिरता झंझरी से वापस प्रचार के नमूने के एक प्रबुद्ध voxel से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन वर्णक्रमीय घटकों में छितरी हुई है. इस प्रकार, किसी भी फ्लोरोसेंट / बीम का केन्द्र क्षेत्र के भीतर अणु अणुओं की पूर्ण वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल सीसीडी सरणी के एक आयाम (y दिशा) के साथ प्राप्त की है. दो स्कैनिंग दर्पण के आंदोलन का प्रयोग, लेजर ध्यान केंद्रित करने के स्थान नमूना के भीतर एक लाइन y दिशा को सीधा के साथ स्कैन किया जा सकता है. इस एकल पंक्ति स्कैन, फ्लोरोसेंट अणु Res के वर्णक्रमीय प्रोफाइल के दौरान सीसीडी कैमरा खुला शटर रखकरस्कैन की पूरी लाइन के साथ iding एक नमूना भर में लेजर बीम के एक झाडू में एकत्र कर रहे हैं. कोशिका के भीतर विभिन्न y स्थानों पर इस प्रकार की एकाधिक पंक्ति स्कैन जमते फ्लोरोसेंट नमूना भीतर रहने वाले परिसरों की एक बड़ी संख्या के वर्णक्रमीय प्रोफाइल देता है . लाइन स्कैन से प्राप्त छवियों के लिए कई अलग अलग तरंगदैर्य ^{18, 19} पर xy प्रतिदीप्ति तीव्रता नमूने के स्थानिक नक्शे दे खंगाला हैं. आदेश में सही और पुनर्निर्माण करने के लिए वास्तविक xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे इसी तरंग दैर्ध्य की गणना करने के लिए, रेखा स्कैनिंग प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से विशेषता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक नमूने का उपयोग कर calibrated किया जा चाहिए.

1. spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोप स्थानों की संख्या में ब्याज का नमूना भर में उत्तेजना बीम का ध्यान स्कैनिंग द्वारा imaged कक्ष में oligomer परिसरों के बारे में वर्णक्रमीय जानकारी जम जाता है.
2. Orthogonal स्कैनिंग दर्पण की एक जोड़ी के लिए नमूना भर में दो अलग अलग दिशाओं में लेजर बीम ध्यान केंद्रित अनुवाद करने के लिए प्रयोग किया जाता है. स्कैनिंग दर्पण के आंदोलन कंप्यूटर नियंत्रित और सीसीडी कैमरा प्रतिदीप्ति तीव्रता से डेटा की निकासी के साथ सिंक्रनाइज़ है.
3. लाइन स्कैन से, फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक प्रकाश की एक विशेष तरंग दैर्ध्य के लिए इसी नक्शे खंगाला जा सकता है. आदेश में सही xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे पुनर्निर्माण करने के लिए और इन मानचित्रों में से प्रत्येक के लिए वास्तविक इसी तरंग दैर्ध्य की गणना करने के लिए, लाइन स्कैनिंग fluorescein समाधान प्रोटोकॉल का उपयोग कर calibrated किया जा चाहिए.
4. अंशांकन प्रक्रिया शुरू करने के लिए, 800 एनएम के तरंग दैर्ध्य है, जो दाता टैग के _{अधिकतम} उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, 2 GFP 2X है पर केंद्र उत्तेजना स्पेक्ट्रम. उत्तेजना स्पेक्ट्रम केंद्र के लिए, समूह वेग फैलाव को संशोधित लेजर गुहा के भीतर स्थित चश्मे का अनुवाद करते हैं. चश्मे एक रैखिक motorized चरण नियंत्रित कंप्यूटर पर मुहिम शुरू की है.
5. कैमरा कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग करने के लिए interfaced है, सीसीडी चिप के लिए एक कमांड भेजने के अपने न्यूनतम प्राप्य तापमान को सीसीडी चिप के तापमान को कम करने में अंधेरे शोर को कम.
6. पिपेट एक खुर्दबीन स्लाइड पर fluorescein समाधान के 10 μL. एक coverslip के साथ कवर इतना है कि नमूना की एक पतली परत समान coverslip खुर्दबीन और स्लाइड के बीच क्षेत्र में छितरी हुई है.
7. विसर्जन के तेल के coverslip की सतह पर एक छोटी सी बूंद प्लेस
8. अब खुर्दबीन xyz अनुवाद चरण के लिए स्लाइड जकड़ना और मैन्युअल रूप से रैखिक actuator जो ऑप्टिकल अक्ष दिशा में मंच आंदोलन नियंत्रण का समायोजन करके स्लाइड / मंच ऑप्टिकल अक्ष दिशा में अनुवाद. स्लाइड / चरण का अनुवाद जब तक खुर्दबीन उद्देश्य विसर्जन तेल की बूंद के साथ संपर्क में आता है.
9. कंप्यूटर प्रोग्राम जो कैमरा नियंत्रण का प्रयोग, डाटा अधिग्रहण के एक वीडियो मोड में स्विच तो उत्सर्जित सीसीडी सरणी हड़ताली प्रकाश वास्तविक समय में कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है. धीरे धीरे, ऑप्टिकल अक्ष दिशा में अनुवाद चरण को नियंत्रित करने के लिए लेजर बीम का केन्द्र स्थान में नमूना लाने सुक्ष्ममापी समायोजित करें.
10. जब fluorescein नमूना ध्यान में है, उत्सर्जन सीसीडी सरणी पर एक तेज लाइन के रूप में दिखाई देगा. सीसीडी सरणी से कैमरे को नियंत्रित कंप्यूटर प्रोग्राम का उपयोग कर कंप्यूटर करने के लिए पिक्सेल तीव्रता के readout डाउनलोड. सीसीडी सरणी पर स्थिति के एक समारोह के रूप में छवि जम्मू में तीव्रता मूल्यों की डाउनलोड मैट्रिक्स खोलने और फ्लोरोसेंट क्षेत्र के माध्यम से एक लाइन ड्राइंग द्वारा पिक्सेल तीव्रता उपाय. छवि जम्मू आदेश → प्लॉट प्रोफ़ाइल विश्लेषण के लिए एक साजिश fluorescein नमूना के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम illustrating बनाने का उपयोग करें.
