Summary
不结盟纤维直接的神经元在体外的生长，是一个潜在的神经再生的支架组成部分。我们描述了一个准备静电纤维基材和主大鼠E15感觉（DRG）和运动神经元无血清培养的过程。用免疫细胞化学神经元的可视化也包括在内。
Abstract
静电是微纳米尺度的纤维生产的技术。纤维可与不同高度完全是随机的对齐，对齐度，静电。此外，纤维可纺的各种材料，包括可生物降解的聚合物，如聚- L -乳酸（PLLA）。这些特点使电纺纤维适合在组织工程中的各种脚手架应用。我们的重点是使用对齐神经再生的电纺纤维。我们曾表明，对齐静电聚乳酸纤维直接的初级感觉和运动神经元在体外的生长。我们维持生物材料尽可能接近体内发现真正的神经元模型进行评估时，一个主要的细胞培养系统的使用是必不可少的的。在这里，我们描述了在我们的实验室中使用electrospin纤维支架和文化背根神经节外植体，以及分离的感觉和运动神经元上的静电支架，技术。然而，静电和/或很容易适应这里介绍的养殖技术在其他应用程序使用。
Protocol
1。纺丝溶液的聚- L -乳酸（PLLA）
- 慢火搅拌溶解0.4克聚乳酸在9 mL氯仿。
- 加入1 mL的二甲基甲酰胺的解决方案，使终浓度为4％聚乳酸（W / V），氯仿：DMF 9:1（V / V）的解决方案。
- 将在聚丙烯或玻璃注射器用钝器23ga金属尖端的解决方案。
2。纺纱基材的准备1
- 在氯仿中慢火搅拌85:15的PLGA的8％（W / V）溶液（聚乳酸 - 乙醇酸）。
- 外套干净的玻璃在PLGA的盖玻片表面覆盖每个盖玻片与PLGA解决方案。允许的PLGA干到薄膜（约30分钟）。
3。静电2
- 安全PLGA的镀膜玻璃盖玻片集电极与导电碳胶带。对齐纤维，收集器是一个马达驱动车轮。对于随机的纤维，集热器是一个固定板。
- 将注射器尖端20厘米集电极轮泵。泵设置约2毫升/小时，如果使用的是一个轮子，电机300-400 RPM。如果可能的话，一个收藏家的-2千伏直流偏置和15千伏金属尖端应用。在访问一个双极电源的情况下，地面收集器。
- 纤维将喷射注射器尖端和旋转的轮子上收集。继续纺纱，直到获得所需的纤维密度。刷卡用纸巾的金属尖端贴到非导电杆，定期以防止堵塞尖端。
4。 Moating 1
- 以下纺纱，“护城河”吹打盖玻片周边各地的PLGA行静电样品。允许的PLGA干。这将保持对齐文化的过程中的纤维。
5。蛋白质涂层
- 纤维和玻璃控制蛋白质在细胞培养之前需要涂。包括至少一个小时，在蛋白质溶液的基板，然后吸出多余的解决方案，并继续吸气，直到基板干。可能的蛋白质的解决方案包括：PLL（聚- L -赖氨酸）（100微克/毫升），层粘连蛋白（25μg/ mL的）或纤维连接蛋白（50微克/毫升） 。如果使用PLL时，基板应在无菌水冲洗和干燥的两倍以下的初始的涂层。
6。获取E15大鼠胚胎3
*所有实验均按照美国国立卫生研究院批准，由密歇根州委员会关于使用和爱护动物大学的实验室动物护理和使用指南。
- 制备方法：检查，如果动物是怀孕。解冻3毫升3毫升胰蛋白酶，FBS和温暖的一个L15瓶。消防波兰巴斯德吸管。所有手术器械消毒30分钟70％的乙醇。
- 准备和热情电镀媒体（ 见表1）。
- 安乐死：执行注射氯胺酮/甲苯噻嗪的IP。等待10-15分钟，并检查角膜的缺乏和踏板撤回反射。一旦反射缺席，执行注射苯巴比妥（FatalPlus）的IC。
- 帐篷的腹部皮肤。通过皮肤和肌肉层切暴露腹腔。找到子宫，并在子宫颈癌和卵巢中分离。
- 用剪刀从子宫中取出胚胎，并立即放入L15的温暖。 （以下所有程序完成后在解剖显微镜下和胚胎和解剖线应在温暖的L15淹没在任何时候）。杀头关闭钳周围的下巴和下面的颅骨的枕骨胚胎。
7。夹层3
- 胚胎放在一边。保护脊髓一套镊子，而使用另一套剥离四肢和腹部器官。
- 将胚胎和同一套镊子稳定。沿着胚胎的长度剪断，从脖子到尾巴，直到整个线暴露。
- 仔细抓住线结束，并拉向尾部超过本身删除。拉膜和背根神经节（DRG）连接线将免费。
- 如果要执行DRG的外植体或分离的感觉神经元文化，DRG的关闭线剪断，并将它们传送到一个温暖的L15的新鲜菜。
- 对于背根神经节外植体文化，跳到步骤10.2
- 对于分离的感觉神经元文化，跳到步骤9
- 对于运动神经元文化，背根神经节将在步骤7.5中的膜被删除
- 卸下抓线的高端和剥落下来的脊髓膜，以消除长袜子类似。重复所有胚胎，然后斩成小片（2-3毫米）的线。
- 在1000转速为2-3分钟，以沉淀件，倒入一个圆锥形和自旋切碎线和L15。
- 倒掉上清，加入3毫升的胰蛋白酶颗粒线。孵育在37℃水浴20分钟。
- 加入3 mL的胎牛血清的锥形，并在1000转速为2-3分钟，以重新颗粒旋转。
- 倒掉上清，大衣火灾打磨巴斯德吸管与胎牛血清。
- 添加一个巴斯德吸管L15全锥形，然后轻轻磨碎，直到解决的办法是同质性与不可见的团块。避免气泡。
- 准备在L15的Optiprep 9％的解决方案。每两个胚胎（，如果有一个胚胎奇数，四舍五入），准备用3毫升的Optiprep解决方案一管。
- 下降到Optiprep解决方案的同质化解决方案，除以各管均匀。在2000年为15分钟的转速旋转管。
- 仔细收集每管50 mL锥形池前2毫升。在1000 RPM，5分钟的填充锥形冲洗Optiprep细胞L15和自旋。
- 倒掉上清，重悬细胞，少量的电镀媒体（250-500μL）。使用台盼蓝拒识别活细胞计数细胞。跳过步骤10.1
9。感觉神经元（SN）处理7
- 倒入成一个锥形管和旋转中删除从脊髓和L15在1000转速为2-3分钟，以沉淀件的背根神经节。
- 倒掉上清，加入3毫升的胰蛋白酶颗粒DRG的。孵育在37℃水浴10分钟。
- 加入3 mL的胎牛血清的锥形，并在1000转速为2-3分钟，以重新颗粒旋转。
- 倒掉上清，大衣火灾打磨巴斯德吸管与胎牛血清。
- 添加一个巴斯德吸管L15全锥形，然后轻轻磨碎，直到解决的办法是同质性与不可见的团块。避免气泡。
- 在5分钟1000转的旋转匀浆。倒掉上清，重悬细胞，少量的锡电镀媒体（250-500μL）。使用台盼蓝拒识别活细胞计数细胞。继续加强10.1
10。电镀与文化
- 分离SN或MN文化：
- 盖基板与媒体几滴，然后添加适当体积的细胞悬液。应镀游离细胞密度低（25-50个细胞/ mm 2）。允许细胞坚持至少一小时之前，充斥媒体的水井。
- 对于背根神经节外植体培养：
- 封面与媒体几滴基板，然后添加DRG的媒体。排列的背根神经节，使它们均匀地分布在整个基板（约4背根神经节，将适合在一个22x22毫米盖玻片）分布。允许的DRG至少4小时坚持之前与媒体充斥井。
- 文化可以维持到4天，而媒体的变化。对于较长的文化，一半媒体的变化，应做饲料的媒体。饲料媒体电镀媒体减去L -谷氨酰胺的成分相同。
11。免疫细胞化学1,5,8
- 修复细胞：吸媒体和30分钟用温水4％PFA（多聚甲醛）取代。然后执行3X 5分钟1X PBS洗。
- 阻断/通透性：准备块/烫发液（1.25％牛血清白蛋白在1X PBS，0.05％TRITON X - 100和2.0％正常山羊血清）。吸PBS和应用块/烫发液，以30分钟的样品。然后执行1X 5分钟1X PBS洗。
- 主要抗体：准备一抗工作液（10％正常山羊血清，0.05％，1.25％的牛血清白蛋白，0.1％NA叠氮Triton X - 100和到10的1X PBS毫升）。添加适量的初级抗体（ 见表2）。封口膜线几盘。地方每个基板上的封口膜的主要抗体溶液200μL珠。反转基板，浮动他们的细胞面朝下放在工作的解决方案的主要抗体过夜（如果房间是空调或特别干燥，水饱和纸件可以添加到菜的一个角落，以防止工作液的蒸发） 。
- 二次抗体：从主要工作的解决方案，可以收集，保存在4 ° C和重用的取出基板和执行2X 5分钟1X PBS洗。应用200μL二次抗体稀释1:200 PBS（也封口膜内衬盘上倒）为4小时。
- 从中学删除，然后进行5分钟2X 1X PBS洗。幻灯片山基板与延长黄金含有的DAPI或其他合适的核反击污点。
12。代表性的成果：
对齐和随机EL的典型形态ectrospun纤维如图1所示。我们通常会获得百万纯度> 90％的神经元 7,8与本议定书和我们一直保持着DRG的只要一个星期没有任何重大的成纤维细胞生长的文化。图2显示了典型的玻璃和纤维MN文化和免疫后24小时出现。培养三天玻璃和纤维的免疫染色的DRG图3所示。
图1。光纤对准是由集热器的选择操纵。 A）对齐纤维纺到一个旋转的轮子收藏家和B）的随机纤维纺到一个固定的集热器。比例尺= 20微米。
图2代表PLL涂答：经过24小时的文化的运动神经元染色TuJ1（绿色）和DAPI（蓝色））纤维和B）玻璃。比例尺= 20微米。
图3。代表DRG神经丝染色后3天的文化上的PLL涂答：（绿色））玻璃和B）纤维。比例尺= 200微米。
| 库存的解决方案： | 明尼苏达媒体： | DRG / SN媒体： |
| 10毫克毫升-1白蛋白 | 12.5μL | - |
| 10毫克毫升-1 APO -转 | 50μL | 40μL |
| 50微克毫升-1β-雌二醇 | 2.7μL | 2.2μL |
| 0.1毫克毫升-1素 | 50μL | - |
| 16毫克毫升-1过氧化氢 酶 | 8μL | - |
| 15毫克毫升-1 D -半乳糖 | 50μL | - |
| 50微克毫升-1氢化可的松 | 3.7μL | 2.9μL |
| 0.63毫克毫升-1孕酮 | 0.5μL | - |
| 16毫克毫升-1腐胺 | 50μL | - |
| 50微克毫升-1硒 | 3.4μL | 4.1μL |
| 2.5毫克毫升-1超氧化物歧化酶 | 50μL | - |
| * 500毫微克毫升 -1神经生长因子 | - | 1毫升 |
| * 100X PSN | 0.5毫升 | 0.5毫升 |
| * B27 | 1毫升 | 1毫升 |
| * 2毫米L -谷氨酰胺 | 35μL | 35μL |
| * Neurobasal | 到50 mL | 到50 mL |
表1：星号标记（*）组件媒体在使用前。其余的组件，可以准备作为原液，并保存在-20 ° C，直到需要 6,7 。
| 小学（浓度） | 神经元： | 神经胶质细胞： | 成纤维细胞： |
| 抗β-微管蛋白（TuJ1）（1:1000） | ✓ | X | X |
| 抗神经丝（1:1000） | ✓ | X | X |
| 抗S - 100（1:25） | X | ✓ | ✓ |
| NGFR p75的抗（1:500） | ✓ | ✓ | X |
表2。初级抗体的选择是依赖于研究者的目标。上述几种抗体，我们已经在我们的实验室中成功使用的浓度。 S - 100，是特别有用的，以确定雪旺氏细胞和/或污染的成纤维细胞检查，但要注意，它必须使用与NGFR p75的结合，区分神经胶质细胞和fibroblasts4。我们也注意到，NGFR p75的污渍突起很轻，而神经丝或TuJ1是很好的选择，如果我们的目标是可视个别突起。
Discussion
该协议有几个关键步骤。首先涉及到电纺纤维基板的正常生产。在液体介质中，聚乳酸纤维的PLGA膜和PLGA护城河将单独作为一个单元的玻璃盖玻片。如果省略的PLGA，聚乳酸纤维不会仍然是一个平板 - 他们会卷曲成一个不可用的纠结。因此，PLGA的电影是一个合适的基板文化的过程中保持光纤对准。护城河是添加后纺，以确保纤维的PLGA薄膜牢固地固定和增加结构刚性的电影。护城河也是当基板固定，染色和安装过程中操纵，作为一个有用的处理。 Trituration是第二个关键步骤。应该尽一切努力，以避免形成泡沫。此外，我们已经取得的收益要高得多时，火抛光的吸管是这一步。要火波兰，点燃本生灯和吸管连接一个灯泡。通过吸管尖迅速通过火焰2-3次，同时不断挤压和释放灯泡 - 空气流通过吸管将有助于防止从完全关闭提示。检查吸管尖，以确保孔仍处于打开状态，使用前圆润的边缘出现轻微。
静电是一个非常灵活的过程;电参数进行修改，以产生的各种形态的纤维。 Tan 等 （2005）详细介绍了影响聚乳酸纤维的直径参数的系统研究。王等人 （2009）提出了影响静电纺丝聚乳酸纤维的对齐参数的详细研究。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
美国国立卫生研究院K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
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