Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

Summary

En employant une résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique, au niveau des pixels des cartes de transfert de Förster Resonance Energy (FRET) efficacités sont obtenues pour des cellules exprimant des récepteurs membranaires hypothèse de former des homo-oligomères complexes. Depuis le FRET cartes d'efficacité, nous sommes en mesure d'estimer l'information sur le complexe stoechiométrique oligomère à l'étude.

Abstract

L'étude des interactions entre protéines dans les cellules vivantes est un domaine de recherche important parce que les informations accumulées à la fois les applications retombées industrielles ainsi que des augmentations de base de connaissances biologiques fondamentaux. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) entre une molécule bailleurs de fonds dans un état électroniquement excité et une molécule d'accepteur à proximité a été fréquemment utilisée pour des études d'interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. Les protéines d'intérêt sont étiquetés avec deux différents types de sondes fluorescentes et exprimée dans les cellules biologiques. Les sondes fluorescentes sont alors excités, typiquement en utilisant la lumière laser, et les propriétés spectrales de l'émission de fluorescence émanant des sondes fluorescentes sont recueillies et analysées. L'information concernant le degré des interactions protéine est ancrée dans les données d'émission spectrale. Typiquement, la cellule doit être balayé un certain nombre de fois afin d'accumuler suffisamment d'informations spectrales de quantifier avec précision l'étendue des interactions protéine pour chaque région d'intérêt dans la cellule. Cependant, la composition moléculaire de ces régions peuvent changer au cours du processus d'acquisition, de limiter la détermination spatiale des valeurs quantitatives de l'efficacité apparente de FRET à une moyenne sur des cellules entières. Par le biais d'une résolution spectrale de microscope à deux photons, nous sommes en mesure d'obtenir un ensemble complet d'images spectralement résolue après un seul balayage d'excitation complète de l'échantillon d'intérêt. Partir de ces données au niveau des pixels spectrale, une carte de l'efficacité de FRET dans toute la cellule est calculée. En appliquant une simple théorie du FRET dans des complexes oligomériques à la distribution obtenues expérimentalement l'efficacité de FRET à travers la cellule, un seul balayage résolution spectrale révèle l'information stoechiométrique et structurelles sur le complexe oligomère à l'étude. Nous décrivons ici la procédure de préparation des cellules biologiques (la levure Saccharomyces cerevisiae) exprimant des récepteurs membranaires (stérile 2 α-facteur de récepteurs) taggés avec deux différents types de sondes fluorescentes. Par ailleurs, nous illustrons facteurs critiques impliqués dans la collecte de données de fluorescence à l'aide de la résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique. L'utilisation de ce protocole peut être étendu pour étudier tout type de protéine qui peut être exprimé dans une cellule vivante avec un marqueur fluorescent qui s'y rattachent.

Protocol

1. Conception de plasmides

Les protéines d'intérêt sont fusionnées à l'un des deux marqueurs fluorescents différents, comme décrit plus loin. Les marqueurs fluorescents non seulement fournir des informations sur la localisation des protéines dans la cellule, mais aussi des informations quantitatives concernant l'homo-oligomérisation de la protéine ^1. La technique de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) ^2-4 est utilisé pour accumuler les informations sur les interactions protéine ^5-10. FRET utilise le principe selon lequel un transfert d'énergie peut se produire à partir d'une molécule optiquement excité (généralement appelé le donateur, D) à une molécule non excité (généralement appelé comme accepteur, A) par interactions dipôle-dipôle ^11, si les deux molécules viennent à proximité les uns des autres. En concevant les plasmides codant pour les protéines de fusion, deux fonctionnalités clés devraient garder à l'esprit, comme suit.

1. Sélection d'une paire compatible de marqueurs fluorescents est de la plus haute importance dans les études de FRET. Idéalement, la combinaison marqueur fluorescent doit répondre à deux critères: un chevauchement appréciable dans les longueurs d'onde entre le spectre d'émission de la balise donateur et le spectre d'excitation de l'accepteur de la balise, et une grande séparation entre la longueur d'onde centrale du spectre d'impulsion laser et le spectre d'excitation de l'accepteur (ie, les grands décalage de Stokes). Deux variantes de la protéine fluorescente verte ^{12, 13} sont particulièrement bien adaptés pour répondre à ces critères: la GFP ₂ comme un donneur ¹⁴ et la protéine fluorescente jaune (YFP) ¹² ou une variante de celui-ci s'appelle Venus ¹⁵ comme accepteur. Cerulean ¹⁶ pourrait également être utilisé en tant que donateur, mais avec des résultats un peu plus modeste.
2. Dans l'imagerie quantitative FRET, il est préférable si un seul donneur dans un complexe moléculaire est excité à la fois (en moyenne), de sorte que pas de concurrence se produit entre les donateurs pour le transfert de l'énergie à l'accepteur même dans des complexes qui contiennent plus d'un donateur et un accepteur . Cela conduit à des simplifications dans la théorie et ¹⁷ processus d'analyse de données. A cause de cela, le niveau du signal est généralement faible. Pour compenser cela, le niveau d'expression des protéines d'intérêt devrait être relativement élevé. Les niveaux d'expression élevés sont obtenus en utilisant une copie haute plasmidique à porter le gène de la protéine dans la cellule.

2. Transformation de la levure

Il est avantageux pour maximiser le pourcentage de la population de cellules exprimant la protéine d'intérêt des constructions. Pour ce faire, nous transformons une souche auxotrophe des cellules de levure (Saccharomyces cerevisiae), incapable de produire le tryptophane ou l'uracile, avec deux plasmides différents, l'un contenant du tryptophane, marqueur de sélection et un marqueur de l'uracile. Les plasmides contiennent aussi des gènes qui comportent des instructions pour la cellule à exprimer la protéine d'intérêt marqués avec l'une des deux sondes fluorescentes. Les cellules transformées sont cultivées sur des plaques support solide qui manque aussi du tryptophane et de l'uracile. Au moins trois types de cellules doit être transformé: des cellules exprimant les protéines d'intérêt marqués avec les deux types de sondes fluorescentes, les cellules exprimant les protéines ne taggés avec les sondes fluorescent donneur et les cellules exprimant les protéines ne taggés avec les sondes fluorescent accepteur.

1. Préparer les plaques milieu solide (1,7 g / L d'azote de la levure de base w / o des acides aminés, 1,6 g / L de levures synthétiques abandon moyennes w / o uracile et de tryptophane, 2% [w / v] glucose, 2% [w / v] agar) pour être utilisé comme milieu de croissance pour les cellules transformées au moins un jour avant la transformation cellulaire. Les plaques support solide peut être utilisé pour un maximum de deux mois après la préparation si elles restent libres de tout contaminant.
2. Pour chaque paire de plasmide de se transformer, ajouter 10 mL de YPD (10 g / L extrait de levure Bacto, 20 g / L Bacto peptone et 2% [w / v] glucose) dans un erlenmeyer. Incoluate l'YPD avec une colonie de la souche auxotrophe de cellules de levure à transformer.
3. Placer l'erlenmeyer contenant la culture de la levure dans un shaker de laboratoire, qui fournit une action orbitale tourbillonnant sur les échantillons, et incuber une nuit à 30 ° C. Le lendemain matin, commencer à surveiller la croissance de la culture cellulaire en enlevant périodiquement un petit volume de la culture et les tests de sa densité optique (DO). La croissance de la culture cellulaire devrait être à la mi-logarithmique phase, à savoir une DO de 0,5-1,0, au moment de la transformation.
4. Dépôt 5 pi de deux types de plasmides dans un microtube stérile pour chaque paire de plasmide de se transformer.
5. Pour chaque paire de plasmide de se transformer, ajouter 5 uL d'ADN de sperme de saumon (5 mg / ml) à un microtube vide. Plonger la moitié inférieure du tube à centrifuger contenant l'ADN de sperme de saumon dans l'eau bouillante pendant cinq minutes. Pour éviter que le bouchon du microtube d'op poppingfr, submerger seulement la moitié inférieure de l'microtubes dans l'eau. Après avoir retiré de l'eau bouillante, placer le microtube contenant de l'ADN de sperme de saumon dans la glace pendant au moins deux minutes.
6. Ajouter 5 ul d'ADN de sperme de saumon à chaque microtube contenant des plasmides.
7. Mesurer la DO de la culture de levure de croissance afin de confirmer qu'elle a atteint la mi-logarithmique phase (c.-OD lecture entre 0,5 et 1,0).
8. Centrifuger la suspension de levure à 1000xg pendant deux minutes.
9. Décanter le surnageant et remettre le culot de la levure dans l'eau déminéralisée stérilisés à l'aide d'un vortex.
10. Centrifuger la suspension à nouveau à 1000xg pendant deux minutes.
11. Jeter le surnageant et remettre le culot dans une solution de 0,1 M LiOAc dans TE (1,02 g LiAc, 10 ml de Tris 1M à pH 7,4, et 10 ml EDTA 0,1 M à pH 8,0). Le volume de 0,1 M LiOAc dans TE doit être égale à 1 / 100 ^ème du volume de culture de levures d'origine dans YPD.
12. Distribuer 100 uL de cellules à chacun des microtubes contenant les plasmides. Flick doucement chaque tube afin de mélanger les cellules avec des plasmides.
13. Ajouter 400 ul de 44% [w / v] polyéthylène glycol (PEG ₄₀₀₀₎ solution à chacun des microtubes.
14. Mélanger doucement le PEG ₄₀₀₀ avec les cellules et les plasmides. Afin d'éviter de casser les cellules, ne pas utiliser un mélangeur à vortex à ce point. Pour mélanger délicatement, maintenez le cap microcentrifugeuse et le fond du tube à centrifuger entre l'index et le pouce, lentement inverser le tube, puis porter lentement le tube à la position debout. Tournez le tube à 90 ° sur son axe cylindrique et inverser lentement encore. Répétez ce processus plusieurs fois afin que les cellules glisser vers le bas toute la surface de la paroi du tube à centrifuger.
15. Placer les tubes à centrifuger dans un incubateur à 30 ° pendant 45 minutes.
16. Après 45 minutes d'incubation, éliminer les cellules de l'incubateur et répétez la procédure décrite dans le mélange doux 14.
17. Placer les tubes à centrifuger dans un bain d'eau 42 ° et incuber pendant 15 minutes. Une fois encore, que plonger la moitié inférieure de l'microtubes dans l'eau.
18. Après l'incubation à 42 °, ajouter 1 ml d'eau déminéralisée stérilisée à l'microtubes.
19. Centrifuger les tubes dans une microcentrifugeuse de table pour 5 secondes. Retirer le surnageant des tubes en utilisant un micropipetteur.
20. Ajouter 100 uL d'eau déminéralisée stérilisée à chacun des microtubes et mélanger de l'eau déminéralisée stérilisée avec les cellules en utilisant le processus d'inversion.
21. Ajouter le contenu d'un microtube unique à une plaque de milieu de croissance qui sélectionne pour les plasmides notamment ajouté à cette microtube. Ajouter 4-6 perles de verre stérilisés (1 mm de diamètre). Agiter la plaque contenant les gouttelettes des cellules de levure transformée et perles de verre afin que les cellules sont réparties sur la surface du milieu de croissance agar. Répétez cette procédure pour chaque ensemble de cellules transformées.
22. Placer les plaques dans un incubateur à 30 ° pendant 3 - 5 jours. Après 3-5 jours, des colonies de levures multiple de 1-3 mm de diamètre sera visible sur la surface du milieu de croissance. A cette époque, les cellules sont prêtes à être imagé dans la résolution spectrale de microscope à deux photons.

3. Calibrage de la résolution spectrale de microscope à deux photons

La résolution spectrale à deux photons microscope utilisé dans ces études a été décrite en détail par ailleurs ^{18, 19.} En bref, une grande puissance à semi-conducteurs laser continu est utilisé pour pomper un mode bloqué Ti: Sapphire laser qui génère des impulsions femtosecondes de longueurs d'onde allant de ~ 750 à 830 nm. Le faisceau laser est focalisé par un objectif de microscope NA haute à une tache de diffraction limitée sur l'échantillon. Excitation ne se produit que dans la région proche focal du faisceau dû à la faible probabilité d'excitation à deux photons. Une paire de miroirs orthogonaux à balayage commandé par ordinateur sont utilisés pour traduire la focalisation du faisceau dans le plan de l'échantillon dans deux directions différentes (appelées directions x et y à travers le protocole). L'émission de fluorescence de back-propagation à partir d'un voxel illuminée de l'échantillon est dispersé dans les composantes spectrales par un réseau de transmission placé dans le chemin de l'émission avant que la lumière tombe d'incident sur les pixels d'un tableau EM-CCD. Ainsi, le profil complet spectrale de n'importe quelle molécule fluorescente / molécules dans la région focale du faisceau est obtenue selon une dimension (direction y) de la matrice CCD. En utilisant le mouvement de l'un des deux miroirs de balayage, l'emplacement de la focalisation du laser peuvent être numérisés au sein de l'échantillon le long d'une ligne perpendiculaire à la direction y. En gardant l'obturateur de la caméra CCD ouverts durant ce scan en ligne unique, les profils spectraux de la res molécules fluorescentesIding le long de la ligne entière de l'analyse sont recueillies dans un seul balayage du faisceau laser sur l'échantillon. Accumuler scanne plusieurs lignes de cette nature dans des lieux différents y dans la cellule donne les profils spectraux d'un grand nombre de complexes fluorescents résidant au sein de l'échantillon. Les images obtenues à partir des scans en ligne sont reconstruits pour donner plusieurs cartes d'intensité de fluorescence xy spatiale de l'échantillon à différentes longueurs d'onde ^{18, 19.} Afin de reconstituer avec précision et calculer la longueur d'onde réelles correspondant aux cartes xy intensité fluorescente spatiale, le protocole de balayage de ligne doivent être étalonnés à l'aide d'un échantillon avec un spectre d'émission de fluorescence bien caractérisés.