11. दर्पण है जो y दिशा में ध्यान केंद्रित लेजर के आंदोलन, सीसीडी पर वर्णक्रमीय आयाम के साथ ठीक एक पिक्सेल द्वारा प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के चोटी के आंदोलन में नमूना परिणाम के भीतर ऐसी है कि आसन्न y पदों पर नियंत्रण के वृद्धिशील पैरामीटर समायोजित करें सरणी. इस नमूने में दो अलग y के पदों के लिए डाउनलोड fluorescein स्पेक्ट्रा तीव्रता मूल्य छवि, छवि जम्मू के साथ तीव्रता छवियों खोलने, और प्रतिदीप्ति छवि जम्मू कर्सर का उपयोग स्पेक्ट्रा के प्रत्येक के लिए पीक पिक्सेल स्थिति ढूँढने मॉनिटर .
12. सीसीडी खुला के शटर को छोड़कर, x दिशा में नमूना भर में लेजर ध्यान केंद्रित स्कैन . स्कैन की लाइन के साथ प्रत्येक voxel से उत्सर्जित प्रकाश सीसीडी सरणी पर इस घटना को गिर चाहिए.
13. इस पंक्ति स्कैन के लिए प्राप्त सीसीडी सरणी से डेटा स्टोर और तब सीसीडी सरणी के पिक्सल स्पष्ट.
14. इस खंड के 11 कदम में निर्धारित राशि से y दिशा में ध्यान केंद्रित लेजर की स्थिति हटो .
15. नमूना भर x दिशा में लेजर बीम स्कैन, एक बार फिर से खुला सीसीडी की गिरफ्तारी के शटर छोड़नेरे और डेटा की दुकान.
16. एक भौतिक क्षेत्र तक इस लाइन स्कैनिंग प्रक्रिया दोहराएँ ~ 50% से भी बड़ा एक एकल जैविक सेल के आयाम लेज़र प्रकाश द्वारा प्रबुद्ध है.
17. एक विशेष पंक्ति स्कैन छवि की पंक्ति संख्या और तरंग दैर्ध्य के बीच के रिश्ते के लिए छवियों के पुनर्निर्माण के विभिन्न तरंगदैर्य पर एकाधिक xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए. Xy प्रतिदीप्ति उत्सर्जन छवि एक विशेष तरंगदैर्ध्य (λ _ञ) के लिए प्राप्त करने के लिए, पहली पंक्ति स्कैन है कि इस तरंग दैर्ध्य से मेल खाती से प्राप्त छवि पर पंक्ति संख्या का लगता है. फिर बाद लाइन स्कैन छवि के सन्निकट पंक्ति है कि विशेष रूप से तरंगदैर्ध्य के लिए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन छवि की अगली पंक्ति से मेल खाती है है. सभी छवि पंक्तियाँ है कि इस तरंग दैर्ध्य के अनुरूप तरंग दैर्ध्य है कि नमूने के xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे प्राप्त हो चुकी है . अन्य सभी प्राप्य तरंग दैर्ध्य के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
18. प्रत्येक xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शा के साथ जुड़े तरंग दैर्ध्य की गणना निर्धारित करते हैं, पृष्ठभूमि छवि इंडेक्स (ञ) के एक समारोह के रूप में प्रत्येक खंगाला छवि के सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता सही. कैमरा वर्णक्रमीय आयाम में पिक्सेल की स्थिति और उत्सर्जित फोटॉनों की तरंग दैर्ध्य के बीच संबंध लगभग रैखिक है, इसलिए खंगाला xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शा छवियों और इसी तरंग दैर्ध्य के बीच संबंधों को भी रैखिक और गणना निम्न प्रकार की:
    जहां मीटर के मूल्य द्वारा प्रतिनिधित्व किया है:
    ऊपर रीतिवाद में, प्रतीक λ _{जम्मू} जम्मू ^वें खंगाला छवि के तरंग दैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है. λ _{अधिकतम} और λ के मूल्यों _{साढ़े} fluorescein नमूना के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से निकाले जाते हैं और तरंगदैर्य पर जो fluorescing नमूने के प्रतिदीप्ति तीव्रता और अधिकतम अधिकतम आधा है के अनुरूप, क्रमशः. छवि जम्मू _{अधिकतम} और जम्मू सूचकांक _{साढ़े} खंगाला छवियों रखने अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता और अधिकतम एक आधा, क्रमशः के अनुरूप हैं .

4. ब्याज की जैविक नमूनों पर एकत्रित डेटा

1. अपने नमूनों पर डेटा एकत्रित करने के लिए, पहले तब्दील खमीर कालोनियों के साथ प्लेटें इन्क्यूबेटर से निकाल. वहाँ कम से कम तीन प्रकार किया जाना चाहिए बदल कोशिकाओं की पूर्ण चौड़ाई आधा अधिकतम (FWHM):
   1. ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं फ्लोरोसेंट जांच के दोनों प्रकार के के साथ टैग
   2. केवल प्रोटीन दाता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग व्यक्त कोशिकाओं, और
   3. केवल स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं.
2. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए 100 मिमी KCl से 100 μL जोड़ें. एक micropipette टिप का उपयोग करना, 3-5 खमीर कालोनियों परिमार्जन दोनों दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की थाली से बंद है, और इन कोशिकाओं के साथ 100 मिमी KCl टीका लगाना.
3. सेल निलंबन के 10 μL निकालें और यह एक ताजा खुर्दबीन स्लाइड पर बांटना, coverslip के साथ छोटी बूंद को कवर, और coverslip की सतह पर तेल की एक छोटी बूंद जगह है.
4. मैन्युअल खुर्दबीन उद्देश्य तक पहुँचने से लेजर प्रकाश ब्लॉक लेजर बीम के रास्ते में शटर बंद.
5. खुर्दबीन xyz अनुवाद चरण के लिए स्लाइड जकड़ना और स्लाइड / ऑप्टिकल अक्ष दिशा में मंच का अनुवाद जब तक खुर्दबीन उद्देश्य विसर्जन तेल की बूंद के साथ संपर्क में आता है .
6. नमूने की एक विस्तृत क्षेत्र छवि उत्सर्जन रास्ते में संचरण झंझरी की उपस्थिति की वजह से बुरी तरह धुंधला हो जाएगा. इसलिए ऑप्टिकल संचरण झंझरी पिछले रास्ते में एक छोटे से FWHM के साथ एक bandpass फिल्टर की जगह है. व्यापक क्षेत्र प्रकाश रोशनी पर बारी, और डेटा संग्रह के कैमरे के वीडियो मोड में जाओ. धीरे धीरे ऑप्टिकल अक्ष दिशा में अनुवाद चरण अनुवाद जबकि कैमरा स्क्रीन पर कक्षों की छवि को देखने जब तक कोशिकाओं ध्यान में लाया जाता है
7. या तो एक्स या y दिशा क्रम में लेजर बीम ध्यान केंद्रित करने के स्थान पर किसी एकल कक्ष लाने में चरण अनुवाद.
8. विस्तृत क्षेत्र रोशनी स्रोत बंद. उत्सर्जन पथ से bandpass फिल्टर निकालें.
9. एक कम समय (<1 सेकंड) के लिए लेजर बीम नक़्शा है, जबकि एक साथ सीसीडी सरणी पर प्राप्त संकेत देखने. यदि एक फ्लोरोसेंट संकेत सीसीडी सरणी पर समय के दौरान पता चला है लेजर बीम सेल पर घटना है, तो इस सेल की एक पूर्ण प्रतिदीप्ति डेटा अधिग्रहण स्कैन प्रदर्शन करते हैं. यह महत्वपूर्ण है एक ही स्कैनिंग मानकों, विशेष रूप से लाइनों और y वेतन वृद्धि की संख्या, के रूप में ca में निर्धारित का उपयोगपहले libration प्रक्रिया का प्रदर्शन किया.
10. सेल और स्थान दोनों दाता और स्वीकर्ता टैग टैग से जुड़ी प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लिए प्रतिदीप्ति डेटा अधिग्रहण प्रक्रिया दोहराएँ.
11. दोनों रिसेप्टर्स के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की छवियों प्रतिदीप्ति जमा करने के बाद, दोनों केवल दाता फ्लोरोसेंट जांच कोशिकाओं और केवल स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के लिए पूरी प्रक्रिया को दोहराने.
12. धारा 3 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग, सभी स्कैन पुनर्निर्माण करने के लिए डेटा के प्रत्येक सेट के लिए spectrally हल xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे प्राप्त.

