Summary
Alineados fibras electrospun dirigir el crecimiento de las neuronas in vitro y son un componente potencial de andamios la regeneración nerviosa. Se describe un procedimiento para la preparación de sustratos electrospun fibra y el cultivo libre de suero de rata principal E15 sensorial (GRD) y las neuronas motoras. La visualización de las neuronas por inmunocitoquímica también se incluye.
Abstract
Electrospinning es una técnica para la producción de micro-fibras de escala nanométrica. Las fibras pueden ser electrospun con distintos grados de alineación, de muy bien alineados para completamente al azar. Además, las fibras se pueden girar de una variedad de materiales, incluyendo polímeros biodegradables tales como poli-L-láctico (PLLA). Estas características hacen que las fibras electrospun adecuado para una variedad de aplicaciones de andamios en ingeniería de tejidos. Nuestra atención se centra en el uso de fibras electrospun alineados para la regeneración nerviosa. Hemos demostrado previamente que las fibras alineadas electrospun PLLA directa el resultado de dos neuronas sensoriales primarias y el motor in vitro. Sostenemos que el uso de un sistema de células de cultivo primario es fundamental en la evaluación de los biomateriales a las neuronas modelo real en vivo tanto como sea posible. A continuación, describimos las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio para electrospin andamios fibrosa y la cultura dorsal explantes de ganglios de la raíz, así como disociada neuronas sensoriales y motoras, en los andamios electrospun. Sin embargo, el electrospinning y / o técnicas de cultivo se presentan aquí son fácilmente adaptables para su uso en otras aplicaciones.
Protocol
1. Poli-L-láctico (PLLA) Spinning Solución
- Disolver 0,4 g PLLA en 9 ml de cloroformo, agitando a fuego lento.
- Añadir 1 ml de dimetilformamida a la solución, con lo que la concentración final de la solución al 4% PLLA (w / v) en cloroformo: DMF 9:1 (v / v).
- Ponga la solución en una jeringa de vidrio o polipropileno, con una punta de metal 23ga contundente.
2. Spinning Preparación del substrato 1
- Hacer una solución al 8% (w / v) de 85:15 PLGA (poli-láctico-co-glicólico) en cloroformo, agitando a fuego lento.
- Capa limpia cubierta de vidrio se desliza en PLGA cubriendo la superficie de cada hoja de la cubierta con la solución de PLGA. Deje que el PLGA para secar a una capa delgada (aprox. 30 min).
3. Electrospinning 2
- Asegure la cubierta de vidrio recubierta PLGA se desliza al colector con una cinta de carbón conductor. Para las fibras alineadas, el colector es una rueda con motor. Para las fibras de azar, el colector es una placa estacionaria.
- Coloque la jeringa en la bomba con la punta de 20 cm de la rueda del colector. Conjunto de la bomba de aproximadamente 2 ml / hora y si se utiliza una rueda, ajustar el motor a 300-400 RPM. Si es posible, aplicar un sesgo -2 kV DC para el colector y 15 kV hasta la punta de metal. Ante la falta de acceso a una fuente de alimentación bipolar, baja del colector.
- Las fibras se chorro de la punta de la jeringa y se acumulan en la rueda giratoria. Continúe girando hasta que la densidad deseada de las fibras se obtiene. Pase la punta de metal con una toalla de papel colocada en una barra no conductora periódicamente para evitar la obstrucción en la punta.
4. Moating 1
- Girar a continuación, 'foso' las muestras electrospun pipeteando una línea de PLGA en todo el perímetro de la hoja de la cubierta. Deje que el PLGA que se seque. Esto mantendrá la alineación de las fibras durante el cultivo.
5. Proteína de revestimiento
- Electrospun fibras y los controles de vidrio debe ser recubierto en proteínas antes de cultivo celular. Cubrir los sustratos en una solución de proteínas, por lo menos una hora y luego aspirar el exceso de solución y seguir aspirando hasta que los sustratos están secos. Posibles soluciones de proteínas son: PLL (poli-L-lisina) (100 mg / mL), laminina (25 mg / ml) o la fibronectina (50 mg / mL). Si PLL se utiliza, los sustratos deben ser enjuagados con agua estéril y seca dos veces después de la capa inicial.
6. Obtener embriones de rata E15 3
* Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio aprobado por la Universidad de Michigan Comité de Uso y Cuidado de Animales.
- Preparación: Compruebe si el animal está embarazada. Descongele los 3 ml de tripsina, 3 ml de FBS y calentar un biberón de L15. Fuego pulir una pipeta Pasteur. Desinfectar todos los instrumentos quirúrgicos en el 70% de etanol durante 30 min.
- Preparar y calentar el medio de placas (ver Tabla 1).
- Eutanasia: Realizar una inyección IP de ketamina / xilazina. Espere 10-15 minutos y comprobar por falta de la córnea y el pedal de reflejos de retirada. Una vez que los reflejos están ausentes, realice una inyección de pentobarbital IC (FatalPlus).
- La tienda de la piel del abdomen. Corte a través de la piel y las capas musculares para exponer la cavidad abdominal. Localizar el útero y separarlo en el cuello del útero y los ovarios.
- La toma de embriones del útero con una tijera y colocarlos inmediatamente en caliente L15. (Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un microscopio de disección y los embriones y los cables de disección debe ser sumergido en agua tibia L15 en todo momento.) Decapitar a los embriones por el cierre de pinzas alrededor de la barbilla y debajo del hueso occipital del cráneo.
7. Disección de 3
- Coloque el embrión de un lado. Proteger la médula espinal con un juego de pinzas, mientras que con el otro despojarnos de las extremidades y los órganos abdominales.
- A su vez el embrión y mantenerlo fijo con un juego de pinzas. Recorte a lo largo del embrión, desde el cuello hasta la cola, hasta que toda la médula está expuesto.
- Sujete el extremo del cable con cuidado y tire de ella sobre sí misma hacia la cola para retirar. El cable se tire libre con membrana y ganglios de la raíz dorsal (GRD) adjunto.
- Si DRG explante o cultura disociada neurona sensorial se va a realizar, cortar la DRG de la médula y la transferencia a un plato fresco de tibia L15.
- Por DRG explante cultura, con el paso 10.2
- Para el cultivo disociado de neuronas sensoriales, vaya al paso 9
- Para el motor cultura neurona, el DRG se eliminará con la membrana en el paso 7.5
- Quitar la membrana de la médula espinal, sujetándola en el extremo superior de la médula y el pelado hacia abajo, similar a la eliminación de una media de largo. Repita este procedimiento para todos los embriones y luego cortar los cables en pequeños (2-3 mm) piezas.
- Vierta los cables cortados y L15 en una forma cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 minutos para que sedimenten las piezas.
- Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a los cables de pellets. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 20 min.
- Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet.
- Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS.
- Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas.
- Prepare una solución de 9% de Optiprep en L15. Preparar un tubo con 3 ml de la solución Optiprep por cada dos embriones (si hay un número impar de embriones, redondear).
- Caída de la solución homogeneizada en la solución Optiprep, dividiéndola en partes iguales entre todos los tubos. Girar los tubos a 2000 rpm durante 15 minutos.
- Recoger cuidadosamente los 2 ml de cada tubo y la piscina en un Erlenmeyer de 50 ml. Llene el cono con L15 y giran a 1000 rpm durante 5 minutos para enjuagar las células de Optiprep.
- Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de chapado (250 a 500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Vaya al paso 10.1
9. Neurona sensorial (SN) de elaboración 7
- Vierta el DRG eliminado de la médula espinal y L15 en un tubo cónico y giran a 1000 RPM durante 2-3 min para precipitar las piezas.
- Retirar el sobrenadante y agregar 3 ml de tripsina a la DRG granulado. Incubar en un baño de agua 37 ° C durante 10 min.
- Añadir 3 ml de FBS cónica y giran a 1000 rpm durante 2-3 min para volver a pellet.
- Retirar el sobrenadante y la capa de un incendio pulido pipeta Pasteur con FBS.
- Añadir una pipeta Pasteur, lleno de L15 a la cónica y luego se tritura suavemente hasta que la solución es homogénea sin grumos visibles. Evitar las burbujas.
- Girar el homogenado a 1000 rpm durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las células en una pequeña cantidad de medios de comunicación placas SN (250-500 l). Contar las células con azul de tripan exclusión para identificar las células vivas. Continúe con el paso 10.1
10. Revestimiento y Cultura
- Para disociar SN o la cultura MN:
- Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, agregar un volumen apropiado de la suspensión celular. Las células disociadas se sembraron a una densidad baja (25-50 células / mm 2). Permitir que las células se adhieran por lo menos una hora antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación.
- Por DRG explante cultura:
- Cubrir los sustratos con unas gotas de los medios de comunicación a continuación, añadir DRG a los medios de comunicación. Organizar los GRD para que se distribuyen uniformemente a través del substrato (aproximadamente 4 DRG caben en una hoja de 22x22 mm cubierta). Deje que el GRD que se adhieran durante al menos 4 horas antes de la inundación de los pozos con los medios de comunicación.
- Culturas se puede mantener durante un máximo de 4 días sin cambiar los medios de comunicación. Durante más tiempo las culturas, la mitad de los cambios medios de comunicación se debe hacer con los medios de alimentación. Alimentar a los medios de comunicación es la misma composición que los medios de comunicación placas menos la L-glutamina.
11. Inmunocitoquímica 1,5,8
- La fijación de las células: los medios de comunicación Aspirar y reemplazar con agua tibia 4% PFA (paraformaldehído) durante 30 minutos. A continuación, realizar 3 veces 5 min lavados con PBS 1x.
- Bloqueo / permeabilización: Prepare bloque / perm solución (1,25% de suero albúmina bovina en PBS 1X, un 0,05% Triton X-100 y el 2,0% de suero normal de cabra). Aspirar PBS y aplicar bloque / permanente solución a las muestras durante 30 minutos. A continuación, realice 1X 5 min lavados con PBS 1x.
- Anticuerpo primario: Preparar la solución de anticuerpo primario de trabajo (10% de suero normal de cabra, un 1,25% de albúmina sérica bovina, el 0,1% de azida Na, 0,05% de Triton X-100 y 10 ml con 1x PBS). Añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (ver Tabla 2). Línea de varios platos con parafilm. Coloque un cordón de 200μl de solución de anticuerpos primarios en la parafina para cada sustrato. Invertir los sustratos, flotando a la par de la celda hacia abajo en la solución de anticuerpo primario de trabajo durante la noche (si la habitación tiene aire acondicionado o en seco sobre todo, un pedazo de papel saturado de agua se pueden agregar a una esquina del plato para evitar la evaporación de la solución de trabajo) .
- Anticuerpo secundario: Retire los sustratos de la primaria (la solución de trabajo pueden ser recogidos, almacenados a 4 ° C y reutilizar) y llevar a cabo 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Aplicar 200 l de anticuerpos secundario diluido 1:200 en PBS (también se invierte en un plato forrado parafina) durante 4 horas.
- Eliminar de secundaria a continuación, realizar 2 veces 5 min lavados con PBS 1x. Soportes de montaje en láminas de oro con prolongar la DAPI u otro contador nuclear adecuada mancha.
12. Los resultados representativos:
La morfología típica de alineado y El azarfibras ectrospun se muestra en la Figura 1. Por lo general obtener la pureza de la MN> 90% 7,8 neuronas con este protocolo y hemos mantenido DRG culturas durante todo el tiempo como una semana sin ningún tipo de crecimiento de fibroblastos significativo. La figura 2 muestra la apariencia típica de MN en fibras de vidrio y después de 24 horas de la cultura y la inmunotinción. DRG immunostained cultivadas durante tres días en fibras de vidrio y se muestra en la Figura 3.
Figura 1. Alineación de la fibra es manipulado por la elección de los colectores. A.) Alineados fibras hiladas en un colector de rueda giratoria y B.) hilar fibras al azar en un colector de placa estacionaria. Las barras de escala = 20 micras.
Figura 2. Representante neuronas motoras teñidas Tuj1 (verde) y DAPI (azul) después de 24 horas de la cultura en A. recubierto PLL) fibras y B) de cristal. Las barras de escala = 20 micras.
Figura 3. Manchada Representante DRG para neurofilamentos (verde) después de 3 días de cultivo en el PLL recubiertas A.) de vidrio y B) las fibras. Las barras de escala = 200 micras.
| Solución de reserva: | MN medios de comunicación: | DRG / SN medios de comunicación: |
| 10 mg mL -1 albúmina | 12,5 l | - |
| 10 mg mL -1 apo-transferrina | 50 l | 40 ml |
| 50 mg mL -1 β-estradiol | 2,7 l | 2,2 l |
| 0,1 mg mL -1 biotina | 50 l | - |
| 16 mg mL -1 catalasa | L 8 | - |
| 15 mg mL -1 D-galactosa | 50 l | - |
| 50 mg mL -1 de hidrocortisona | 3,7 l | 2,9 l |
| 0,63 mg mL -1 de progesterona | 0,5 l | - |
| 16 mg mL -1 putrescina | 50 l | - |
| 50 mg mL -1 selenio | 3,4 l | 4,1 l |
| 2,5 mg mL -1 superóxido dismutasa | 50 l | - |
| * 500 ng ml -1 nervio del factor de crecimiento | - | 1 mL |
| * 100X PSN | 0,5 ml | 0,5 ml |
| * B27 | 1 mL | 1 mL |
| * 2 mM L-glutamina | 35 l | 35 l |
| * Neurobasal | a 50 ml | a 50 ml |
Tabla 1. Añadir asterisco (*) los componentes de los medios de comunicación justo antes del uso. El resto de componentes se pueden preparar como una solución de reserva y se mantiene a -20 ° C hasta el momento de 6,7.
| Primaria (concentración) | Las neuronas: | Glia: | Fibroblastos: |
| anti-β-tubulina (Tuj1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-neurofilamentos (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-p75 NGFR (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Tabla 2. La selección de anticuerpo primario depende de los objetivos del investigador. Los anteriores son varios anticuerpos y las concentraciones que se han utilizado con éxito en nuestro laboratorio. S-100 es especialmente útil para identificar las células de Schwann y / o detectar la contaminación fibroblastos, pero tenga en cuenta que se debe utilizar en combinación con NGFR p75 para distinguir entre células gliales y fibroblasts4. También hemos notado que NGFR p75 manchas neuritas muy ligeramente, mientras que neurofilamentos o Tuj1 son excelentes opciones si el objetivo es visualizar neuritas individual.
Discussion
Este protocolo tiene varios pasos críticos. La primera consiste en la correcta producción de los sustratos de fibra electrospun. En medios líquidos, las fibras de PLLA, el cine y el foso PLGA PLGA se separará de la hoja de la cubierta de vidrio como una sola unidad. Si el PLGA se omite, las fibras de PLLA no seguirá siendo una hoja plana - que se acurrucaba en una maraña inutilizable. Así, la película de PLGA se incluye como un sustrato adecuado para mantener la alineación de la fibra durante el cultivo. El foso se añade después de girar tanto para garantizar que las fibras estén bien fijados a la película de PLGA y añadir rigidez estructural de la película. El foso que también sirve como un mango útil cuando los sustratos son manipulados durante la fijación, tinción y montaje. La trituración es el segundo paso crítico. Todo esfuerzo debe hacerse para evitar la formación de burbujas. Además, hemos obtenido un rendimiento mucho mayor cuando una pipeta pulida al fuego se utiliza para este paso. Para pulir el fuego, la luz de un mechero Bunsen y adjuntar una bombilla en la pipeta. Pase la punta de la pipeta rápidamente a través de la llama de 3.2 veces, mientras que continuamente apretar y soltar la bombilla - el flujo de aire a través de la pipeta le ayudará a evitar que la punta no cierran correctamente. Examine la punta de la pipeta para asegurarse el agujero sigue abierto y que los bordes ligeramente redondeados aparecen antes de su uso.
Electrospinning es un proceso muy versátil; los parámetros electrospinning se pueden modificar para producir fibras con una variedad de morfologías. Tan et al. (2005) los detalles de un estudio sistemático de los parámetros que afectan el diámetro de las fibras de PLLA electrospun. Wang et al. (2009) presenta un estudio detallado de los parámetros que influyen en la alineación de las fibras de PLLA electrospun.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
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