1. La résolution spectrale de microscope à deux photons accumule des informations spectrales sur les complexes d'oligomères dans la cellule imagé par balayage de la focalisation du faisceau d'excitation à travers l'échantillon d'intérêt dans un certain nombre d'endroits.
2. Une paire de miroirs orthogonaux de balayage est utilisé pour traduire le focalisation du faisceau laser sur l'échantillon dans deux directions différentes. Le mouvement des miroirs de balayage est contrôlé par ordinateur et synchronisé avec l'extraction des données d'intensité de fluorescence de la caméra CCD.
3. De l'analyse en ligne, cartes d'intensité fluorescente spatiale correspondant à une longueur d'onde particulière de lumière peut être reconstruit. Afin de reconstituer avec précision des cartes xy intensité fluorescente spatiale et de calculer la longueur d'onde réel correspondant à chacune de ces cartes, le protocole de balayage de ligne doit être étalonné avec une solution de fluorescéine.
4. Pour commencer la procédure d'étalonnage, le centre du spectre d'excitation à une longueur d'onde de 800 nm, qui est la longueur d'onde d'excitation 2X maximum de l'étiquette des donateurs, la GFP _2. Pour centrer le spectre d'excitation, de traduire le prisme situé à l'intérieur de la cavité laser pour modifier la dispersion de vitesse de groupe. Le prisme est monté sur un ordinateur contrôlé linéaires platine motorisée.
5. Utilisation du programme de l'ordinateur de l'appareil est connecté à, envoyer une commande à la puce CCD d'abaisser la température de la puce CCD à sa plus basse température atteinte dans le but de réduire le bruit sombre.
6. Pipeter 10 uL d'une solution de fluorescéine sur une lame de microscope. Couvrir avec une lamelle de sorte qu'une couche mince de l'échantillon est uniformément dispersées dans la région entre la lamelle et la lame de microscope.
7. Placer une petite goutte d'huile d'immersion à la surface de la lamelle
8. Maintenant fixez la lame de microscope à l'étape de la traduction xyz et traduire les diapositives / étape dans la direction de l'axe optique en réglant manuellement l'actionneur linéaire qui contrôle le mouvement scénique dans la direction de l'axe optique. Traduire la diapositive / étape jusqu'à ce que l'objectif du microscope est en contact avec la goutte d'huile d'immersion.
9. En utilisant le programme informatique qui contrôle la caméra, passer à un mode vidéo de l'acquisition de données afin que la lumière émise frappant la matrice CCD est affiché sur l'écran d'ordinateur en temps réel. Lentement, d'ajuster le micromètre contrôler la phase de traduction dans le sens de l'axe optique d'apporter l'échantillon dans la tache focale du faisceau laser.
10. Lorsque l'échantillon fluorescéine est au point, l'émission apparaîtra comme une ligne très nette sur la matrice CCD. Télécharger la lecture des intensités des pixels de la matrice CCD à l'ordinateur en utilisant le programme informatique contrôle de la caméra. Mesurer l'intensité du pixel en fonction de la position sur la matrice CCD en ouvrant la matrice téléchargé des valeurs d'intensité en J Image et dessiner une ligne à travers la région fluorescente. Utilisez la commande Image J Analyser le profil Plot → pour créer un tracé illustrant le spectre d'émission de l'échantillon fluorescéine.
11. Ajustez le paramètre différentiel du miroir qui contrôle le mouvement de la focalisation du laser dans la direction y, tels que les postes y adjacentes dans le résultat de l'échantillon dans le mouvement de l'apogée de la spectres de fluorescence par exactement un pixel le long de la dimension spectrale sur le CCD tableau. Suivre ce en téléchargeant les spectres fluorescéine intensité de l'image de valeur pour deux positions différentes y dans l'échantillon, l'ouverture des images intensité avec Image J, et de trouver la position des pixels de pointe pour chacun des spectres de fluorescence à l'aide du curseur Image J.
12. Laissant l'obturateur de l'ouverture CCD, balayage laser, l'accent sur ​​l'échantillon dans la direction x. La lumière émise par chaque voxel le long de la ligne du scan devrait tomber incident sur la matrice CCD.
13. Stocker les données de la matrice CCD obtenues pour ce scan en ligne et puis désactivez les pixels de la matrice CCD.
14. Déplacez la position de la focalisation du laser dans la direction y par le montant déterminé à l'étape 11 de cette section.
15. Balayage du faisceau laser dans la direction x à travers l'échantillon, une fois encore en laissant ouverte l'obturateur de l'ar CCDray et de stocker les données.
16. Répétez cette procédure jusqu'à ce qu'une ligne de balayage espace physique ~ 50% plus grandes que les dimensions d'une seule cellule biologique a été illuminée par la lumière laser.
17. La relation entre le nombre de ligne d'une image numérisée ligne particulière et longueur d'onde doit être utilisé pour reconstruire les images pour obtenir plusieurs cartes xy intensité fluorescente spatiale à différentes longueurs d'onde. Pour obtenir l'image xy émission de fluorescence pour une longueur d'onde particulière (λ _j), trouver le numéro de ligne sur l'image obtenue à partir de la première ligne de balayage qui correspond à cette longueur d'onde. Ensuite la rangée adjacente de l'image numérisée ligne suivante correspond à la rangée suivante de l'image d'émission de fluorescence pour cette longueur d'onde particulière. Stack toutes les lignes d'image qui correspondent à cette longueur d'onde pour obtenir les cartes xy intensité fluorescente spatiale de l'échantillon à cette longueur d'onde. Répétez cette procédure pour toutes les autres longueurs d'onde obtenue.
18. Pour calculer la longueur d'onde associée à chaque carte xy intensité fluorescente spatiale, de déterminer le fond corrigée normalisé d'intensité de fluorescence de chaque image reconstruite en fonction de l'indice de l'image (j). La relation entre la position des pixels caméra dans la dimension spectrale et la longueur d'onde des photons émis est approximativement linéaire, donc la relation entre les images reconstruites xy intensité fluorescente carte spatiale et de longueur d'onde correspondant est aussi linéaire et calculée comme suit:
    où la valeur de m est représenté par:
    Dans le formalisme ci-dessus, le symbole λ _j représente la longueur d'onde de l'image j ^ème reconstruit. Les valeurs de λ _max et λ _½ sont extraites du spectre d'émission de l'échantillon fluorescéine et correspondent aux longueurs d'onde à laquelle l'intensité de la fluorescence de l'échantillon fluorescent est un maximum et la moitié du maximum, respectivement. Les indices de l'image j _max et j _½ correspondent à des images reconstruites possédant le maximum d'intensité de fluorescence et de la moitié du maximum, respectivement.

4. La collecte de données sur les échantillons biologiques d'intérêt

1. Pour recueillir des données sur vos échantillons, retirez d'abord de l'incubateur des plaques avec des colonies de levures transformées. Il devrait y avoir au moins trois types de cellules transformées pleine largeur mi-hauteur (FWHM):
   1. les cellules exprimant les protéines d'intérêt marqués avec les deux types de sondes fluorescentes
   2. cellules exprimant des protéines seulement marqués avec des sondes fluorescentes donateurs, et
   3. cellules exprimant des protéines que taggés avec les sondes fluorescent accepteur.
2. Ajouter 100 ul de 100 mM de KCl dans un tube à centrifuger. En utilisant une pointe de micropipette, gratter 3-5 colonies de levures hors de la plaque de cellules exprimant des protéines tagués avec donneur et accepteur de sondes fluorescentes, et inoculer le KCl 100 mM avec ces cellules.
3. Retirer 10 ul de la suspension cellulaire et le distribuer sur une lame de microscope frais, couvrent la goutte avec une lamelle, et le lieu d'une goutte d'huile sur la surface de la lamelle.
4. Fermer manuellement l'obturateur dans le chemin du faisceau laser pour bloquer la lumière du laser d'atteindre l'objectif du microscope.
5. Fixer la lame de microscope à l'étape de la traduction xyz et traduire les diapositives / étape dans la direction de l'axe optique jusqu'à ce que l'objectif du microscope est en contact avec la goutte d'huile d'immersion.
6. L'image à grand champ de l'échantillon sera sévèrement floue en raison de la présence du réseau de transmission dans la voie d'émission. Par conséquent placer un filtre passe-bande avec une FWHM petits dans le chemin optique précédant le réseau de transmission. Allumez l'éclairage de lumière large champ, et aller à la mode de la caméra vidéo de la collecte de données. Lentement traduire le stade de la traduction dans la direction de l'axe optique tout en visualisant l'image des cellules sur l'écran de la caméra jusqu'à ce que les cellules sont mises en lumière
7. Traduire la scène dans x ou y dans la direction afin d'apporter une seule cellule à l'emplacement de la focalisation du faisceau laser.
8. Eteignez la source large champ d'illumination. Retirez le filtre passe-bande de la voie d'émission.
9. Débloquer le faisceau laser pour une courte durée (<1 seconde), tout en affichant simultanément le signal reçu à la matrice CCD. Si un signal fluorescent est détecté sur le capteur CCD pendant le temps le faisceau laser est incidente sur la cellule, puis effectuer une analyse complète de fluorescence d'acquisition de données de cette cellule. Il est essentiel d'utiliser les mêmes paramètres de numérisation, en particulier le nombre de lignes et l'incrément Y, telle que déterminée dans le caprocédure de libration démontré précédemment.
10. Répétez l'emplacement de la cellule et la fluorescence processus d'acquisition de données pour un grand nombre de cellules exprimant des protéines attachés aux étiquettes des donateurs et les balises accepteur.
11. Après avoir accumulé des images de fluorescence des cellules exprimant des protéines tagués avec deux récepteurs, répétez le processus à la fois pour les cellules exprimant les protéines ne taggés avec les sondes fluorescent donneur et les cellules exprimant les protéines ne taggés avec les sondes fluorescent accepteur.
12. En utilisant la procédure décrite dans la section 3, de reconstruire toutes les analyses pour obtenir des cartes haute résolution spectrale xy intensité fluorescente spatiale pour chaque ensemble de données.

5. L'analyse d'image

Chaque pixel de cartes xy l'intensité de fluorescence spatiale, qui résultent d'un seul balayage d'une cellule de fluorescence biologiques, contient le profil complet spectrale du complexe moléculaire qui résident dans le voxel d'excitation correspondant à ce pixel particulier. Si les protéines d'intérêt sont en interaction avec l'autre, ce profil spectral contiendra un mélange de signaux à la fois du donneur et accepteur sondes fluorescentes. Afin de déterminer la nature des interactions entre les protéines d'intérêt, les profils spectraux d'un grand nombre de ces complexes protéine dans une cellule doit être échantillonné et l'apparente efficacité de FRET (E _app), défini comme la proportion des états excités de la sonde fluorescente qui deviennent des donateurs transféré à la sonde fluorescent accepteur via le FRET, de chaque pixel doit être calculée.

1. Déterminer le fond corrigée intensité de la fluorescence pour chacune des images reconstruites décrits dans la section 4 pour les cellules exprimant des protéines taggés avec seulement les sondes fluorescent donneur et normaliser à la valeur maximale. Parce que chacune de ces images reconstruites correspond à une longueur d'onde distinctes (λ _j) cette collection de valeurs normalisées d'intensité de fluorescence correspond au spectre d'émission mesuré des sondes donateurs, i ^D (λ _j).
2. Répétez l'étape 1 pour les cellules exprimant des protéines taggés avec seulement les balises fluorescent accepteur d'obtenir le spectre d'émission mesurées des sondes accepteur, i ^A. (Λ _j) Depuis la sonde accepteur est choisi de telle sorte qu'il est rarement directement excités en utilisant la source laser, le signal émanant de l'accepteur d'échantillons ne seront faibles et éventuellement sur le même ordre de grandeur que les cellules du signal d'autofluorescence intrinsèque. Par conséquent, le spectre de l'accepteur de fluorescence mesuré calculé de cette manière peut-être besoin d'être corrigé pour enlever la contribution de l'autofluorescence avant de procéder.
3. Utilisation du spectre normalisé obtenu à l'étape 1 et l'étape 2, spectralement décomposer chaque pixel du spectre d'émission de fluorescence des cellules exprimant à la fois protéines marquées avec des sondes fluorescentes donateurs et des protéines tagués avec l'accepteur sondes fluorescentes en utilisant la relation I (λ _j) = k ^DA i ^D (λ _j) + k ^AD i ^A (λ _j) où I (λ _j) représente chaque pixel particulière mesurée spectre de fluorescence. Les valeurs de k et k ^{DA AD} sont proportionnels à l'émission de fluorescence par les donateurs, en présence d'accepteurs et de accepteurs en présence des bailleurs de fonds, respectivement ^5.
4. Calculer l'apparente efficacité qui FRET cartes de l'interaction des protéines dans la cellule à chaque pixel en utilisant la formule, . Ici, Q ^D et Q ^A sont les rendements quantiques de la sonde fluorescent donneur et accepteur sonde fluorescente, respectivement, et w ^D et ^w sont les intégrales du donateur normalisée et spectre d'émission d'accepteur, respectivement ^{19, 20.}
5. Enfin, créer un histogramme en utilisant les valeurs calculées de E _app pour chaque pixel, où le nombre de fois une valeur E spécifiques _app se produit est comploté contre cette valeur particulière de E _app.

6. Analyse de l'histogramme

Afin d'extraire des informations quantitatives à partir des histogrammes E _app, chaque histogramme est théoriquement la forme avec une somme de fonctions gaussiennes, selon la formule suivante:
,
où A _i est l'amplitude, σ _i l'écart-type, et _0i E le plus probable FRET efficacité de la fonction gaussienne i ^vec. Différentes dimensions oligomères et les configurations conduisent à des nombres différents (n) de _0i E et différentes corrélations entre eux ^{1, 17.} Par exemple, pour un tétramère losange en forme, cinq pics sont prévus, donné par les expressions figurant dans le tableau 1.

Relation Tableau 1. Entre chacune des cinq valeurs gaussien centre de pointe et la paire de FRET en efficience prévus pour un tétramère losange en forme.

Cela signifie que seule une valeur E _0i doit être ajusté dans le processus d'ajustement des données - l'un correspondant à E _p - tandis que les quatre autres sont calculés à partir de la valeur de E _p.

1. Supposons un modèle oligomère et d'identifier le nombre de gaussiennes pour être utilisés dans l'aménagement de la E _app histogrammes ^1. Fit l'histogramme en ajustant E _p, A _moi, et _je σ. Notez que la disposition relative des histogrammes est fixé par le modèle. Minimiser le chi carré de l'ajustement ou d'une autre qualité de l'adéquation fonctionnelle.
2. Supposons un autre modèle et le numéro oligomère susceptible répétez l'étape 1.
3. Choisissez le modèle qui correspondent le mieux aux données pour le nombre de paramètres utilisés. Cela peut nécessiter l'aide d'un test statistique (comme le chi carré par le nombre de degrés de liberté).

Les résultats représentatifs

Illustré à la figure 1 sont la résultante k ^{DA, AD} k, et E cartes _app spatiale calculée à partir des mesures résolues spectralement la microscopie à deux photons réalisées sur une cellule de levure exprimant le 2 stérile α-facteur (Ste2p) ^{21, 22.}

Figure 1. Cellules de levure exprimant la stérile 2 α-récepteur du facteur. Cartes en deux dimensions des bailleurs de fonds (k ^DA) et accepteur (k ^AD) signaux ont été obtenus à partir de la procédure de déconvolution spectrale appliquée à chaque pixel d'images prises à l'aide de la résolution spectrale à deux photons microscope d'une cellule de levure exprimant l'α-stérile 2 du récepteur du facteur (Ste2p). Intensités de fluorescence sont assignés en fausses couleurs selon leurs valeurs et de l'échelle est montré comme un encart. Une carte à deux dimensions de l'apparente efficacité frettes ont été calculées en utilisant la ^DA k et k images ^AD.

Un histogramme a été préparé en utilisant les valeurs extraites de la carte _app E de la cellule représentée à la figure 1. Sur la photo, dans la figure 2 est l'histogramme équipé correspondant aux valeurs mesurées _app E (cercles) de la cellule illustrée à la figure 1. La ligne rouge continue représente le meilleur ajustement aux données mesurées à l'aide de la somme des fonctions gaussiennes individuelles (vert lignes pleines).

Figure 2. Histogramme des valeurs _app E pour une cellule de levure exprimant la stérile 2 α-récepteur du facteur. L'histogramme qui correspond aux valeurs mesurées (cercles) des _app E pour la cellule illustrée à la figure 1 est représentée. Individuels fonctions gaussiennes (solide lignes vertes) sont additionnées pour simuler (ligne rouge) les valeurs mesurées. Paramètres de la fonction gaussienne sont les suivants: E ₀₁ = 16,7; A = ₁ 118,9; σ ₁ = 3.2; E ₀₂ = 25,1; A ₂ = 100,0; σ ₂ = 4,6; E ₀₃ = 32,6; A = ₃ 202,6; σ ₃ = 4,6; E ₀₄ = 40,1; A = ₄ 92.6; σ ₄ = 3,7; E ₀₅ = 50,1; A ₅ = 16,0; σ ₅ = 7,9.

Les relations entre gaussien moyens nécessaires pour ajuster les données présentées dans l'histogramme de la figure 2 sont donnés dans le tableau 1. Le nombre et la corrélation entre les fonctions de Gauss correspond au nombre et les corrélations entre valeurs attendues _app E pour losange en forme de complexes d'oligomères tétramère. Par conséquent, il ressort de la résolution spectrale à deux photons mesures que le complexe Ste2p oligomère prend la forme d'un tétramère losange en forme in vivo ^19.

Discussion

Dans cette présentation, nous avons illustré comment déterminer la taille et l'information structurelle sur un complexe oligomère des protéines in vivo. Bien que les données présentées ont été obtenues à partir d'un récepteur membranaire spécifique (c.-à Ste2p) exprimée dans les cellules de la levure, la méthode est globale en ce qu'elle peut être appliquée à tout type de protéine exprimée dans tout type de cellule, la seule condition étant que les protéines sont étiquetés avec des marqueurs fluorescents appropriés. De futures modifications à ce protocole implique l'amélioration de l'instrument pour atteindre des vitesses de balayage plus élevée dans une tentative pour contrôler la taille en fonction du temps d'oligomères de protéines et des changements de structure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptone	Fisher Scientific	BP1420
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422
Polyethlyene Glycol 4000	Hampton Research	HR2-605
Yeast Nitrogen Base w/o (NH4)2SO4 and amino acids	Fisher Scientific	DF0335-15-9
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	Sigma-Aldrich	Y2001
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Agar	Fisher Scientific	S70210
Ammonium Sulfate	Fisher Scientific	A702-500
Potassium Chloride	Acros Organics	424090010
Leucine	Fisher Scientific	BP385
Histidine	Fisher Scientific	BP382
Plan Achromat Infinity Corrected 100x Oil Immersion Objective NA=1.43	Nikon Instruments
Spectrally resolved two photon microscope