Summary
Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.
Abstract
De studie van eiwit interacties in levende cellen is een belangrijk gebied van onderzoek, omdat de informatie verzameld zowel voordelen industriële toepassingen alsmede verhogingen elementaire fundamentele biologische kennis. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) tussen een donor molecuul in een elektronisch aangeslagen toestand en een nabijgelegen acceptor molecuul is vaak gebruikt voor studies van eiwit-eiwit interacties in levende cellen. De eiwitten van belang zijn gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes en uitgedrukt in biologische cellen. De fluorescerende probes worden dan enthousiast, meestal met behulp van laserlicht, en de spectrale eigenschappen van de fluorescentie-emissie afkomstig van de fluorescerende probes is verzameld en geanalyseerd. Informatie over de mate van het eiwit interacties is ingebed in de spectrale emissie-gegevens. Typisch, moet de cel worden gescand een aantal keren in om voldoende spectrale informatie verzamelen om nauwkeurig kwantificeren van de omvang van het eiwit interacties voor elke regio van belang binnen de cel. Echter, de moleculaire samenstelling van deze regio's te veranderen in de loop van de acquisitie-proces, het beperken van de ruimtelijke bepaling van de kwantitatieve waarden van de schijnbare FRET efficiëntie tot een gemiddelde over heel cellen. Door middel van een spectraal opgelost twee-foton microscoop, zijn wij in staat om een volledige set van spectraal opgelost beelden te verkrijgen na slechts een volledig excitatie scan van de steekproef van belang. Uit dit pixelniveau spectrale data, een kaart van FRET efficiëntie in de cel wordt berekend. Door het toepassen van een eenvoudige theorie van FRET in oligomere complexen aan de experimenteel verkregen verdeling van de FRET efficiëntie in de cel, een enkele spectraal opgelost scan onthult stoichiometrische en structurele informatie over het oligomeer complex onder te bestuderen. Hier beschrijven we de procedure voor de voorbereiding van biologische cellen (de gist Saccharomyces cerevisiae) uiten van membraan receptoren (steriele twee α-factor receptoren) gelabeld met twee verschillende types van fluorescerende probes. Daarnaast illustreren we kritische factoren die betrokken zijn bij het verzamelen van gegevens met behulp van fluorescentie de spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging systeem. Het gebruik van dit protocol kan worden uitgebreid tot elk soort eiwit dat kan worden uitgedrukt in een levende cel met een fluorescente marker in bijlage aan het bestuderen.
Protocol
1. Plasmide ontwerp
De eiwitten van belang zijn gefuseerd aan een van de twee verschillende fluorescerende labels, zoals hieronder beschreven. De fluorescerende labels bieden niet alleen informatie over de locatie van de eiwitten in de cel, maar ook kwantitatieve informatie over de homo-oligomerisatie van het eiwit 1. De techniek van Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) 2-4 wordt gebruikt om de informatie over het eiwit interacties 50-10 ophopen. FRET maakt gebruik van het principe dat een overdracht van energie kan van een optisch aangeslagen molecuul (meestal aangeduid als de donor, D) optreden een unexcited molecuul (meestal aangeduid als acceptor, A) via dipool-dipool interacties 11, als de twee moleculen komen in de nabijheid van elkaar. Bij het ontwerpen van de plasmiden die coderen voor de fusie-eiwitten, twee belangrijke kenmerken moet worden gehouden in het achterhoofd, als volgt.
- Het selecteren van een compatibele paar tl-tags is van het grootste belang in FRET studies. Idealiter moet de tl-tag combinatie voldoen aan twee criteria: een aanzienlijke overlap in golflengten tussen de emissie spectrum van de donor-tag en de excitatie spectrum van de acceptor-tag, en een grote scheiding tussen het centrum golflengte van de laser puls spectrum en de excitatie spectrum van de acceptor (dat wil zeggen, grote Stokes shift). Twee varianten van de groen fluorescerend eiwit 12, zijn 13 bijzonder geschikt voor deze criteria te voldoen: het GFP 2 als een donor 14 en de gele fluorescerende eiwit (YFP) 12 of een variant daarvan heet Venus 15 als de acceptor. Cerulean 16 kan ook worden gebruikt als donor, maar met wat meer bescheiden resultaten.
- In kwantitatieve FRET beeldvorming is het het beste als er slechts een donor in een moleculair complex is enthousiast over een tijd (gemiddeld), zodat er geen concurrentie optreedt tussen donoren voor het overbrengen van energie aan de dezelfde acceptor in complexen die meer dan een donor en een acceptor bevatten . Dit leidt tot vereenvoudigingen in de theorie en data-analyse proces 17. Vandaar dat het signaal niveau is meestal laag. Om dit te compenseren, moet de expressie van de eiwitten van belang zijn relatief hoog. Hoge expressie niveaus worden bereikt met behulp van een high-copy plasmide om het eiwit te gen dragen in de cel.
2. Gist transformatie
Is het voordelig om maximaliseren van het percentage van de celpopulatie de uiting van de eiwit constructies van belang. Voor dit doel zetten we een auxotrofe stam van gistcellen (Saccharomyces cerevisiae), niet in staat om tryptofaan of uracil te produceren, met twee verschillende plasmiden, een met de selecteerbare merker tryptofaan en een van de marker uracil. De plasmiden bevatten ook de genen, die instructies voor de cel dragen naar het eiwit van belang gelabeld met een van de twee fluorescerende probes uit te drukken. De getransformeerde cellen worden gekweekt op een vast medium platen die ook gebrek aan tryptofaan en uracil. Ten minste drie soorten cellen moeten worden omgezet: cellen die de eiwitten van belang gelabeld met beide types van fluorescerende probes, cellen die alleen eiwitten gelabeld met de donor fluorescerende probes en cellen die alleen eiwitten gelabeld met de acceptor fluorescerende probes.
- Bereid je vast medium platen (1,7 g / L van yeast nitrogen base w / o aminozuren, 1,6 g / L gist synthetisch uitval medium w / o uracil en tryptofaan, 2% [w / v] glucose, 2% [w / v] agar) te worden gebruikt als groeimedium voor de getransformeerde cellen minstens een dag voorafgaand aan de cel transformatie. De solide medium platen kunnen worden gebruikt voor het tot twee maanden na de bereiding als ze volledig vrij van enige verontreiniging.
- Voor elk plasmide paar om getransformeerd te worden, voeg 10 ml YPD (10 g / L Bacto gistextract, 20 g / L Bacto Peptone, en 2% [w / v] glucose) om een erlenmeyer. Incoluate de YPD met een kolonie van de auxotrofe stam van gistcellen worden omgezet.
- Plaats de erlenmeyer met de gistcultuur in een laboratorium shaker, die een baan wervelende actie op de monsters levert, en incubeer overnacht bij 30 ° C. De volgende ochtend beginnen met het monitoren van de groei van de celkweek door periodiek verwijderen van een kleine hoeveelheid de cultuur en het testen van de optische dichtheid (OD). De groei van de cel cultuur moet worden in het midden-logaritmische fase, dwz een OD van 0,5-1,0, op het moment van de transformatie.
- Borg 5 pi van beide soorten van plasmiden in een steriele microcentrifugebuis voor elk plasmide paar om te zetten.
- Voor elk plasmide paar om getransformeerd te worden, voeg 5 ul zalmsperma DNA (5 mg / ml) om een lege microcentrifugebuis. Dompel de onderste helft van de microcentrifugebuis met het zalmsperma DNA in kokend water gedurende vijf minuten. Om de dop van de microcentrifugebuis voorkomen knallen opnl, alleen onderdompelen de onderste helft van de microcentrifugebuizen in het water. Na het verwijderen van het kokende water, plaats de microcentrifugebuis met zalmsperma DNA in ijs gedurende ten minste twee minuten.
- Voeg 5 ul van zalmsperma DNA aan elke microcentrifugebuis bevatten plasmiden.
- Meet de OD van de groeiende gistcultuur om te bevestigen dat het mid-logaritmische fase (dat wil zeggen OD lezen tussen 0,5 en 1,0) bereikt.
- Centrifugeer de gist suspensie bij 1000xg gedurende twee minuten.
- Giet het supernatant en resuspendeer de gist pellet in gesteriliseerd gedeïoniseerd water met behulp van een vortex-mixer.
- Centrifugeer de schorsing weer op 1000xg gedurende twee minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een oplossing van 0,1 M LiOAc in TE (1,02 g LiAc, 10 ml 1 M Tris bij pH 7,4, en 10 mL 0,1 M EDTA pH 8,0). Het volume van 0,1 M LiOAc in TE moet gelijk zijn aan 1 / 100 ste van de originele gistcultuur volume in YPD.
- Verdeel 100 ul van cellen om elk van de microcentrifugebuizen met de plasmiden. Flick elke tube voorzichtig in om de cellen te mengen met de plasmiden.
- Voeg 400 ul van 44% [w / v] polyethyleenglycol (PEG 4000) oplossing voor elk van de microcentrifugebuizen.
- Meng de PEG 4000 met de cellen en plasmiden. Om te voorkomen dat het breken van de cellen, doe een vortex-mixer niet te gebruiken op dit punt. Voorzichtig mengen, de microcentrifuge dop en de bodem van de microcentrifugebuis tussen wijsvinger en duim te houden, langzaam draai de buis, en dan langzaam terug te brengen van de buis naar de verticale positie. Draai de buis 90 ° om zijn cilindrische as en langzaam weer omkeren. Herhaal dit proces een aantal keer, zodat de cellen schuiven over de gehele oppervlakte van de wanden van de microcentrifugebuis.
- Plaats de microcentrifugebuizen in een 30 ° incubator gedurende 45 minuten.
- Na 45 minuten incubatie, verwijder de cellen uit de incubator en herhaal de voorzichtig mengen procedure beschreven in 14.
- Plaats de microcentrifugebuizen in een 42 ° waterbad en incubeer gedurende 15 minuten. Nogmaals, alleen onderdompelen de onderste helft van de microcentrifugebuizen in het water.
- Na de 42 ° incubatie, voeg 1 ml gesteriliseerd gedeïoniseerd water aan de microcentrifugebuizen.
- Centrifugeer de buizen in een tabletop microcentrifuge gedurende 5 seconden. Verwijder de bovenstaande vloeistof uit de buizen met behulp van een micropipetter.
- Voeg 100 ul van gesteriliseerd gedemineraliseerd water aan elk van de microcentrifugebuizen en meng de gesteriliseerde gedeïoniseerd water met de cellen met behulp van de inversie proces.
- Voeg de inhoud van een microcentrifugebuis aan een groeimedium plaat die kiest voor de bijzondere plasmiden toegevoegd aan dat microcentrifugebuis. Voeg 4-6 gesteriliseerd glazen kralen (1 mm diameter). Schud de plaat met de druppel van getransformeerde gistcellen en glazen kralen, zodat de cellen zijn verspreid over het oppervlak van de agar groeimedium. Herhaal dit proces voor elke set van getransformeerde cellen.
- Leg de platen in een 30 ° incubator voor 3 - 5 dagen. Na 3-5 dagen, zullen meerdere gist kolonies van 1-3 mm diameter worden zichtbaar op het oppervlak van het groeimedium. Op dit moment, de cellen zijn klaar om te worden afgebeeld in de spectraal opgelost twee-foton microscoop.
3. Het kalibreren van de spectraal opgelost twee-foton microscoop
De spectraal opgelost twee-foton microscoop gebruikt in deze studies is in detail beschreven elders 18, 19. In het kort, is een high-power solid-state continuous wave laser gebruikt om een geblokkeerde modus Ti pomp: Sapphire laser die pulsen femtoseconde van golflengtes, variërend van ~ 750 tot 830 Nm genereert. De laserstraal wordt gericht door een hoge NA microscoop doelstelling om een diffractie-beperkte plek op het monster. Excitatie komt alleen voor in de nabije regio brandpunt van de balk te wijten aan de lage waarschijnlijkheid van twee-foton excitatie. Een paar van de orthogonale computer gestuurde scanning spiegels worden gebruikt om de focus van de bundel te vertalen in het vlak van het monster in twee verschillende richtingen (aangeduid als x-en y-richting in heel protocol). De back-uitdragen van fluorescentie-emissie van een verlichte voxel van het monster wordt verspreid in spectrale componenten door een transmissie rooster geplaatst in het pad van de emissie voordat het licht valt incident op de pixels van een EM-CCD-array. Zo wordt de volledige spectrale profiel van een fluorescerende molecuul / moleculen binnen het centrale gebied van de bundel verkregen langs een dimensie (y-richting) van de CCD-array. Met behulp van de beweging van een van de twee scanning spiegels, kan de locatie van de laser nadruk worden gescand in de steekproef langs een lijn loodrecht op de y-richting. Door de sluiter van de CCD-camera open tijdens deze single line scan, de spectrale profielen van de fluorescerende moleculen residing over de gehele lijn van de scan worden verzameld in een enkele zwaai van de laserstraal over het monster. Accumuleren meerdere lijnen scans van deze aard op verschillende locaties y in de cel geeft de spectrale profielen van een groot aantal fluorescerende complexen die woonachtig zijn binnen de steekproef. De beelden verkregen uit de lijn scans worden gereconstrueerd om meerdere xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten van het monster bij verschillende golflengten 18, 19 te geven. Om nauwkeurig te reconstrueren en berekent de werkelijke golflengte die overeenkomt met de xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten, moet de lijn scanprotocol worden gekalibreerd met behulp van een monster met een goed gekarakteriseerde fluorescentie-emissie spectrum.
- De spectraal opgelost twee-foton microscoop accumuleert spectrale informatie over het oligomeer complexen in de cel beeld gebracht door het scannen van de focus van de excitatie balk over het monster van belang in een aantal locaties.
- Een paar van orthogonale scannen van spiegels wordt gebruikt om de focus van de laserstraal over het monster in twee verschillende richtingen vertalen. De beweging van het scannen spiegels is computergestuurd en gesynchroniseerd met de winning van de fluorescentie-intensiteit van gegevens van de CCD camera.
- Van de lijn scans, kan fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten die overeenkomt met een bepaalde golflengte van het licht worden gereconstrueerd. Om nauwkeurig te xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten te reconstrueren en berekent de werkelijke golflengte overeenkomt met elk van deze kaarten, moet de lijn scanprotocol worden gekalibreerd met behulp van fluoresceïne oplossing.
- Om te beginnen de kalibratie procedure, het midden van de excitatie spectrum bij een golflengte van 800 nm, dat is 2x de maximale excitatie golflengte van de donor tag, GFP 2. Naar het centrum van de excitatie-spectrum, vertalen de prisma gelegen binnen de laser holte aan de groep snelheid dispersie te wijzigen. Het prisma is gemonteerd op een computer gecontroleerde lineaire gemotoriseerde podium.
- Met behulp van het computerprogramma van de camera is gekoppeld aan, stuur dan een opdracht naar de CCD-chip om de temperatuur van de CCD-chip te verlagen tot de laagst haalbare temperatuur om dark ruis te verminderen.
- Pipetteer 10 pi van fluoresceïne oplossing op een microscoopglaasje. Dek af met een dekglaasje, zodat een dunne laag van het monster wordt gelijkmatig verspreid in het gebied tussen het dekglaasje en de microscoop dia.
- Plaats een klein druppeltje immersie olie op het oppervlak van het dekglaasje
- Nu Bevestig de microscoop dia om het xyz vertaling podium en het vertalen van de schuif / fase van de optische as richting door handmatig aanpassen van de lineaire actuator die het podium beweging controles in de optische as richting. Vertaal de dia / fase tot de microscoop doel in contact komt met de druppel immersie-olie.
- Met behulp van het computerprogramma dat de camera controles, overschakelen naar een video-modus van data-acquisitie, zodat het uitgestraalde licht het slaan van de CCD-array wordt weergegeven op het computerscherm in real time. Langzaam, pas dan de micrometer regelen van de vertaling fase van de optische as richting van het monster te brengen in de brandpunt van de laserstraal.
- Als de fluoresceïne monster is in focus, zal de emissie worden weergegeven als een scherpe lijn op de CCD-array. Download het uitlezen van de pixel intensiteiten van de CCD-array om de computer met behulp van de computer programma het beheersen van de camera. Meet de pixel intensiteit als functie van positie op de CCD-array door het openen van de gedownloade matrix van de intensiteit waarden in de Image J en het trekken van een lijn door de TL-regio. Gebruik het Image J commando Analyze → Plot Profile om een stuk ter illustratie van de emissie-spectrum van het fluoresceïne-monster te creëren.
- Stel de incrementele parameter van de spiegel die de beweging van de laser focus in de y-richting, zodanig dat aangrenzende y posities binnen de steekproef resulteren in de beweging van de piek van de fluorescentie spectra van precies een pixel langs de spectrale dimensie op de CCD-controles array. Monitor dit door het downloaden van de fluoresceïne spectra intensiteitswaarde de afbeelding voor een twee verschillende y posities in de steekproef, het openen van de intensiteit van beelden met Image J, en het vinden van de piek pixelpositie voor elk van de fluorescentie spectra met behulp van de Image J cursor.
- Het verlaten van de sluiter van de CCD te openen, scan de laserfocus over het monster in de x-richting. Het uitgestraalde licht van elke voxel langs de lijn van de scan moeten vallen incident op de CCD-array.
- Sla de gegevens van de CCD-array verkregen voor deze lijn scan en schakelt u de pixels van de CCD-array.
- Verplaats de positie van de laser focus in de y-richting door het bedrag bepaald in stap 11 van deze paragraaf.
- Scan de laserstraal in de x-richting over het monster, weer open te laten van de sluiter van de CCD-ARray en opslaan van de data.
- Herhaal deze lijn te scannen, totdat een fysieke ruimte ~ 50% groter dan de afmetingen van een enkele biologische cel is verlicht door middel van laserlicht.
- De relatie tussen rijnummer van een bepaalde lijn scan beeld en golflengte moeten worden gebruikt om de beelden te reconstrueren om meerdere xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten te verkrijgen bij verschillende golflengten. Voor het verkrijgen van het xy-fluorescentie-emissie beeld voor een bepaalde golflengte (λ j), vind het rijnummer op de afbeelding verkregen uit de eerste regel scan die overeenkomt met deze golflengte. Dan de aangrenzende rij van de volgende regel scan beeld komt overeen met de volgende rij van de fluorescentie-emissie afbeelding voor die bepaalde golflengte. Stapel alle het beeld rijen die overeenkomen met deze golflengte aan de xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten van het monster te verkrijgen op die golflengte. Herhaal deze procedure voor alle andere verkrijgbaar golflengten.
- Voor het berekenen van de golflengte die bij elke xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaart, bepalen de achtergrond gecorrigeerde genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van elke gereconstrueerd beeld als functie van het beeld index (j). De relatie tussen camera pixel positie in de spectrale dimensie en de golflengte van de uitgezonden fotonen is ongeveer lineair, en daarom de relatie tussen de gereconstrueerde xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaartbeelden en bijbehorende golflengte is ook lineair en als volgt berekend:
waarbij de waarde van m wordt vertegenwoordigd door: 
In het bovenstaande formalisme, het symbool λ j staat voor de golflengte van het j e gereconstrueerde beeld. De waarden van λ max en λ ½ worden uit het emissiespectrum van de fluoresceïne monster en komen overeen met de golflengtes waarop de fluorescentie-intensiteit van het fluorescerende monster is een maximum en de helft van de maximum, respectievelijk. Het beeld indices j max en j ½ komen overeen met de gereconstrueerde foto's bezit van de maximale fluorescentie-intensiteit en een half van de maximale, respectievelijk.
waarbij de waarde van m wordt vertegenwoordigd door: 
4. Verzamelen van gegevens over biologische monsters van belang
- Voor het verzamelen van gegevens op uw monsters, eerst uit de couveuse de platen met de getransformeerde gist kolonies. Er moeten minstens drie types van getransformeerde cellen volle breedte half-maximum (FWHM):
- cellen die de eiwitten van belang gelabeld met beide soorten fluorescerende probes
- cellen die alleen eiwitten gelabeld met de donor fluorescerende probes, en
- cellen die alleen eiwitten gelabeld met de acceptor fluorescerende probes.
- Voeg 100 ul van 100 mM KCl naar een microcentrifugebuis. Met behulp van een micropipet tip, schraap 3-5 gist kolonies off van de plaat van cellen die eiwitten gelabeld met zowel donor-en acceptor fluorescerende probes, en enten van de 100 mM KCl met deze cellen.
- Verwijder de 10 pi van de celsuspensie en breng het op een frisse microscoopglaasje, dekking van de druppel met een dekglaasje en leg een druppel olie op het oppervlak van het dekglaasje.
- Handmatig sluiten van de sluiter in het pad van de laserstraal naar de laser licht te blokkeren van het bereiken van de microscoop doelstelling.
- Bevestig de microscoop dia om het xyz vertaling podium en het vertalen van de schuif / fase van de optische as richting totdat de microscoop doel in contact komt met de druppel immersie-olie.
- Het brede veld beeld van het monster zal streng worden wazig vanwege de aanwezigheid van de transmissie rooster in de emissie-pad. Daarom plaats een bandpass filter met een kleine FWHM in het optische pad voorafgaand aan de overdracht rooster. Zet het brede gebied van licht verlichting, en ga naar de camera videomodus van gegevensverzameling. Langzaam vertalen de vertaling fase van de optische as richting, terwijl het bekijken van het beeld van de cellen op het camerascherm totdat de cellen worden in beeld gebracht
- Vertaal het podium in zowel de x-of de y-richting om een enkele cel te brengen naar de locatie van de laserstraal focus.
- Zet het brede veld verlichting bron. Verwijder het bandpass filter van de emissie pad.
- Deblokkeren van de laserstraal voor een korte tijd (<1 seconde), terwijl tegelijkertijd het bekijken van het signaal ontvangen heeft bij de CCD-array. Als er een fluorescent signaal wordt gedetecteerd op de CCD-array gedurende de tijd dat de laserstraal is incident op de cel, dan een volledige fluorescentie data acquisitie scan van deze cel. Het is van vitaal belang het gebruik van dezelfde scan parameters, specifiek aantal lijnen en y te verhogen, zoals bepaald in de calibratie procedure gedemonstreerd eerder.
- Herhaal de cel locatie en de fluorescentie data-acquisitie-proces voor een groot aantal van de cellen die eiwitten gekoppeld aan zowel de donor tags en acceptor tags.
- Na het vergaren van fluorescentie beelden van cellen die eiwitten gelabeld met beide receptoren, herhaal het hele proces voor zowel de cellen die alleen eiwitten gelabeld met de donor fluorescerende probes en cellen die alleen eiwitten gelabeld met de acceptor fluorescerende probes.
- Met behulp van de procedure beschreven in paragraaf 3, te reconstrueren alle scans om spectraal opgelost xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten voor elke set van gegevens te verkrijgen.
5. Beeldanalyse
Elke pixel van het xy fluorescentie-intensiteit ruimtelijke kaarten, die het gevolg zijn van een enkele scan van een fluorescerend biologische cel, bevat de volledige spectrale profiel van de moleculaire complex die woonachtig zijn in de excitatie voxel die overeenkomt met die bepaalde pixel. Als de eiwitten van belang zijn interactie met elkaar, zal deze spectrale profiel bevatten een mengsel van signalen van zowel de donor en acceptor fluorescerende probes. Met het oog op de aard van de interacties tussen de eiwitten van belang te bepalen, moet de spectrale profielen van een groot aantal van deze eiwitcomplexen in een cel worden bemonsterd en de schijnbare FRET efficiëntie (E app), gedefinieerd als het aandeel van de aangeslagen toestanden van de donor fluorescente probe die worden bij de acceptor fluorescente probe overgedragen via FRET, van elke pixel moet worden berekend.
- Bepaal de achtergrond gecorrigeerde fluorescentie-intensiteit voor elk van de gereconstrueerde beelden beschreven in hoofdstuk 4 voor de cellen die eiwitten gelabeld met alleen de donor fluorescerende probes en normaliseren tot de maximale waarde. Omdat elk van deze gereconstrueerde foto's komt overeen met een aparte golflengte (λ j) deze verzameling van genormaliseerde fluorescentie-intensiteit van de waarden overeen met de gemeten emissie spectrum van de donor sondes, i D (λ j).
- Herhaal stap 1 voor cellen die eiwitten gelabeld met alleen de acceptant tl-tags om de gemeten emissie spectrum van de acceptor sondes te verkrijgen, i A (λ j). Omdat de acceptor probe is zodanig gekozen, dat is het zelden direct enthousiast gebruik van de laserbron, zal het signaal afkomstig van acceptor alleen samples laag is en mogelijk op dezelfde orde van grootte als de cellen die inherent zijn autofluorescentie signaal. Daarom kan de gemeten acceptor fluorescentie spectrum berekend op deze manier moet worden gecorrigeerd om de bijdrage van autofluorescentie te verwijderen voordat u verder gaat.
- Met behulp van de genormaliseerde spectrum verkregen in stap 1 en stap 2, spectraal ontleden elke pixel van de fluorescentie emissie spectrum van cellen die beide eiwitten getagd met donor fluorescerende probes en eiwitten getagd met acceptor fluorescerende probes met behulp van de relatie I (λ j) = k DA i D (λ j) + k AD i A (λ j), waar ik (λ j) staat voor elk afzonderlijk pixels gemeten fluorescentie spectrum. De waarden van k en k DA AD zijn evenredig met de fluorescentie-emissie van donoren in het bijzijn van acceptanten en uit acceptanten in de aanwezigheid van de donoren, respectievelijk 5.
- Bereken de schijnbare FRET efficiëntie die de interactie van eiwitten in de cel kaarten op elke pixel met behulp van de formule,
. Hier, Q en Q D A zijn de quantum opbrengsten van donor fluorescente probe en acceptor fluorescente probe respectievelijk, en w D en w A zijn de integralen van de genormaliseerde donor en acceptor emissie spectrum, respectievelijk 19, 20. - Tot slot, maak een histogram met behulp van de berekende waarden van E app voor elke pixel, waar het aantal keren dat een bepaalde E app waarde voorkomt is uitgezet tegen die bijzondere waarde van E app.
. Hier, Q en Q D A zijn de quantum opbrengsten van donor fluorescente probe en acceptor fluorescente probe respectievelijk, en w D en w A zijn de integralen van de genormaliseerde donor en acceptor emissie spectrum, respectievelijk 19, 20. 6. Histogram-analyse
Om de kwantitatieve gegevens uit de E app histogrammen extract, wordt elke histogram theoretisch passen bij een som van Gauss functies, volgens de volgende formule: 
,
waar de A i is de amplitude, σ i de standaarddeviatie, en E 0i de meest waarschijnlijke FRET efficiëntie van de i-i-Gaussische functie. Verschillende oligomeer maats en configuraties leiden tot verschillende nummers (n) van E 0i en de verschillende correlaties tussen hen een, 17. Bijvoorbeeld voor een ruitvormig tetrameer, zijn vijf bergtoppen voorspeld, gegeven door de uitdrukkingen vermeld in tabel 1.
Tabel 1. Verband tussen elk van de vijf Gaussische piek midden waarden en de paarsgewijze FRET efficiëntie voorspeld voor een ruit gevormd tetrameer. 
Dat betekent dat er slechts een E 0i waarde moet worden aangepast in het proces van data fitting - de een die overeenkomt met E p - terwijl de andere vier zijn berekend op basis van de waarde van de E p.
- Veronderstel een oligomeer model en identificeren van het aantal gaussianen om gebruikt te worden in het aanbrengen van de E app histogrammen 1. Fit het histogram door het aanpassen van E p, A i, en σ i. Merk op dat de relatieve verdeling van de histogrammen wordt vastgesteld door het model. Minimaliseer het chi kwadraat van de passen of een andere goodness-of-fit functioneel.
- Veronderstel dat een ander waarschijnlijk oligomeer model en herhaal stap nummer 1.
- Kies het model dat het beste passen bij de gegevens voor het aantal gebruikte parameters. Dat kan nodig met behulp van een statistische toets (zoals de chi kwadraat per aantal graden van vrijheid).
Representatieve resultaten
Geïllustreerd in figuur 1 zijn de resulterende k DA, k AD, en E app ruimtelijke kaarten berekend op basis van spectraal opgelost twee-foton microscopie metingen uitgevoerd op een gistcel de uiting van de Steriele twee α-factor (Ste2p) 21, 22.
Figuur 1. Gistcel de uiting van de steriele twee α-factor receptor. Twee-dimensionale kaarten van donor (k DA) en de acceptor (k AD) signalen zijn afkomstig van de spectrale deconvolutie procedure van toepassing op elke pixel locatie van de genomen beelden met behulp van de spectraal opgelost twee-foton microscoop van een gistcel de uiting van de steriele twee α-factor receptor (Ste2p). Fluorescentie-intensiteit worden toegewezen valse kleuren op basis van hun waarden en de schaal wordt weergegeven als een inzet. Een twee-dimensionale kaart van de schijnbare fret efficiëntie werd berekend aan de hand van de k DA en k AD beelden.
Een histogram plot werd bereid met behulp van de waarden uit de E app kaart van de cel weergegeven in figuur 1. Afgebeeld in figuur 2 is het voorzien van histogram plot die overeenkomt met de gemeten E app waarden (cirkels) van de cel afgebeeld in figuur 1. De rode lijn vertegenwoordigt de beste fit met de gemeten gegevens met behulp van de som van de individuele Gaussian functies (groen doorgetrokken lijnen).
Figuur 2. Histogram perceel van E app waarden voor een gistcel de uiting van de Steriele twee α-factor receptor. Het histogram perceel dat overeenstemt met de gemeten waarden (cirkels) van E app voor de cel afgebeeld in figuur 1 is weergegeven. Individuele Gaussian functies (vast groene lijnen) worden opgeteld om te simuleren (rode lijn), de gemeten waarden. Gaussische functie parameters zijn: E 01 = 16,7; A 1 = 118,9; σ 1 = 3.2; E 02 = 25,1; A 2 = 100,0; σ 2 = 4,6; E 03 = 32,6; A 3 = 202,6; σ 3 = 4,6; E 04 = 40,1; A 4 = 92,6; σ 4 = 3,7; E 05 = 50,1; A 5 = 16,0; σ 5 = 7,9.
De relaties tussen Gaussiaans middelen die nodig zijn om de gegevens die in het histogram van figuur 2 fit zijn weergegeven in tabel 1. Het aantal en de correlatie tussen Gaussiaans functies komt overeen met het aantal en de correlaties tussen de verwachte E app waarden voor de ruit gevormd tetrameer oligomeer complexen. Daarom is blijkt uit de spectraal opgelost twee-foton metingen dat de Ste2p oligomeer complex in de vorm van een ruit gevormd tetrameer in vivo 19 op zich neemt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze presentatie, we geïllustreerd hoe de grootte en de structurele informatie over een eiwit oligomeer complex in vivo te bepalen. Terwijl gepresenteerde gegevens werden verkregen uit een specifiek membraan receptor (dwz Ste2p) uitgedrukt in gistcellen, de methode is allesomvattend in dat het kan worden toegepast op elk soort eiwit, uitgedrukt in elk type cel, de enige bepaling is dat de eiwitten zijn voorzien van tag met de juiste fluorescerende markers. Toekomstige wijzigingen van dit protocol zal omvatten het verbeteren van de instrument om hogere scansnelheden te bereiken in een poging om de tijd-afhankelijke eiwit-oligomeer omvang en structuur veranderingen te controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de UW-Milwaukee Research Groei-initiatief, de Wisconsin Instituut voor Biomedische Technologie en Gezondheid, en de Bradley Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , Springer. London. (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J. Pheromone response in yeast. Annu Rev Biochem. 61, 1097-1129 (1992).
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
