Summary
من خلال استخدام التصوير الطيفي المجهري اثنين الفوتون النظام ، ويتم الحصول على بكسل المستوى خرائط لنقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) معربا عن كفاءات لخلايا مستقبلات الغشاء المفترضة لتشكيل هومو oligomeric المجمعات. من الحنق خرائط الكفاءة ، ونحن قادرون على تقدير متكافئة معلومات عن مركب قليل وحدات قيد الدراسة.
Abstract
دراسة التفاعلات البروتين في الخلايا الحية مجالا هاما للبحث لأن المعلومات التي تراكمت فوائد التطبيقات الصناعية على حد سواء فضلا عن زيادات الأساسية المعرفة البيولوجية الأساسية. وقد فورستر للطاقة الرنين (الإسفار) نقل (الحنق) بين جزيء المانحة في حالة مثارة الكترونيا ومتقبل جزيء قريب تستخدم بشكل متكرر للدراسات من البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية. والموسومة البروتينات في المصالح مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت وأعرب في الخلايا البيولوجية. نحن متحمسون ثم تحقيقات الفلورسنت ، وعادة باستخدام أشعة الليزر ، ويتم جمع الخصائص الطيفية من الانبعاثات الصادرة عن مضان تحقيقات الفلورسنت وتحليلها. يتم تضمين المعلومات المتعلقة درجة التفاعل البروتين في بيانات الانبعاثات الطيفية. عادة ، يجب أن تفحص الخلية عددا من المرات من أجل تجميع المعلومات الطيفية كافية لتحديد دقيق لمدى التفاعل البروتين لكل منطقة من المصالح داخل الخلية. ومع ذلك ، قد التكوين الجزيئي لتغيير هذه المناطق خلال عملية الاستحواذ ، مما يحد من عزم المكانية من القيم الكمية للكفاءات الحنق على ما يبدو الى ما معدله أكثر من الخلايا بأكمله. عن طريق الميكروسكوب ثنائي الفوتون الطيفي ، ونحن قادرون على الحصول على مجموعة كاملة من الصور الطيفي واحد فقط بعد فحص الإثارة الكاملة للعينة من الفائدة. من هذه البيانات بكسل المستوى الطيفي ، وخريطة لالحنق وتحسب الكفاءة في جميع أنحاء الخلية. من خلال تطبيق نظرية بسيطة من الحنق في المجمعات oligomeric للتوزيع التي تم الحصول عليها تجريبيا من الحنق الكفاءة في جميع أنحاء الخلية ، وهو واحد تفحص الطيفي يكشف عن معلومات حول القياس المتكافئ والهيكلية المعقدة قليل وحدات قيد الدراسة. نحن هنا وصف الإجراء إعداد الخلايا البيولوجية (خميرة السكيراء الخميرة) معربا عن غشاء المستقبلات (2 العقيمة α مستقبلات عامل) الموسومة مع نوعين مختلفين من تحقيقات الفلورسنت. علاوة على ذلك ، نحن لتوضيح العوامل الحاسمة التي ينطوي عليها جمع البيانات مضان الطيفي باستخدام التصوير المجهري اثنين الفوتون النظام. ويجوز تمديد استخدام هذا البروتوكول لدراسة أي نوع من البروتين الذي يمكن التعبير عنه في الخلية الحية مع علامة فلوري مرفقة به.
Protocol
1. البلازميد التصميم
وتنصهر البروتينات ذات الاهتمام إلى واحد من التسميات two الفلورسنت مختلفة ، كما هو موضح المقبل. الفلورسنت التسميات لا تقدم سوى معلومات عن مكان وجود البروتينات داخل الخلية ، ولكن أيضا معلومات بشأن الكمية هومو oligomerization من البروتين 1. يستخدم تقنية الرنين الإسفار نقل الطاقة (الحنق) 2-4 لتراكم المعلومات حول تفاعلات البروتين 5-10. الحنق يستخدم المبدأ الذي نقل الطاقة يمكن أن تحدث من جزيء متحمس بصريا (عادة ما يشار اليه بوصفه المانح ، D) لجزيء unexcited (ويشار عادة إلى أنه متقبل ، A) عن طريق ثنائي القطب ، ثنائي القطب التفاعلات 11 ، إذا الجزيئين يأتي على مقربة من بعضها البعض. في تصميم البلازميدات ترميز البروتينات الانصهار ، وينبغي ألا يغيب اثنين من الميزات الأساسية في الاعتبار ، على النحو التالي.
- اختيار الزوج متوافق به نيون هو من أهمية قصوى في الحنق الدراسات. مثالي ، يجب أن تكون تركيبة العلامة الفلورسنت تلبية معيارين : تداخل ملحوظ في موجات الطيف بين الانبعاثات من العلامة المانحة وطيف الإثارة للعلامة متقبل ، وفكرة الفصل بين الطول الموجي واسعة وسط الطيف نبضة ليزر وطيف الإثارة من متقبل (أي تحول كبير ستوكس). نوعين مختلفين من البروتين الفلوري الأخضر 12 ، 13 بشكل خاص مناسبة تماما لتلبية هذه المعايير : في GFP (2) ، إحدى الجهات المانحة (14) والبروتين أصفر فلوري (YFP) 12 أو البديل من وصفته ب فينوس (15) ، والمتقبلة. ويمكن أيضا أن تستخدم أزرق 16 جهة مانحة ، على الرغم من النتائج إلى حد ما مع أكثر تواضعا.
- في كمية الحنق التصوير فمن الأفضل إذا هو متحمس واحد فقط من الجهات المانحة في مجمع الجزيئية في وقت واحد (في المتوسط) ، بحيث لا يحدث التنافس بين الجهات المانحة لنقل الطاقة إلى متقبل نفسه في المجمعات التي تحتوي على أكثر من واحد المانحة ومتقبل one . هذا يؤدي إلى التبسيط في نظرية و 17 عملية تحليل البيانات. بسبب ذلك ، فإن مستوى اشارة منخفض عادة. للتعويض عن ذلك ، ينبغي على مستوى التعبير عن بروتينات الفائدة تكون مرتفعة نسبيا. وحققت مستويات عالية التعبير باستخدام نسخة عالية البلازميد لحمل جين البروتين في الخلية.
2. خميرة التحول
فإنه من المفيد لزيادة النسبة المئوية للسكان الخلية التعبير عن بروتين يبني الفائدة. لهذا الغرض ، ونحن تحويل عبئا عونية التغذي من خلايا الخميرة (خميرة السكيراء) ، غير قادر على إنتاج التربتوفان أو اليوراسيل ، مع اثنين من البلازميدات مختلفة ، واحدة تحتوي على التربتوفان علامة اختيار واحدة من اليوراسيل علامة. والبلازميدات تحتوي أيضا على الجينات التي تحمل تعليمات للخلية للتعبير عن بروتين الاهتمام المفتاحية مع واحدة من تحقيقات two الفلورسنت. تزرع الخلايا تحولت على لوحات متوسطة الصلبة التي تفتقر أيضا التربتوفان واليوراسيل. ينبغي تحويل ما لا يقل عن ثلاثة أنواع من الخلايا : خلايا التعبير عن البروتينات التي تهم المفتاحية مع كلا النوعين من تحقيقات الفلورسنت ، معربا عن بروتينات الخلايا الموسومة فقط مع تحقيقات المانحة الفلورسنت والتعبير عن بروتينات الخلايا الموسومة فقط مع تحقيقات الفلوريسنت المتقبلة.
- إعداد لوحات متوسطة الصلبة (1.7 غرام / لتر من الأحماض النيتروجين الخميرة ث / س قاعدة الأمينية ، 1.6 غرام / لتر التسرب الاصطناعية الخميرة المتوسطة اليوراسيل ث / س والتربتوفان ، 2 ٪ [ث / V] الجلوكوز ، 2 ٪ [ث / V] أجار) لاستخدامه كوسيلة لنمو الخلايا تحولت على الأقل قبل يوم واحد في تحول الخلية. ويمكن استخدام لوحات المتوسطة الصلبة لمدة تصل الى شهرين بعد إعداد إذا كانت لا تزال خالية من أي ملوثات.
- لأن تتحول كل زوج البلازميد ، إضافة 10 مل من YPD (10 الخميرة Bacto ز / L استخراج 20 غراما / L ببتون Bacto ، و 2 ٪ الجلوكوز [ث / ت]) إلى دورق مخروطي. Incoluate في YPD مع مستعمرة من سلالة عونية التغذي من خلايا الخميرة إلى أن تتحول.
- وضع دورق مخروطي يحتوي على الخميرة في الثقافة شاكر المختبرات ، والتي تنص على إجراء المدارية يحوم على العينات ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية وفي صباح اليوم التالي ، بدء مراقبة نمو ثقافة الخلية عن طريق إزالة دوريا من الحجم الصغير ثقافة واختبار الكثافة الضوئية (OD). وينبغي على نمو الخلية تكون الثقافة في منتصف المرحلة لوغاريتمي ، أي التطوير التنظيمي من 0،5-1،0 ، في وقت التحويل.
- أن تتحول إلى ودائع 5 ميكرولتر من كلا النوعين من البلازميدات في أنبوب microcentrifuge معقمة لكل زوج البلازميد.
- لأن تتحول كل زوج البلازميد ، إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون (5 ملغ / مل) إلى أنبوب microcentrifuge فارغة. يغرق في النصف السفلي من الأنبوب microcentrifuge تحتوي على الحمض النووي الحيوانات المنوية السلمون في الماء المغلي لمدة خمس دقائق. لمنع غطاء للأنبوب microcentrifuge من المرجع تفرقعEN ، يغرق فقط في النصف السفلي من الأنابيب microcentrifuge في الماء. بعد إزالة من الماء المغلي ، ووضع أنبوب microcentrifuge تحتوي على الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية في الثلج لمدة لا تقل عن دقيقتين.
- إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الحيوانات المنوية لسمك السلمون يحتوي كل أنبوب microcentrifuge البلازميدات.
- قياس التطوير التنظيمي للثقافة الخميرة المتزايد للتأكد من أنها وصلت في منتصف المرحلة لوغاريتمي (أي OD قراءة ما بين 0.5 و 1.0).
- الطرد المركزي التعليق على 1000xg الخميرة لمدة دقيقتين.
- تخلصي من طاف وresuspend الكرية الخميرة في الماء منزوع الأيونات تعقيمها باستخدام خلاط دوامة.
- الطرد المركزي للتعليق مرة أخرى في 1000xg لمدة دقيقتين.
- تجاهل وطاف resuspend الكرية في حل LiOAc 0.1M في TE (1.02 ز LiAc ، 10 مل من تريس 1M عند pH 7.4 ، 0.1 و 10 مل M EDTA عند pH 8.0). وينبغي أن حجم LiOAc 0.1M في TE تكون مساوية 1 / 100 ال من حجم الخمائر الثقافة الأصلية في YPD.
- توزيع 100 ميكرولتر من الخلايا في كل من أنابيب microcentrifuge تحتوي على البلازميدات. نفض الغبار كل أنبوب بلطف من أجل خلط الخلايا مع البلازميدات.
- إضافة 400 ميكرولتر من 44 ٪ [ث / V] البولي ايثيلين جلايكول (PEG 4000) حل كل من أنابيب microcentrifuge.
- المزيج برفق PEG 4000 مع الخلايا والبلازميدات. من أجل تجنب كسر الخلايا ، لا تستخدم خالط دوامة عند هذه النقطة. لخلط بلطف ، عقد microcentrifuge سقف وقاع الأنبوب microcentrifuge بين السبابة والإبهام ، عكس الأنبوب ببطء ، ومن ثم جلب ببطء الأنبوب مرة أخرى إلى وضع مستقيم. تدوير أنبوب 90 درجة حول محورها اسطواني وعكس ببطء مرة أخرى. كرر هذه العملية عدة مرات حتى يتسنى للخلايا الانزلاق على مساحة كامل من جدران أنبوب microcentrifuge.
- وضع أنابيب microcentrifuge في الحاضنة 30 درجة لمدة 45 دقيقة.
- بعد 45 دقيقة الحضانة ، وإزالة الخلايا من الحاضنة وكرر الإجراء لطيف وصفها في خلط 14.
- وضع أنابيب microcentrifuge في حمام المياه 42 درجة و 15 دقيقة للاحتضان. مرة أخرى ، يغرق فقط في النصف السفلي من الأنابيب microcentrifuge في الماء.
- بعد الحضانة رقم 42 ، إضافة 1 مل من الماء منزوع الأيونات معقمة للأنابيب microcentrifuge.
- أنابيب الطرد المركزي في microfuge الطاولة لمدة 5 ثوان. إزالة طاف من الأنابيب باستخدام micropipetter.
- إضافة 100 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات معقمة إلى كل من أنابيب microcentrifuge ومزيج الماء المعقم منزوع الأيونات مع الخلايا باستخدام عملية انقلاب.
- إضافة محتويات أنبوب microcentrifuge واحد إلى لوحة متوسطة النمو الذي يختار لالبلازميدات خاص إضافة إلى أن أنبوب microcentrifuge. إضافة الخرز الزجاجي المعقم 4-6 (1 مم). هزة لوحة تحتوي على قطرات من تحويل خلايا الخميرة والخرز الزجاجي من أجل أن يتم انتشار الخلايا على سطح آغار المتوسطة النمو. كرر هذه العملية لكل مجموعة من الخلايا المتحولة.
- وضع لوحات في الحاضنة 30 درجة لمدة 3 -- 5 أيام. بعد 3-5 أيام ، ومستعمرات الخميرة متعددة من القطر 1-3 مم تكون مرئية على سطح متوسطة النمو. في هذا الوقت ، فإن الخلايا جاهزة للتصوير في مجهر ثنائي الفوتون الطيفي.
3. معايرة الطيفي ثنائي الفوتون المجهر
وقد وصفت الطيفي اثنين الفوتون الاداة المستخدمة في هذه الدراسات بالتفصيل في مكان آخر 18 و 19. باختصار ، يستخدم طاقة عالية الحالة الصلبة ليزر الموجة المستمرة لوضع مضخة غير الساحلية تي : ليزر الياقوت الذي يولد نبضات الفيمتو ثانية من موجات تتراوح بين 750-830 نانومتر ~. وتركز شعاع الليزر عالية هدفا المجهر NA الى بقعة حيود محدودة على العينة. الإثارة يحدث فقط في المنطقة المركزية بالقرب من الحزم بسبب احتمال انخفاض اثنين من الفوتون الإثارة. يتم استخدام زوج من المرايا متعامد المسح الكمبيوتر التي تسيطر عليها لترجمة تركيز شعاع داخل الطائرة من العينة في اتجاهين مختلفين (ويشار إلى x و y الاتجاهات طوال بروتوكول). وفرقت الانبعاثات مضان الخلفية نشر من فوكسل مضيئة من العينة إلى مكونات الطيفي بواسطة صريف انتقال وضعها في مسار الانبعاثات قبل يسقط ضوء الحادث على بكسل من صفيف EM - CCD. وبالتالي ، يتم الحصول على ملف كامل من أي جزيء الطيفية الفلورية / الجزيئات داخل المنطقة المحورية من الحزم على طول أحد أبعاد (ذ اتجاه) من الصفيف اتفاقية مكافحة التصحر. باستخدام حركة واحدة من المرايا المسح اثنين يمكن أن تفحص مكان تركيز الليزر داخل العينة على طول خط عمودي على اتجاه ذ. عن طريق الحفاظ على فتح مصراع الكاميرا من خلال هذا المسح CCD سطر واحد ، لمحات من الدقة الطيفية جزيئات الفلورسنتيتم جمع iding على طول الخط من التفحص في واحدة اكتساح واحد من شعاع الليزر عبر العينة. تراكم بفحص خط متعددة من هذا النوع في أماكن مختلفة ذ داخل الخلية يعطي لمحات طيفية لعدد كبير من المجمعات الفلورسنت المقيمين داخل العينة. يتم بناؤها من الصور التي تم الحصول عليها من مسح سطر لإعطاء خرائط متعددة XY كثافة مضان المكاني للعينة عند أطوال موجية مختلفة 18 و 19. من أجل إعادة بناء بدقة وحساب الطول الموجي الفعلية المقابلة للكثافة خرائط XY الفلورسنت المكانية ، يجب معايرة بروتوكول خط المسح باستخدام عينة مع طيف الانبعاث مضان جيدا اتسم.
- والطيفي اثنين الفوتون المجهر تتراكم المعلومات حول المجمعات الطيفية قليل وحدات في الخلية المصورة عن طريق المسح الضوئي للتركيز شعاع الإثارة عبر عينة من الفائدة في عدد من المواقع.
- ويستخدم زوج من المرايا متعامد المسح لترجمة تركيز شعاع الليزر عبر العينة في اتجاهين مختلفين. حركة المرايا المسح هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها ، وتزامن ذلك مع استخراج البيانات كثافة مضان من كاميرا CCD.
- من يمسح الخط ، ويمكن بناؤها خرائط الشدة الفلورسنت المكانية المقابلة لطول موجة معينة من الضوء. من أجل إعادة بناء خرائط XY بدقة كثافة الفلورسنت المكانية وحساب الطول الموجي الفعلية المقابلة لكل من هذه الخرائط ، يجب معايرة بروتوكول المسح باستخدام خط فلوريسئين الحل.
- لبدء إجراء المعايرة ، ومركز الطيف الإثارة في الطول الموجي من 800 نانومتر ، والتي 2X الطول الموجي الأقصى من الإثارة سمة المانحة ، GFP 2. إلى مركز الطيف الإثارة ، ترجمة المنشور الموجود داخل تجويف الليزر لتعديل سرعة تشتت الفريق. هي التي شنت المنشور على جهاز كمبيوتر للرقابة خطية مرحلة الآلية.
- باستخدام برنامج كمبيوتر موصول إلى الكاميرا ، وإرسال أمر إلى رقاقة CCD لخفض درجة الحرارة في رقاقة CCD إلى درجة حرارته أقل مستوى ممكن من أجل الحد من الضوضاء الظلام.
- ماصة 10 ميكرولتر من محلول فلوريسئين على شريحة المجهر. مع تغطية ساترة بحيث تتوزع بشكل موحد على طبقة رقيقة من العينة في المنطقة الواقعة بين ساترة والشريحة المجهر.
- وضع قطرة صغيرة من زيت الغمر على سطح ساترة
- أربط الآن الشريحة المجهر لمرحلة الترجمة وترجمة XYZ الشريحة / المرحلة في اتجاه المحور البصري عن طريق ضبط المحرك يدويا الخطية التي تسيطر على حركة المسرح في اتجاه المحور البصري. ترجمة الشريحة / المرحلة حتى الهدف المجهر يأتي في اتصال مع انخفاض النفط الغمر.
- باستخدام برنامج الكمبيوتر الذي يتحكم في الكاميرا ، والتحول إلى وضع الفيديو من الحصول على البيانات بحيث يتم عرض الضوء المنبعث ضرب مصفوفة CCD على شاشة الكمبيوتر في الوقت الحقيقي. ببطء ، وضبط ميكرومتر السيطرة على مرحلة الترجمة في اتجاه المحور البصري لتقديم نموذج في نقطة بؤرية من شعاع الليزر.
- عندما العينة فلوريسئين هو في التركيز ، وانبعاث تبدو وكأنها خط حاد على مجموعة مكافحة التصحر. حمل قراءات من شدة بكسل من الصفيف اتفاقية مكافحة التصحر إلى جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج كمبيوتر السيطرة على الكاميرا. قياس كثافة بكسل كدالة للموقف بشأن اتفاقية مكافحة التصحر من خلال افتتاح مجموعة مصفوفة من القيم كثافة التحميل في J صورة ورسم خط من خلال المنطقة الفلورسنت. استخدام الأمر صورة J تحليل → الشخصي مؤامرة لخلق مؤامرة توضح الطيف انبعاث العينة فلوريسئين.
- ضبط المعلمة الإضافية من المرآة التي تسيطر على حركة تركيز الليزر في الاتجاه Y ، ان هذه المواقف المتاخمة ذ داخل نتيجة العينة في حركة ذروة التألق من قبل أطياف بكسل واحد بالضبط على طول البعد الطيفية على اتفاقية مكافحة التصحر صفيف. رصد ذلك من خلال تحميله شدة الأطياف فلوريسئين صورة قيمة للموقعين ذ المختلفة في العينة ، وفتح الصور مع كثافة J الصور ، وإيجاد موقف بكسل الذروة لكل من الأطياف مضان باستخدام المؤشر J صورة.
- ترك فتح مصراع لاتفاقية مكافحة التصحر ، والمسح الضوئي ليزر عبر التركيز على نموذج في الاتجاه س. ينبغي أن الضوء المنبعث من كل فوكسل على طول خط المسح حادث سقوط على مجموعة مكافحة التصحر.
- تخزين البيانات من الصفيف اتفاقية مكافحة التصحر التي تم الحصول عليها لهذا الخط ومسح واضح ثم بكسل من الصفيف اتفاقية مكافحة التصحر.
- نقل موضع تركيز الليزر في الاتجاه ذ من المبلغ المحدد في الخطوة 11 من هذا الباب.
- مسح شعاع الليزر في اتجاه x عبر العينة ، مرة أخرى ، ترك الباب مفتوحا للمصراع ع CCDراي وتخزين البيانات.
- كرر هذا الإجراء حتى خط مسح منطقة الجسدية ~ تم مضيئة 50 ٪ أكبر من أبعاد خلية بيولوجية واحدة بواسطة ضوء الليزر.
- وينبغي أن تستخدم في العلاقة بين عدد من صف صورة خط مسح خاص والطول الموجي لإعادة بناء الصور للحصول على خرائط متعددة XY كثافة الفلورسنت المكاني عند أطوال موجية مختلفة. للحصول على انبعاثات مضان XY الصورة لطول موجة معينة (λ ي) ، والعثور على عدد الصفوف على الصورة التي تم الحصول عليها من مسح السطر الأول الذي يتوافق مع هذا الطول الموجي. ثم الصف المجاور للصورة خط مسح اللاحقة يناظر الصف التالي للصورة الانبعاث مضان لهذا الطول الموجي. مكدس كافة الصفوف التي تتوافق مع صورة لهذا الطول الموجي للحصول على الخرائط المساحية س ص كثافة الفلورسنت من العينة على أن الطول الموجي. كرر هذا الإجراء للجميع الحصول عليها موجات أخرى.
- لحساب طول الموجة المرتبطة بكل شدة XY خريطة الفلورسنت المكاني ، وتحديد الخلفية تصحيح كثافة مضان تطبيع كل صورة بناؤها بوصفها وظيفة من مؤشر صورة (ي). العلاقة بين الموقف بكسل الكاميرا في البعد الطيفية والطول الموجي للفوتونات المنبعثة خطي تقريبا ، وبالتالي العلاقة بين بناء صور س ص كثافة الخريطة المكانية الفلورسنت والطول الموجي المطابق هو أيضا الخطية وتحسب على النحو التالي :
حيث يتم تمثيل قيمة م من قبل : 
الشكلية في أعلاه ، ي يمثل رمزا λ الطول الموجي للصورة ال ي إعادة بنائها. يتم استخراج قيم أقصى λ λ ونصف من طيف الانبعاث من العينة فلوريسئين وتتوافق مع الموجات التي كثافة مضان من العينة الاستشعاع هو الحد الأقصى ونصف كحد أقصى ، على التوالي. مؤشرات صورة ي ي ½ ماكس وتتوافق مع الصور بناؤها امتلاك أقصى كثافة مضان ونصف كحد أقصى ، على التوالي.
حيث يتم تمثيل قيمة م من قبل : 
4. جمع البيانات عن العينات البيولوجية من الفائدة
- لجمع البيانات عن العينات الخاصة بك ، أولا إزالة من الحاضنة لوحات مع مستعمرات الخميرة المحولة. ينبغي أن يكون هناك على الأقل ثلاثة أنواع من الخلايا تحولت ذات العرض الكامل نصف كحد أقصى (FWHM) :
- معربا عن الخلايا والبروتينات ذات الاهتمام المفتاحية مع كلا النوعين من تحقيقات الفلورسنت
- معربا عن بروتينات الخلايا الموسومة فقط مع تحقيقات المانحة الفلورسنت ، و
- معربا عن بروتينات الخلايا الموسومة فقط مع تحقيقات الفلوريسنت المتقبلة.
- إضافة 100 ميكرولتر من بوكل 100 ملم إلى أنبوب microcentrifuge. استخدام غيض micropipette ، كشط مستعمرات الخميرة 3-5 الخروج من لوحة من الخلايا معربا عن البروتينات المرتبطة دلاليا مع كل من الجهات المانحة وتحقيقات الفلورسنت متقبل ، وتلقيح 100 بوكل ملم مع هذه الخلايا.
- إزالة 10 ميكرولتر لتعليق الخلية والاستغناء على شريحة المجهر العذبة ، وتغطية قطيرة مع ساترة ، ووضع قطرات من الزيت على سطح ساترة.
- إغلاق مصراع الكاميرا يدويا في مسار شعاع الليزر لحجب ضوء الليزر من الوصول إلى الهدف المجهر.
- ربط الشريحة المجهر لمرحلة الترجمة وترجمة XYZ الشريحة / المرحلة في اتجاه المحور البصري حتى الهدف المجهر يأتي في اتصال مع انخفاض النفط الغمر.
- وسوف تكون صورة حقل واسع من العينة عدم وضوح شديد بسبب وجود صريف انتقال في مسار الانبعاثات. مكان ولذلك ممر الموجة مرشح مع FWHM صغيرة في المسار البصري السابقة صريف الإرسال. بدوره على ضوء إنارة حقل واسع ، والانتقال إلى وضع الفيديو الكاميرا في جمع البيانات. ترجمة ببطء مرحلة الترجمة في اتجاه المحور البصري أثناء عرض الصور من الخلايا التي تظهر على الشاشة الكاميرا حتى يتم إحضارها إلى التركيز على الخلايا
- ترجمة المرحلة إما في x أو الاتجاه ذ من أجل تحقيق خلية واحدة إلى موقع للتركيز شعاع الليزر.
- إيقاف الإضاءة حقل واسع للمصدر. إزالة عامل التصفية ممر الموجة من مسار الانبعاثات.
- افراج عن شعاع الليزر لفترة قصيرة (<1 ثانية) ، في حين عرض في الوقت نفسه إشارة وردت في مجموعة مكافحة التصحر. إذا تم الكشف عن إشارة الفلورسنت على الصفيف اتفاقية مكافحة التصحر خلال الفترة من شعاع الليزر هو الحادث على الخلية ، ثم تنفيذ كامل للحصول على البيانات مضان تفحص هذه الخلية. فمن الأهمية بمكان استخدام نفس المعلمات المسح الضوئي ، وعلى وجه التحديد عدد من الخطوط وزيادة ذ ، كما هو محدد في كاليفورنياتظاهر الداخلي الميسان في وقت سابق.
- كرر موقع الخلية ومضان عملية الحصول على البيانات لعدد كبير من الخلايا معربا عن البروتينات المرفقة به الجهات المانحة على حد سواء والعلامات المتقبلة.
- بعد تراكم الصور مضان معربا عن بروتينات الخلايا الموسومة مع كل من المستقبلات ، كرر العملية برمتها لكلا الخلايا معربا عن البروتينات فقط المفتاحية مع تحقيقات المانحة الفلورسنت والتعبير عن بروتينات الخلايا الموسومة فقط مع تحقيقات الفلوريسنت المتقبلة.
- باستخدام الإجراء الموضح في الفقرة 3 ، وإعادة بناء جميع بمسح للحصول على خرائط الطيفي س ص كثافة الفلورسنت المكاني لكل مجموعة من البيانات.
5. تحليل الصور
كل بكسل من شدة خرائط XY الفلورسنت المكانية ، والتي تنتج عن فحص واحد من خلية بيولوجية الاستشعاع ، ويحتوي على ملف كامل للمجمع الطيفية الجزيئية المقيمين في فوكسل الإثارة في المقابل الى ان بكسل معينة. إذا البروتينات ذات الاهتمام تتفاعل مع بعضها البعض ، فإن هذا التعريف الطيفية تحتوي على خليط من الاشارات من الجهات المانحة على حد سواء وتحقيقات الفلورسنت المتقبلة. من أجل تحديد طبيعة التفاعلات بين البروتينات ذات الاهتمام ، لا بد من أخذ عينات لمحات طيفية من عدد كبير من هذه المجمعات البروتين في الخلية والحنق واضحة الكفاءة (E التطبيق) ، الذي يعرف بأنه نسبة الدول متحمس يجب أن لجنة التحقيق المانحة الفلورسنت التي تصبح نقل للتحقيق في فلوري متقبل عبر الحنق ، كل بكسل يمكن حسابها.
- تحديد الخلفية لتصحيح كثافة مضان لكل من الصور بناؤها وصفها في الفرع 4 لخلايا التعبير عن البروتينات المرتبطة دلاليا مع تحقيقات فقط المانحة الفلورسنت وتطبيع إلى القيمة القصوى. لأن كل هذه الصور بناؤها يتوافق مع طول موجة منفصلة (λ ي) هذه المجموعة من القيم تطبيع كثافة مضان يتوافق مع طيف وقياس الانبعاثات من تحقيقات المانحة ، D I (λ ي).
- كرر الخطوة 1 من أجل التعبير عن بروتينات الخلايا الموسومة مع العلامات فقط الفلورسنت متقبل للحصول على الطيف قياس الانبعاثات من تحقيقات متقبل ، ط A (λ ي) منذ اختيار لجنة التحقيق متقبل بحيث نادرا ما متحمس مباشرة باستخدام مصدر الليزر ، وسوف إشارة الصادرة من عينات فقط متقبل يكون منخفضا ، وربما على نفس الترتيب من حيث حجمها إشارة الخلايا الكامنة تألق ذاتي. لذلك ، قد الطيف متقبل قياس مضان محسوب في هذه الطريقة تحتاج إلى تصحيح لإزالة مساهمة تألق ذاتي قبل المتابعة.
- استخدام الطيف تطبيع حصلت عليه في الخطوة 1 و في الخطوة 2 ، تتحلل طيفيا كل بكسل من الطيف الانبعاثات مضان من الخلايا التعبير عن كل من البروتينات المرتبطة دلاليا مع تحقيقات المانحة والبروتينات الفلورية المفتاحية مع تحقيقات الفلورسنت متقبل أنا باستخدام العلاقة (ي λ) = ك DA ط D (λ) ي + م ك ط A (λ ي) حيث I (λ ي) ويمثل كل بكسل قياس الطيف سيما مضان. قيم DA ك ك م ومتناسبة مع مضان الانبعاثات من الجهات المانحة ، في حضور ويقبلون من يقبلون في حضور الجهات المانحة ، على التوالي 5.
- حساب الكفاءة التي الحنق واضحة خرائط تفاعل البروتينات في الخلية في كل بكسل باستخدام الصيغة ،
. هنا ، سؤال وجواب D هي الغلة الكم من التحقيق المانحة الفلورسنت والتحقيق الفلورسنت متقبل على التوالي ، والتطوير وث ث A هي تكاملات للتطبيع المانحة ومتقبل طيف الانبعاث ، على التوالي 19 و 20. - أخيرا ، إنشاء المدرج باستخدام القيم المحسوبة لE التطبيق لكل بكسل ، حيث يتم رسم عدد مرات التطبيق E محددة القيمة التي تحدث ضد قيمة معينة من التطبيق والتقييم.
. هنا ، سؤال وجواب D هي الغلة الكم من التحقيق المانحة الفلورسنت والتحقيق الفلورسنت متقبل على التوالي ، والتطوير وث ث A هي تكاملات للتطبيع المانحة ومتقبل طيف الانبعاث ، على التوالي 19 و 20. 6. تحليل الرسم البياني
من أجل انتزاع معلومات كمية من المدرج الاحصائي التطبيق E ، كل رسم بياني لائقا من الناحية النظرية مع مجموع الوظائف التمويه ، وفقا للمعادلة التالية : 
،
حيث A هي السعة ط ، ط σ الانحراف المعياري ، و0i E المحتمل أن معظم الحنق كفاءة وظيفة غاوسي إيث ط. قليل وحدات مختلفة الحجمق وتكوينات تؤدي إلى أرقام مختلفة (ن) من 0i E والعلاقات المتبادلة بينهما 1 و 17. على سبيل المثال ، لtetramer دالتون الشكل ، ومن المتوقع خمس قمم ، التي قدمها التعبيرات الواردة في الجدول رقم 1.
الجدول 1. العلاقة بين كل من مركز غاوسي خمس قيم الذروة والبشرى والحنق الكفاءة المتوقعة لtetramer a شكل المعين. 
وهذا يعني قيمة واحدة فقط E 0i بحاجة إلى تعديل في عملية تركيب البيانات -- واحد يناظر E ع -- في حين يتم احتساب الأربعة الأخرى من قيمة ع ه.
- تفترض نموذجا قليل وحدات وتحديد عدد Gaussians لاستخدامها في تركيب التطبيق E 1 المدرج الاحصائي. تناسب الرسم البياني عن طريق ضبط E ع ، أ ط ، وσ ط. لاحظ أن يتم إصلاح التصرف النسبي للرسوم بيانية في النموذج. تقليل مربع تشي من احتواء أو بعض الدول الأخرى وظيفية الخير من بين مناسبا.
- يفترض نموذج آخر قليل وحدات من المحتمل وكرر عدد الخطوة 1.
- اختيار النموذج الأفضل التي تناسب البيانات لعدد من المقاييس المستخدمة. قد تتطلب استخدام الاختبار الإحصائي (مثل تشي مربع في عدد من درجات الحرية).
ممثل النتائج
موضح في الشكل رقم 1 هي الناتجة ك DA ، AD ك و E خرائط التطبيق المكاني حسابها من الطيفي قياسات ثنائية الفوتون المجهري تجرى على خلايا الخميرة معربا عن 2 العقيمة α عامل (Ste2p) 21 ، 22.
الشكل 1. خلية الخميرة معربا عن العقيمة 2 α مستقبلات عامل. تم الحصول على خرائط ذات بعدين من الجهات المانحة (ك DA) وإشارات متقبل (ك م) من الإجراء deconvolution الطيفية تطبيقها على كل موقع بكسل من الصور الملتقطة باستخدام الطيفي ثنائي الفوتون مجهر لخلية الخميرة معربا عن العقيمة 2 α مستقبلات عامل (Ste2p). يتم تعيين كثافة مضان الألوان كاذبة وفقا لقيمها ويظهر النطاق بوصفها أقحم. حسبت خريطة ثنائية الأبعاد من الكفاءات الحنق واضح باستخدام DA ك ك م والصور.
وقد أعد مؤامرة الرسم البياني باستخدام القيم المستخرجة من الخريطة التطبيق E من الخلية هو مبين في الشكل 1. في الصورة في الشكل (2) هي مؤامرة المدرج مجهز المقابلة لقياس القيم E التطبيق (دوائر) من الخلايا المصورة في الشكل 1. خط أحمر الصلبة يمثل أفضل يصلح لقياس البيانات باستخدام مجموع الوظائف غاوسي الفردية (خطوط خضراء صلبة).
الشكل 2. مؤامرة الرسم البياني للقيم التطبيق E لخلية الخميرة معربا عن العقيمة 2 α مستقبلات عامل. يظهر الرسم البياني المؤامرة التي تتطابق مع القيم المقاسة (دوائر) من التطبيق E للخلية المصورة في الشكل 1. تتلخص وظائف فردية غاوسي (خطوط خضراء صلبة) لمحاكاة (خط أحمر الصلبة) القيم المقاسة. معلمات الدالة غاوسي هي : E = 01 16.7 ؛ A 1 = 118.9 ؛ σ 1 = 3.2 ؛ E 02 = 25.1 ؛ A 2 = 100.0 ؛ σ 2 = 4.6 ؛ E 03 = 32.6 ؛ A 3 = 202.6 ؛ σ 3 = 4.6 ؛ E 04 = 40.1 ؛ A 4 = 92.6 ؛ σ 4 = 3.7 ؛ E 05 = 50.1 ؛ A 5 = 16.0 ؛ σ 5 = 7.9.
العلاقات بين غاوسي الوسائل اللازمة لاحتواء البيانات المعروضة في الرسم البياني في الشكل 2 وترد في الجدول 1. عدد والعلاقة بين وظائف غاوسي مساويا لعدد والعلاقات المتبادلة بين القيم التطبيق المتوقع لE دالتون على شكل مجمعات tetramer قليل وحدات. لذلك ، فإنه يتضح من قياسات ثنائية الفوتون الطيفي أن مجمع قليل وحدات Ste2p يفترض شكل tetramer a شكل المعين في الجسم الحي 19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية تحديد حجم والمعلومات حول الهيكلية بروتين قليل وحدات معقدة في الجسم الحي. في حين تم الحصول على البيانات المقدمة من الغشاء مستقبلات محددة (أي Ste2p) التي أعرب عنها في خلايا الخميرة ، فإن هذه الطريقة تشمل كل ما في ويمكن تطبيقه على أي نوع من البروتين وأعربت في أي نوع من الخلايا ، والشرط الوحيد هو أن البروتينات وموسومة بعلامات الفلوريسنت المناسبة. والتعديلات في المستقبل لهذا البروتوكول تتضمن تعزيز أداة لتحقيق سرعات أعلى للمسح الضوئي في محاولة لرصد الوقت تعتمد على حجم قليل وحدات من البروتين والتغيرات الهيكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من مبادرة بحوث النمو يسكونس ميلووكي ، ويسكونسن لمعهد الطب الحيوي والتكنولوجيا والصحة ، ومؤسسة برادلي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polyethlyene Glycol 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Potassium Chloride | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucine | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidine | Fisher Scientific | BP382 | |
| Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Spectrally resolved two photon microscope |
References
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A. Integrated Molecular and Cellular Biophysics. , Springer. London. (2008).
- Selvin, P. R. The renaissance of fluorescence resonance energy transfer. Nat Struct Biol. 7, 730-734 (2000).
- Raicu, V., Jansma, D. B., Miller, R. J., Friesen, J. D. Protein interaction quantified in vivo by spectrally resolved fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 385, 265-277 (2005).
- Maurel, D. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nat Methods. 5, 561-567 (2008).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 151-156 (2008).
- Demarco, I. A., Periasamy, A., Booker, C. F., Day, R. N. Monitoring dynamic protein interactions with photoquenching FRET. Nat Methods. 3, 519-524 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr Opin Biotechnol. 16, 19-27 (2005).
- Wlodarczyk, J. Analysis of FRET signals in the presence of free donors and acceptors. Biophys J. 94, 986-1000 (2008).
- Förster, T. Experimentelle und theoretische Untersuchung des zwischenmolekularen bergangs von Elektronenanregungsenergie. Z. Naturforsch. A: Astrophys Phys Phys Chem. 4, 321-321 (1949).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-2124 (2006).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).
- Nagai, T. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
- Raicu, V. Efficiency of Resonance Energy Transfer in Homo-Oloigomeric Complexes of Proteins. J Biol Phys. 33, 109-127 (2007).
- Raicu, V., Fung, R., Melnichuk, M., Chaturvedi, A. Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences VII, 2007 Jan 1, San Jose, CA, USA , , (2007).
- Raicu, V. Determination of supramolecular structure and spatial distribution of protein complexes in living cells. Nat Photonics. 3, 107-113 (2009).
- Rath, S., Sullivan, A. P., Stoneman, M. R., Raicu, V. Microspectroscopic method for determination of size and distribution of protein complexes in vivo. Proc of SPIE. 7378, 737829-737829 (2009).
- Kurjan, J.
- Overton, M. C., Chinault, S. L., Blumer, K. J. Oligomerization of G-protein-coupled receptors: lessons from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 4, 1963-1970 (2005).