5. छवि विश्लेषण

Xy फ्लोरोसेंट तीव्रता स्थानिक नक्शे, जो एक fluorescing जैविक कोशिका के एकल स्कैन से परिणाम, प्रत्येक पिक्सेल आणविक जटिल है कि विशेष रूप से पिक्सेल इसी उत्तेजना voxel में रहने का पूरा वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल शामिल हैं. अगर ब्याज की प्रोटीन एक दूसरे के साथ बातचीत कर रहे हैं, इस वर्णक्रमीय प्रोफ़ाइल दोनों दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच से संकेत का एक मिश्रण में शामिल होंगे. आदेश में ब्याज के प्रोटीन के बीच बातचीत की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए, किसी कक्ष में इन प्रोटीन परिसरों की एक बड़ी संख्या से वर्णक्रमीय प्रोफाइल और नमूना होना चाहिए स्पष्ट दक्षता _{झल्लाहट} (ई अनुप्रयोग), उत्साहित राज्यों के अनुपात के रूप में परिभाषित दाता फ्लोरोसेंट जांच कि झल्लाहट के माध्यम से स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच करने के लिए स्थानांतरित हो जाते हैं प्रत्येक पिक्सेल के गणना की जानी चाहिए.

1. पृष्ठभूमि सही खंगाला केवल दाता फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के लिए धारा 4 में वर्णित छवियों में से प्रत्येक के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण और अधिकतम मूल्य के लिए मानक के अनुसार. क्योंकि इन खंगाला छवियों के प्रत्येक एक अलग (λ _ञ) तरंग दैर्ध्य सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के इस संग्रह दाता जांच मापा उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से मेल खाती है है से मेल खाती है, ^मैं डी _{(λ ञ)} .
2. दोहराएँ केवल स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट टैग के साथ टैग करने के लिए मापा स्वीकर्ता जांच के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम प्राप्त प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के लिए ^चरण 1, _{मैं एक} ( λ ञ). चूंकि स्वीकर्ता जांच ऐसी है कि यह शायद ही कभी सीधे लेजर स्रोत का उपयोग कर उत्साहित है चुना है, तो स्वीकर्ता केवल नमूने से निकलती संकेत और संभवतः कम परिमाण के कोशिकाओं निहित autofluorescence संकेत के रूप में एक ही आदेश पर किया जाएगा. इसलिए, मापा स्वीकर्ता प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम इस तरीके से गणना करने के लिए आगे बढ़ने से पहले autofluorescence के योगदान को दूर करने के लिए सही किया जा आवश्यकता हो सकती है.
3. सामान्यीकृत चरण 1 और चरण 2 में प्राप्त स्पेक्ट्रम का प्रयोग, spectrally दोनों प्रोटीन जांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन और दाता स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट संबंध मैं _{(λ जे)} = ^{कश्मीर} डीए का उपयोग कर जांच के साथ टैग के साथ टैग व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के प्रत्येक पिक्सेल घुलना मैं ^डी (λ _ञ) + K ^ई. मैं ^एक (λ _j) जहाँ मैं (λ _ञ) एक विशेष प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम मापा पिक्सल का प्रतिनिधित्व करता है. कश्मीर ^डीए और कश्मीर ^ई. के मूल्यों स्वीकारकर्ताओं की उपस्थिति में और दाताओं, क्रमशः ⁵ की उपस्थिति में स्वीकारकर्ताओं से दाताओं से प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के लिए आनुपातिक हैं.
4. स्पष्ट दक्षता झल्लाहट जो प्रत्येक पिक्सेल का उपयोग सूत्र में कक्ष में प्रोटीन की बातचीत नक्शे की गणना, . यहाँ, क्यू ^डी और क्यू ^ए दाता फ्लोरोसेंट जांच और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट जांच की मात्रा पैदावार क्रमशः रहे हैं, और w ^डी और w सामान्यीकृत दाता स्वीकर्ता और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के integrals हैं क्रमशः ^{19, 20.}
5. अंत में, प्रत्येक पिक्सेल है, जहां एक विशिष्ट _ई बॉक्स मूल्य होता है समय की _{संख्या} ई अनुप्रयोग है कि विशेष रूप से मूल्य के खिलाफ प्लॉट _के लिए ई बॉक्स के मूल्यों की गणना का उपयोग हिस्टोग्राम बनाने.

6. हिस्टोग्राम विश्लेषण

आदेश में ई _{अनुप्रयोग} histograms से मात्रात्मक जानकारी निकालने के लिए, प्रत्येक हिस्टोग्राम सैद्धांतिक रूप से गाऊसी कार्यों की राशि के साथ फिट है निम्नलिखित सूत्र के अनुसार,
,
जहाँ _मैं एक आयाम है, _मैं मानक विचलन σ, और ई _0i सबसे संभावित मैं ^ith गाऊसी समारोह की दक्षता झल्लाहट. विभिन्न oligomer का आकारऔर विन्यास _0i ई ^{1 उन्हें, 17} के बीच और विभिन्न सहसंबंध के विभिन्न संख्या (एन) के लिए सीसा. उदाहरण के लिए, विषमकोण के आकार का एक tetramer के लिए पाँच चोटियों की भविष्यवाणी कर रहे हैं, तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिव्यक्ति द्वारा दिए गए.

तालिका 1. पाँच गाऊसी चोटी केंद्र मूल्यों की प्रत्येक और जोड़ो के बीच संबंध एक तिर्यग्वर्ग आकार tetramer के लिए भविष्यवाणी की दक्षता झल्लाहट .

इसका मतलब है कि केवल एक ई _0i मान के लिए डेटा की प्रक्रिया फिटिंग में समायोजित किया जा जरूरत है _- एक ई पी करने के लिए इसी जबकि _{अन्य चार} ई पी के मूल्य से गणना कर रहे हैं.

1. एक oligomer मॉडल मान लें और फिटिंग ई _{अनुप्रयोग} histograms ¹ में इस्तेमाल किया जा Gaussians की संख्या की पहचान . ई _पी, एक _मैं समायोजन करके हिस्टोग्राम फ़िट, और _मैं σ. ध्यान दें कि histograms के रिश्तेदार स्वभाव मॉडल के आधार पर तय हो गई है. फिट की ची वर्ग या कुछ अन्य अच्छाई के फिट कार्यात्मक छोटा है.
2. एक और संभावना oligomer मॉडल है और दोहराने कदम 1 संख्या मान लें.
3. मॉडल है कि सबसे अच्छा इस्तेमाल किया पैरामीटर की संख्या के लिए डेटा फिट चुनें. यह एक सांख्यिकीय परीक्षण (जैसे स्वतंत्रता के अंशों की संख्या प्रति ची वर्ग के रूप में) का उपयोग की आवश्यकता हो सकती है.

प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1 में सचित्र परिणामी कश्मीर ^डीए, कश्मीर ^ई., और ई _{अनुप्रयोग} स्थानिक नक्शे spectrally हल दो photon माइक्रोस्कोपी एक खमीर बाँझ α कारक 2 (Ste2p) ^{21, 22} से व्यक्त सेल पर प्रदर्शन माप से अभिकलन हैं .

चित्रा 1. खमीर बाँझ 2 α कारक रिसेप्टर व्यक्त सेल (कश्मीर ^डीए) दाता और स्वीकर्ता संकेतों (कश्मीर ^ई.) के दो आयामी नक्शे. वर्णक्रमीय लिया छवियों के प्रत्येक पिक्सेल स्थान spectrally हल दो photon का उपयोग करने के लिए लागू deconvolution प्रक्रिया से प्राप्त किया गया एक खमीर बाँझ 2 α कारक रिसेप्टर (Ste2p) व्यक्त सेल की खुर्दबीन. प्रतिदीप्ति तीव्रता झूठी रंग उनके मूल्यों और बड़े पैमाने के रूप में दिखाया गया है एक क्षेपक अनुसार आवंटित हो जाते हैं. स्पष्ट झल्लाहट क्षमता के एक दो आयामी नक्शा कश्मीर ^डीए और कश्मीर ^ई. छवियों का उपयोग अभिकलन थे .

एक हिस्टोग्राम साजिश चित्र 1 में दिखाया सेल के ई _{बॉक्स} नक्शे से निकाले मान का उपयोग कर तैयार किया गया था. चित्रा 2 में चित्र फिट हिस्टोग्राम चित्र 1 में चित्र सेल के मापा ई _{बॉक्स} मान (हलकों) के लिए इसी साजिश है . लाल ठोस लाइन मापा व्यक्तिगत कार्यों गाऊसी (हरी ठोस लाइनों) की राशि का उपयोग कर डेटा के लिए सबसे अच्छा फिट का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2. हिस्टोग्राम एक खमीर बाँझ 2 α कारक रिसेप्टर व्यक्त सेल के लिए _ई बॉक्स मूल्यों की साजिश है. हिस्टोग्राम साजिश है _जो ई बॉक्स मापा (हलकों) चित्रा 1 में चित्र सेल के लिए मूल्यों से मेल खाती है है दिखाया गया है. व्यक्तिगत कार्यों गाऊसी (ठोस हरे रंग की लाइनों) (ठोस लाल रेखा) मापा मूल्यों का अनुकरण अभिव्यक्त कर रहे हैं. गाऊसी समारोह मापदंडों हैं: ₀₁ ई = 16.7, ₁ एक = 118.9, ₁ = 3.2 σ, ई ₀₂ = 25.1, एक ₂ = 100.0, ₂ σ = 4.6, ₀₃ ई = 32.6, एक ₃ = 202.6, ₃ σ = 4.6; ₀₄ ई = 40.1, एक ₄ 92.6 = ₄ = 3.7 σ, ई ₀₅ = 50.1, एक ₅ = 16.0, ₅ = 7.9 σ.

गाऊसी के बीच संबंधों का मतलब तालिका 1 में दी गई हैं चित्रा 2 के हिस्टोग्राम में प्रस्तुत डाटा फिट की जरूरत है. संख्या और गाऊसी कार्यों के बीच सहसंबंध संख्या और तिर्यग्वर्ग आकार tetramer oligomer परिसरों के लिए उम्मीद _ई बॉक्स मूल्यों के बीच सहसंबंध से मेल खाती है है. इसलिए, यह spectrally हल दो photon माप से स्पष्ट है कि Ste2p oligomer परिसर ^में 19 vivo में एक तिर्यग्वर्ग आकार tetramer के रूप मानता है .

Discussion

इस प्रस्तुति में, हम कैसे और vivo में एक प्रोटीन oligomer जटिल के बारे में जानकारी संरचनात्मक आकार निर्धारित करने के लिए सचित्र. जबकि प्रस्तुत डाटा एक विशिष्ट झिल्ली (यानी Ste2p) रिसेप्टर खमीर कोशिकाओं में व्यक्त से प्राप्त किया गया था, विधि सभी को शामिल है कि यह प्रोटीन की किसी भी प्रकार के सेल, केवल किया जा रहा है शर्त के किसी भी प्रकार में व्यक्त करने के लिए लागू किया जा सकता है कि प्रोटीन उपयुक्त फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ टैग कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल के लिए भविष्य संशोधनों एक समय पर निर्भर प्रोटीन oligomer आकार और संरचना में परिवर्तन की निगरानी करने की कोशिश में उच्च गति स्कैनिंग को प्राप्त करने के साधन बढ़ाने में शामिल होगी.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope