In vivo Kvantifiering av G Tillsammans Interaktioner protein receptor med spektralt korrigerats inom två-photon Mikroskopi

Summary

Genom att använda ett spektralt löst två-photon-systemet mikroskopi avbildning, är pixelnivå kartor över Förster Resonance Energy Transfer (FRET) effektivitetsvinster för celler som uttrycker membranreceptorer hypoteser för att bilda homo-oligomeric komplex. Från FRET effektivitet kartor, kan vi uppskatta stökiometriska information om oligomer komplex under utredning.

Abstract

Studien av protein interaktioner i levande celler är ett viktigt forskningsområde eftersom informationen samlats både fördelar industriella applikationer samt ökar grundläggande grundläggande biologisk kunskap. Förster (fluorescens) Resonance Energy Transfer (FRET) mellan en givare molekyl i ett elektroniskt exciterat tillstånd och en närliggande acceptor molekyl har ofta använts för studier av protein-protein interaktioner i levande celler. De proteiner av intresse är märkta med två olika typer av fluorescerande prober och uttryckt i biologiska celler. Den fluorescerande prober är då glada, oftast med hjälp av laserljus och spektrala egenskaper fluorescens utsläpp som härrör från den fluorescerande prober samlas in och analyseras. Information om graden av proteininteraktioner är inbäddad i den spektrala utsläppsdata. Normalt måste cellen ska skannas flera gånger för att samla tillräckligt spektrala informationen för att korrekt kvantifiera omfattningen av proteininteraktioner för varje region av intresse i cellen. Däremot kan den molekylära sammansättningen av dessa områden förändras under loppet av förvärvsprocessen, vilket begränsar den rumsliga bestämning av kvantitativa värden uppenbara FRET effektivitetsvinster ett genomsnitt över hela celler. Med hjälp av ett spektralt löst två-photon mikroskop, kan vi få en full uppsättning av spektralt lösas bilder efter bara en komplett excitation skanning av provet av intresse. Från denna pixelnivå spektrala data, en karta över FRET effektivitet i hela cellen beräknas. Genom att tillämpa en enkel teori om FRET i oligomeric komplex till experimentellt erhållna fördelningen av FRET effektivitet i hela cellen, avslöjar en enda spektralt lösas skanna stökiometriska och strukturell information om oligomer komplex under utredning. Här beskriver vi proceduren att förbereda biologiska celler (jästsvampen Saccharomyces cerevisiae) som uttrycker membran receptorer (sterila 2 α-faktor-receptorer) märkta med två olika typer av fluorescerande prober. Dessutom visar vi kritiska faktorer som samlar fluorescens data med hjälp av spektral löst två-photon-systemet mikroskopi avbildning. Användningen av detta protokoll kan utvidgas för att studera någon typ av protein som kan uttryckas i en levande cell med en fluorescerande markör fäst vid den.

Protocol

1. Plasmid konstruktion

De proteiner av intresse är smält till ett av två olika fluorescerande etiketter, som beskrivs härnäst. Den fluorescerande etiketter inte bara ge information om var de proteiner i cellen, men även kvantitativ information om homo-oligomerisering av proteinet ^1. Tekniken av fluorescens resonans energi överföring (FRET) ^2-4 används för att samla information om proteininteraktioner ^5-10. FRET utnyttjar principen att en överföring av energi kan ske från ett optiskt upphetsad molekyl (vanligen kallad donator, D) till en unexcited molekyl (vanligen kallas acceptor, A) via dipol-dipol interaktioner ^11, om de två molekylerna kommer i närheten av varandra. Vid utformningen av plasmider kodning av fusionsproteiner bör två viktiga funktioner ha i åtanke, enligt följande.

1. Välja en kompatibel par fluorescerande taggar är av yttersta vikt i FRET studier. Helst ska den fluorescerande taggen kombinationen uppfylla två kriterier: en avsevärd överlappning i våglängder mellan utsläpp spektrum av givaren taggen och excitation spektrum av acceptanten taggen, och en stor separation mellan centrum våglängd laserpuls spektrum och excitation spektrum av acceptor (dvs stora Stokes skift). Två varianter av det grönt fluorescerande proteinet ^12, är ¹³ särskilt väl lämpad att uppfylla dessa kriterier: _GFP-2 som givare ¹⁴ och den gula fluorescerande protein (YFP) ^12, eller en variant av det som kallas Venus ¹⁵ som acceptor. Cerulean ¹⁶ skulle också kunna användas som givare, men med något lägre resultat.
2. I kvantitativa FRET avbildning är det bäst om bara en donator i en molekylär komplex är glada åt gången (i genomsnitt), så att ingen konkurrens uppstår mellan givare för att överföra energi till samma acceptanten i komplex som innehåller mer än en givare och en acceptor . Detta leder till förenklingar i teori och dataanalys processen ^17. På grund av detta är signalnivån oftast låg. För att kompensera för detta bör uttrycket nivån på proteiner av intresse vara relativt hög. Höga uttryck nivå uppnås med hjälp av en hög kopia plasmid att bära det protein genen in i cellen.

2. Jäst omvandling

Det är en fördel att maximera andelen av cellpopulationen uttrycker proteinet konstruktioner av intresse. För detta ändamål, omvandlar vi en auxotrophic stam av jästceller (Saccharomyces cerevisiae), inte kan producera tryptofan eller uracil, med två olika plasmider, en som innehåller markör tryptofan och en markören uracil. Den plasmider innehåller också gener som bär instruktioner för cellen att uttrycka proteinet av intresse märkta med en av de två fluorescerande prober. Den förvandlade celler odlas på fast medium tallrikar som också saknar tryptofan och uracil. Minst tre typer av celler bör omvandlas: celler som uttrycker proteiner av intresse taggade med båda typerna av fluorescerande prober, celler som uttrycker bara proteiner taggade med givaren fluorescerande prober och celler som uttrycker bara proteiner taggade med acceptanten fluorescerande prober.

1. Förbered fast medium plattor (1,7 g / L av oädla jäst kväve w / o aminosyror, 1,6 g / L jäst syntetiskt avhopp medelstora w / o uracil och tryptofan, 2% [w / v] glukos, 2% [w / v] agar) för att användas som grogrund för att förvandlas cellerna minst en dag före celltransformationstest. Den fast medium plattor kan användas i upp till två månader efter beredning om de förblir fria från föroreningar.
2. För varje plasmid par att förvandlas, tillsätt 10 ml YPD (10 g / L Bacto jästextrakt, 20 g / L Bacto Peptone, och 2% [w / v] glukos) till en Erlenmeyerkolv. Incoluate den YPD med en koloni av auxotrophic stam av jästceller som skall ombildas.
3. Placera Erlenmeyerkolven innehåller jästkultur i ett laboratorium shaker, vilket ger en omloppstid virvlande insatser på prov, och inkubera över natten vid 30 ° C. Följande morgon börja övervaka tillväxten av cellodling genom att regelbundet ta bort en liten mängd kultur och provning av dess optiska densitet (OD). Tillväxten av cellodling skall vara i mitten av logaritmiska fas, dvs en OD 0,5-1,0, vid tidpunkten för omvandlingen.
4. Deposition 5 mikroliter av båda typerna av plasmider i en steril mikrocentrifugrör för varje plasmid par som skall ombildas.
5. För varje plasmid par att omvandlas, tillsätt 5 mikroliter av lax spermiens DNA (5 mg / ml) till en tom mikrocentrifugrör. Sänk den nedre halvan av mikrocentrifugrör innehåller DNA lax spermier i kokande vatten i fem minuter. För att förhindra att locket på mikrocentrifugrör från poppar opsv, bara sänk den nedre halvan av mikrocentrifugrör i vattnet. Efter att från det kokande vattnet, placera mikrocentrifugrör innehåller DNA lax spermier i is i minst två minuter.
6. Tillsätt 5 mikroliter av lax spermiens DNA till varje mikrocentrifugrör innehåller plasmider.
7. Mät OD av den växande jästkultur att bekräfta att det har nått mitten av logaritmiska fas (dvs. OD läsa mellan 0,5 och 1,0).
8. Centrifugera jästen upphängning på 1000xg i två minuter.
9. Häll av supernatanten och återsuspendera jästen pelleten i steriliserat avjoniserat vatten med en vortexblandare.
10. Centrifugera suspensionen återigen 1000xg i två minuter.
11. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i en lösning av 0,1 miljoner LiOAc i TE (1,02 g LiAc, 10 ml 1M Tris vid pH 7,4 och 10 ml 0,1 M EDTA vid pH 8,0). Volymen 0,1 miljoner LiOAc i TE bör vara lika med 1 / ^{100: e} av den ursprungliga jästkultur volym i YPD.
12. Fördela 100 mikroliter av celler vardera till mikrocentrifugrör innehåller plasmider. Flick varje rör försiktigt för att blanda celler med plasmider.
13. Tillsätt 400 ìl av 44% [w / v] polyetylenglykol (PEG ₄₀₀₀₎ lösning till varje mikrocentrifugrör.
14. Blanda försiktigt PEG ₄₀₀₀ med celler och plasmider. För att undvika att bryta de celler du inte använda en vortexblandare på denna punkt. Att blanda försiktigt, håll mikrocentrifug locket och botten av mikrocentrifugrör mellan pekfingret och tummen, sakta vända på röret, och sedan långsamt föra röret tillbaka till upprätt läge. Rotera röret 90 ° runt sin cylindriska axel och sakta vända igen. Upprepa denna process ett antal gånger, så att cellerna glida ner hela ytan på väggarna i mikrocentrifugrör.
15. Placera mikrocentrifugrör i en 30 ° inkubator i 45 minuter.
16. Efter 45 minuters inkubation, ta bort celler från inkubatorn och upprepa den milda blandning som beskrivs i 14.
17. Placera mikrocentrifugrör i 42 ° vattenbad och inkubera i 15 minuter. Återigen, bara sänk den nedre halvan av mikrocentrifugrör i vattnet.
18. Efter 42 ° inkubationen, tillsätt 1 ml sterilt avjoniserat vatten till mikrocentrifugrör.
19. Centrifugera rören i en bordsskiva mikrofugrör i 5 sekunder. Avlägsna supernatanten från rören med hjälp av en micropipetter.
20. Tillsätt 100 mikroliter av steriliserade avjoniserat vatten till varje mikrocentrifugrör och blanda steriliserade avjoniserat vatten med cellerna med hjälp av inversion processen.
21. Tillsätt innehållet i en enskild mikrocentrifugrör till ett odlingsmedium skylt som väljer för den särskilda plasmider adderas till mikrocentrifugrör. Lägg 4-6 steriliserade glaspärlor (1 mm diameter). Skaka plattan innehåller droppe omvandlas jästceller och glaspärlor för att cellerna är spridda över ytan av agar odlingsmedium. Upprepa processen för varje uppsättning förvandlade celler.
22. Placera plattorna i en 30 ° inkubator för 3 - 5 dagar. Efter 3-5 dagar kommer flera jäst kolonier på 1-3 mm i diameter vara synliga på ytan av tillväxten medium. Vid denna tid, cellerna är redo att avbildas i spektralt löst två-photon mikroskop.

3. Kalibrera spektralt löst två-photon mikroskop

De spektralt löst två-photon mikroskop som används i dessa studier har beskrivits i detalj någon annanstans ^{18, 19.} Kortfattat är en hög effekt solid-state kontinuerlig våg-laser används för att pumpa en modlåsta Ti: Sapphire laser som genererar femtosecond pulser av våglängder, från ~ 750 till 830 nm. Laserstrålen fokuseras av en hög NA mikroskop mål att en diffraktion-begränsad plats på provet. Excitation förekommer endast i en nära centrala regionen av balken på grund av den låga sannolikheten för två-photon excitation. Ett par av ortogonala datorstyrda skanning speglar används för att översätta fokus på balken i planet av provet i två olika riktningar (kallas x-och y-riktningar hela protokollet). Back-förökningsmaterial fluorescens utsläpp från en belyst Voxel av provet sprids i spektrala komponenter genom en överföring galler placeras i vägen för utsläpp innan ljuset faller händelsen på pixlar i en EM-CCD-array. Således är det fullt spektrala profilen av någon fluorescerande molekyl / molekyler inom den centrala regionen av balken erhålls längs en ​​dimension (y) av CCD-array. Med hjälp av förflyttning av en av de två skanning speglar, kan placeringen av laser fokus ska skannas i provet längs en ​​linje vinkelrät mot y-led. Genom att hålla slutaren av CCD-kameran öppen under denna enda rad skanna, spektrala profiler av fluorescerande molekyler residing längs hela raden av sökningen samlas i ett enda svep av laserstrålen över provet. Ackumulerande flera line skanningar av detta slag på olika y ställen i cellen ger den spektrala profilerna för ett stort antal fluorescerande komplex som bor i provet. Bilderna från linjen genomsökningar rekonstrueras för att ge flera xy fluorescensintensitet rumsliga kartor över provet vid olika våglängder ^{18, 19.} För korrekt att rekonstruera och beräkna den verkliga våglängd motsvarar xy fluorescerande intensitet rumsliga kartor måste linjen scanning protokollet kalibreras med hjälp ett prov med en väldefinierad fluorescens emissionsspektrum.

1. De spektralt löst två-photon mikroskop ackumuleras spektral information om oligomer komplex i avbildade cellen genom att skanna i fokus för excitation balk över urvalet av intresse på ett antal platser.
2. Ett par av ortogonala scanning speglar används för att översätta fokus för laserstrålen över provet i två olika riktningar. Förflyttning av scanning speglar är datorstyrd och synkroniseras med utvinning av fluorescensintensiteten data från CCD-kameran.
3. Från linjen skanningar kan fluorescerande intensitet rumsliga kartor som motsvarar en viss våglängd av ljus rekonstrueras. För att exakt rekonstruera xy fluorescerande intensitet rumsliga kartor och beräkna den faktiska våglängd som motsvarar varje av dessa kartor måste linjen scanning protokollet kalibreras med hjälp fluorescein lösning.
4. För att börja kalibreringen, centrera excitation spektrum vid en våglängd på 800 nm, vilket är 2X den maximala excitationsvåglängden av givaren taggen, GFP _2. För att centrera excitation spektrum, översätter prismat ligger inom laser hålrummet att ändra spridning grupphastighet. Prismat är monterad på en datorstyrd linjär motoriserade skede.
5. Med hjälp av dataprogrammet kameran är ansluten till, skicka ett kommando till CCD-chip för att sänka temperaturen på CCD-chipet till sin lägsta möjliga temperatur för att minska mörkt brus.
6. Pipettera 10 mikroliter av fluorescein lösningen på ett objektglas. Täck med ett täckglas så att ett tunt skikt av provet är jämnt spridda i området mellan täckglas och objektglas.
7. Placera en liten droppe immersionsolja på ytan av täckglas
8. Nu fäster objektglas till XYZ översättning scenen och översätter bilden / stadium i den optiska axeln riktning genom att manuellt justera den linjära ställdon som styr scenen rörelse i den optiska axeln riktning. Översätt bilden / scenen tills mikroskop målet kommer i kontakt med droppe immersionsolja.
9. Med hjälp av datorprogram som styr kameran, byta till ett videoläge för datainsamling, så det utsända ljuset träffar CCD-array visas på datorskärmen i realtid. Sakta, justera mikrometer kontrollera översättningen steg i den optiska axeln riktning för att få provet i fokus platsen av laserstrålen.
10. När fluorescein provet är i fokus, kommer utsläppen att visas som en skarp linje på CCD-array. Hämta avläsning av pixeln intensiteter från CCD-array till datorn med hjälp av datorprogram som styr kameran. Mät pixel intensiteten som funktion av position på CCD-array genom att öppna den nedladdade matris av intensitet värden i bild J och dra en linje genom fluorescerande regionen. Använda bilden J kommandot Analyze → Plot profil för att skapa en tomt som illustrerar emissionsspektrum av fluoresceinisothiocyanat provet.
11. Justera inkrementella parametern av spegeln som styr flödet av lasern fokus i y-riktningen, så att intilliggande y befattningar inom provresultat i rörelsen på toppen av den fluorescens spektra av exakt en pixel längs spektrala dimensionen på CCD matris. Övervaka detta genom att ladda ner fluorescein spektra bilden intensitet värde för två olika y positioner i urvalet, öppna intensiteten bilder med Image J, och att hitta maximal pixel positionen för varje fluorescens spektra med hjälp av markören Image J.
12. Lämnar slutaren av CCD öppna, skanna lasern sträcker sig över hela provet i x-riktningen. Det ljus som avges från varje Voxel längs linjen av skanningen skulle falla infaller mot CCD-array.
13. Lagra data från CCD-array erhållas för denna linje skanna och avmarkera pixlar på CCD-array.
14. Flytta positionen för lasern fokus i y-riktning genom att det belopp som fastställts i steg 11 i detta avsnitt.
15. Scan laserstrålen i x-riktning över provet, återigen lämnar öppna slutaren av CCD-array och lagrar data.
16. Upprepa denna linje scanning proceduren tills en fysisk yta ~ 50% större dimensioner än en enda biologisk cell har upplyst av laserljus.
17. Förhållandet mellan radnumret för en viss linje skanna bilden och våglängd bör användas för att rekonstruera bilderna för att få flera xy fluorescerande intensitet rumslig kartor på olika våglängder. För att få xy fluorescens utsläpp bilden för en viss våglängd (λ _j), hitta radnumret på bilden från den första raden skannar som motsvarar denna våglängd. Sedan den intilliggande raden i den efterföljande raden skanna bilden motsvarar nästa rad i fluorescens utsläpp bilden för just den våglängd. Stapla alla bilder rader som motsvarar denna våglängd för att få xy fluorescerande intensitet rumsliga kartor av provet vid denna våglängd. Upprepa denna procedur för alla andra att tillgå våglängder.
18. För att beräkna våglängd i samband med varje XY fluorescerande intensitet rumsliga karta, bestämma bakgrundskorrigerade normaliserade fluorescensintensitet varje rekonstruerade bild som en funktion av bildindex (j). Förhållandet mellan kamera pixel position i den spektrala dimensionen och våglängden på den emitterade fotonen är ungefär linjär, varför förhållandet mellan det rekonstruerade xy fluorescerande intensitet rumsliga kartbilder och motsvarande våglängd är också linjärt och beräknas enligt följande:
    där värdet av m representeras av:
    I ovanstående formalism representerar symbolen λ _j våglängden av det ^{j: e} rekonstruerade bilden. Värdena för λ _max och λ _½ utvinns från utsläpp spektrum av fluoresceinisothiocyanat provet och motsvarar de våglängder där fluorescensintensiteten av fluorescerande provet är högst och hälften av maximal, respektive. Bilden index j _max och j _½ motsvarar de rekonstruerade bilderna som har den högsta fluorescensintensitet och hälften av den maximala, respektive.

4. Samla in uppgifter om biologiska prover av intresse

1. För att samla in uppgifter om dina prover, först ta bort från inkubatorn plattorna med förvandlade jäst kolonier. Det bör finnas minst tre typer av celler omvandlas full bredd halv-maximum (FWHM):
   1. celler som uttrycker proteiner av intresse taggade med båda typerna av fluorescerande prober
   2. celler som uttrycker bara proteiner taggade med givaren fluorescerande prober, och
   3. celler som uttrycker bara proteiner taggade med acceptanten fluorescerande prober.
2. Tillsätt 100 mikroliter av 100 mm KCl till ett mikrocentrifugrör. Använd en mikropipett spets, skrapa 3-5 jäst kolonier bort av plattan på celler som uttrycker proteiner taggade med både givare och acceptor fluorescerande prober, och inokulera 100 mm KCl med dessa celler.
3. Ta bort 10 mikroliter av cellsuspensionen och fördela den på ett nytt objektglas, täcka droppen med ett täckglas, och placera en droppe olja på ytan av täckglas.
4. Manuellt stänga slutaren i vägen för laserstrålen att blockera laserljus från att nå mikroskop målet.
5. Fäst objektglas till XYZ översättning scenen och översätter bilden / stadium i den optiska axeln riktningen tills mikroskop målet kommer i kontakt med droppe immersionsolja.
6. Det stora fältet bild av provet kommer att bli allvarligt suddig på grund av förekomsten av överföringen galler i utsläpp väg. Därför placera ett bandpassfilter med en liten FWHM i strålgången före sändning gallret. Slå på brett fält ljus belysning, och gå till kameran videoläge insamling av uppgifter. Sakta översätta översättning steg i den optiska axeln riktning medan du tittar på bilden av cellerna på kamerans skärm tills cellerna är i fokus
7. Översätt scenen i antingen x eller y-riktning för att få en enda cell till platsen för laserstrålen fokus.
8. Stäng av det breda fältet Källa belysning. Ta bort bandpassfilter från utsläpp vägen.
9. Låsa upp laserstrålen för en kort tid (<1 sekund), samtidigt som du tittar på signalen som inkom till CCD-array. Om en fluorescerande signal upptäcks på CCD-array under den tid laserstrålen som infaller mot cellen, sedan göra en fullständig fluorescens datainsamling skanning av denna cell. Det är viktigt att använda samma inläsningsparametrarna, särskilt antal linjer och y steg, som bestäms i Kalifornienlibration förfarande visat tidigare.
10. Upprepa cellen plats och fluorescens datainsamling process för ett stort antal celler som uttrycker proteiner knutna till både givare taggar och taggar acceptor.
11. Efter att ackumulera fluorescens bilder av celler som uttrycker proteiner taggade med båda receptorer, upprepa hela processen för både celler som uttrycker bara proteiner taggade med givaren fluorescerande prober och celler som uttrycker bara proteiner taggade med acceptanten fluorescerande prober.
12. Med det förfarande som beskrivs i avsnitt 3, rekonstruera alla scanningar för att få spektralt lösas xy fluorescerande intensitet rumsliga kartor för varje uppsättning data.

5. Bildanalys

Varje pixel i xy fluorescerande intensitet rumsliga kartor, som är resultatet av en scan av ett fluorescerande biologisk cell innehåller hela spektral profil molekylära komplex som bor i excitation Voxel motsvarar just den pixel. Om proteiner av intresse är att interagera med varandra, kommer detta spektrala profilen innehåller en blandning av signaler från både givaren och acceptor fluorescerande prober. För att avgöra vilken typ av växelverkan mellan proteiner av intresse, måste de spektrala profiler från ett stort antal av dessa proteinkomplex i en cell ska provtas och den skenbara FRET effektiviteten (E _app), definierad som andelen av exciterade tillstånd av givaren fluorescerande prob som blir över till acceptanten fluorescerande sond via FRET, för varje pixel måste beräknas.

1. Bestäm bakgrunden-korrigerad fluorescensintensitet för envar av de rekonstruerade bilderna som beskrivs i avsnitt 4 för celler som uttrycker proteiner taggade med bara givaren fluorescerande prober och normalisera att det maximala värdet. Eftersom varje av dessa rekonstruerade bilder motsvarar en separat våglängd (λ _j) denna samling av normaliserade fluorescensintensiteten värden motsvarar den uppmätta spektrum av givaren sonder, ^D i (λ _j).
2. Upprepa steg 1 för celler som uttrycker proteiner taggade med bara acceptanten fluorescerande taggar för att få den uppmätta spektrum av acceptanten sonder, ^Ia (λ _j). Eftersom acceptanten givaren är sådan att det är sällan direkt glada med hjälp av laser källa, kommer signalen från acceptanten bara prover vara lågt och kanske i samma storleksordning som de celler inneboende autofluorescens signal. Därför kan den uppmätta acceptanten fluorescens spektrum beräknas på detta sätt måste korrigeras för att ta bort bidraget från autofluorescens innan du fortsätter.
3. Använda normaliserade spektrum som erhålls i steg 1 och steg 2, spektralt bryts varje pixel i fluorescens utsläpp spektrum av celler som uttrycker både proteiner taggade med givare fluorescerande prober och proteiner taggade med acceptanten fluorescerande prober använder förhållande I (λ _j) = k ^DA Jag ^D (λ _j) + k ^{AD Ia} (λ _j) där jag (λ _j) representerar varje enskild pixel mäts fluorescens spektrum. Värdena på k ^DA och k ^AD är proportionella mot fluorescens utsläpp från givare i närvaro av som accepterar och från acceptorer i närvaro av givare, respektive ^5.
4. Beräkna den skenbara FRET effektivitet som kartlägger samspelet mellan proteiner i cellen för varje pixel med hjälp av formeln, . Här Q ^D och F ^A är den kvantmekaniska avkastningen av givare fluorescerande probe och acceptor fluorescerande probe respektive och w ^D och W ^A är integraler av normaliserade donator och acceptor spektrum, respektive ^{19, 20.}
5. Slutligen skapar ett histogram med hjälp av de beräknade värdena på E _app för varje pixel, där antalet gånger ett visst E _app värde förekommer är plottas mot att särskilt värde av E _ca.

6. Histogramanalys

För att utvinna kvantitativ information från E _app histogram, är anpassade till den enskilda histogram teoretiskt med en summa av gaussisk funktioner, enligt följande formel:
,
där A _i är amplitud, σ _jag standardavvikelsen, och E _0i den mest troliga FRET effektivitet jag ^ed Gaussisk funktion. Olika oligomer storleks och konfigurationer leda till olika nummer (n) av E _0i och olika samband mellan dem ^{1, 17.} Till exempel, för en romb-formad tetramer är fem toppar förutsägas, som ges av uttryck som anges i tabell 1.

Tabell 1. Förhållandet mellan de fem Gaussian topp centrum värderingar och parvisa FRET effektivitet förutspås för en romb formad tetramer.

Det betyder bara en E _0i värdet behöver justeras i processen av data montering - den motsvarar E _p - medan de andra fyra beräknas från värdet av E _p.

1. Antag en oligomerer modell och identifiera antalet Gaussians att användas i passande E _app histogram ^1. Montera histogrammet genom att justera E _P, A _i, och σ _jag. Observera att den relativa disposition av histogrammen fastställs av modellen. Minimera chi kvadraten på plats eller någon annan godhet-of-fit funktionella.
2. Antag en annan sannolikt oligomerer modell och upprepar steg nummer 1.
3. Välj den modell som bäst passar data för antalet använda parametrar. Som kan kräva hjälp av ett statistiskt test (såsom chi kvadrat per antal frihetsgrader).

Representativa resultat

Illustreras i figur 1 är den resulterande k ^DA, k ^AD och E _app rumsliga kartor beräknad från spektralt löst två-photon mikroskopi mätningar utförts på en jäst cell som manifesterar den sterila 2 α-faktor (Ste2p) ^{21, 22.}

Figur 1. Jäst cell som manifesterar den sterila 2 α-factor receptor. Två-dimensionella kartor över givare (k ^DA) och acceptor (k ^AD) signaler som erhålls från spektrala deconvolution som tillämpas på varje pixel läge tagit bilder med hjälp av spektral löst två-photon mikroskop av en jäst cell som manifesterar den sterila 2 α-factor receptor (Ste2p). Fluorescens intensiteter tilldelas falska färger enligt sina värderingar och skalan visas som en infälld. En tvådimensionell karta över den uppenbara bandet effektivitet beräknades med hjälp av k ^DA och k ^AD bilder.

Ett histogram tomten har utarbetats med hjälp av värdena ur E _app kartan över cellen visas i figur 1. På bilden i figur 2 är försedd histogrammet tomten som motsvarar de uppmätta värdena E _app (cirklar) i cellen avbildas i figur 1. Den röda heldragna linjen representerar den bäst passar till det uppmätta data med hjälp av summan av de enskilda gaussisk funktion (grön heldragna linjer).

Figur 2. Histogram tomt på E _app värden för en jäst cell som manifesterar den sterila 2 α-factor receptor. Histogrammet tomten som motsvarar de uppmätta värdena (världen) E _app för cellen avbildas i figur 1 visas. Individuella Gaussisk funktioner (fast gröna linjer) summeras för att simulera (fast röda linjen) de uppmätta värdena. Gaussisk funktion parametrar är: E ₀₁ = 16,7, A ₁ = 118,9; σ ₁ = 3,2, E ₀₂ = 25,1, A ₂ = 100,0; σ ₂ = 4,6, E ₀₃ = 32,6; A ₃ = ​​202,6; σ ₃ = 4,6; E ₀₄ = 40,1, A ₄ = 92,6; σ ₄ = 3,7, E ₀₅ = 50,1; A ₅ = 16,0; σ ₅ = 7,9.

Relationerna mellan Gaussisk medel som krävs för att passa de data som presenteras i histogrammet i figur 2 ges i tabell 1. Antalet och korrelationen mellan Gaussisk funktion motsvarar antalet och samband mellan förväntade värden E _app för romb formad komplex tetramer oligomer. Därför är det framgår av de spektralt löst två-photon mätningar att Ste2p oligomer komplexa antar formen av en romb formad tetramer in vivo ^19.

Discussion

I denna presentation illustrerade vi hur man bestämma storlek och strukturell information om ett protein oligomerer komplex in vivo. Medan de presenterade data från en särskild membran receptor (dvs Ste2p) uttryckt i jästceller, är metoden allomfattande i det att den kan appliceras på alla typer av proteiner som uttrycks i någon typ av celler, den enda bestämmelse är att de proteiner är taggade med lämplig fluorescerande markörer. Framtida ändringar av detta protokoll kommer att innebära ökad instrument för att uppnå högre scanningshastigheter i ett försök att övervaka tidsberoende storlek protein oligomerer och förändringar struktur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope