Summary
गठबंधन electrospun फाइबर इन विट्रो में न्यूरॉन्स के विकास को प्रत्यक्ष और तंत्रिका पुनर्जनन scaffolds के एक संभावित घटक हैं. हम electrospun फाइबर substrates और सीरम मुक्त प्राथमिक चूहे E15 (DRG) संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स की संस्कृति की तैयारी के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. Immunocytochemistry द्वारा न्यूरॉन्स के विज़ुअलाइज़ेशन भी शामिल है.
Abstract
Electrospinning नैनो पैमाने पर फाइबर सूक्ष्म उत्पादन के लिए एक तकनीक है. फाइबर अत्यधिक पूरी तरह यादृच्छिक गठबंधन से संरेखण की डिग्री बदलती के साथ electrospun किया जा सकता है है. इसके अलावा, फाइबर पाली एल लैक्टिक एसिड (PLLA) जैसे biodegradable polymers सहित सामग्री की एक किस्म से काता जा सकता है. इन विशेषताओं electrospun ऊतक इंजीनियरिंग में मचान आवेदनों की एक किस्म के लिए उपयुक्त फाइबर बनाने के लिए. हमारे तंत्रिका पुनर्जनन के लिए गठबंधन electrospun फाइबर के उपयोग पर ध्यान केंद्रित है. हम पहले से पता चला है कि गठबंधन electrospun PLLA फाइबर इन विट्रो में दोनों को प्राथमिक संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स के परिणाम प्रत्यक्ष. हम मानते हैं कि एक प्राथमिक सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग आवश्यक है जब मॉडल असली निकटता के रूप में संभव के रूप में vivo में पाया न्यूरॉन्स biomaterials मूल्यांकन. यहाँ, हम हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता करने के लिए रेशेदार scaffolds और संस्कृति पृष्ठीय रूट ganglia explants, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से electrospun scaffolds पर dissociated संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स, electrospin तकनीक का वर्णन. हालांकि, electrospinning और / या संस्कृति यहाँ प्रस्तुत तकनीक आसानी से अन्य अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.
Protocol
1. पाली एल लैक्टिक एसिड (PLLA) समाधान स्पिनिंग
- कम गर्मी पर सरगर्मी से 9 एमएल क्लोरोफॉर्म में 0.4 छ PLLA भंग.
- समाधान के लिए 1 एमएल dimethylformamide जोड़ें, क्लोरोफॉर्म में 4% (w / v) PLLA समाधान के अंतिम एकाग्रता लाने: DMF 09:01 (v / v).
- या एक कुंद 23ga धातु टिप के साथ एक गिलास सिरिंज polypropylene के समाधान में रखें.
2. सब्सट्रेट तैयार एक स्पिनिंग
- क्लोरोफॉर्म में कम गर्मी पर सरगर्मी से 85:15 PLGA के एक 8% (w / v) समाधान (पाली लैक्टिक सह glycolic एसिड) बनाओ.
- कोट PLGA समाधान के साथ प्रत्येक को कवर पर्ची की सतह को कवर द्वारा स्वच्छ कांच PLGA में कवर फिसल जाता है. PLGA एक पतली फिल्म (लगभग 30 मिनट) के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
3. 2 Electrospinning
- सुरक्षित PLGA लेपित गिलास को कवर प्रवाहकीय कार्बन टेप के साथ कलेक्टर से निकल जाता है. गठबंधन फाइबर के लिए, कलेक्टर मोटर चालित एक पहिया है. यादृच्छिक फाइबर के लिए, कलेक्टर एक स्थिर थाली है.
- टिप कलेक्टर पहिया से 20 सेमी के साथ पंप में रखें सिरिंज. लगभग 2 एमएल / घंटा पंप सेट और अगर एक पहिया का उपयोग करते हुए, 300-400 RPM को मोटर सेट. यदि संभव हो तो, एक -2 केवी डीसी कलेक्टर को पूर्वाग्रह और 15 केवी धातु टिप करने के लिए लागू होते हैं. एक द्विध्रुवी बिजली की आपूर्ति करने के लिए पहुँच के अभाव में, कलेक्टर भूमि.
- फाइबर सिरिंज टिप से जेट और घूर्णन पहिया पर इकट्ठा करेंगे. कताई जारी रखें जब तक फाइबर के वांछित घनत्व प्राप्त की है. ज़ोर से मारना एक कागज तौलिया के साथ धातु टिप टिप पर समय - समय पर clogging रोकने के लिए एक गैर प्रवाहकीय छड़ी करने के लिए चिपका.
4. 1 Moating
- बाद कताई, PLGA के कवर पर्ची की परिधि के चारों ओर एक लाइन pipetting द्वारा 'खाई' electrospun नमूने. PLGA सूखी अनुमति दें. इस संस्कृति के दौरान फाइबर के संरेखण को बनाए रखना होगा.
5. प्रोटीन कोटिंग
- Electrospun फाइबर और गिलास नियंत्रण सेल संस्कृति से पहले प्रोटीन में लेपित किया जा जरूरत है. कम से कम एक घंटे के लिए एक प्रोटीन समाधान में substrates के कवर और तब अतिरिक्त समाधान aspirate और जब तक substrates के सूख रहे हैं aspirating जारी है. PLL (पाली एल lysine) (100 μg / एमएल), laminin (25 μg / एमएल) या fibronectin (50 μg / एमएल): संभव प्रोटीन समाधान में शामिल हैं. यदि PLL प्रयोग किया जाता है, substrates बाँझ पानी में rinsed होना चाहिए और प्रारंभिक कोटिंग के बाद दो बार सूखे.
6. प्राप्त E15 चूहा भ्रूण 3
* सभी प्रयोगों देखभाल और प्रयोगशाला के रूप में पशु और पशु का उपयोग और देखभाल पर विश्वविद्यालय मिशिगन समिति द्वारा अनुमोदित का उपयोग के लिए NIH गाइड के अनुसार में किया गया.
- तैयारी: की जाँच करें अगर पशु गर्भवती है. 3 एमएल trypsin, 3 एमएल FBS और l15 की एक बोतल गर्म पहले गला लें. आग एक पाश्चर विंदुक पॉलिश. 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में सभी सर्जिकल उपकरणों कीटाणुरहित.
- तैयार है और चढ़ाना मीडिया गर्म (देखें तालिका 1).
- इच्छामृत्यु: ketamine / xylazine के एक आईपी इंजेक्शन प्रदर्शन करना. 10-15 मिनट रुको और corneal की कमी की जांच करने के लिए और वापसी सजगता पेडल. एक बार सजगता अनुपस्थित रहे हैं, pentobarbital (FatalPlus) एक आईसी इंजेक्शन करते हैं.
- पेट की त्वचा तम्बू. त्वचा और मांसपेशियों की परतों के माध्यम से कट करने के लिए उदर गुहा का पर्दाफाश. गर्भाशय का पता लगाएँ और गर्भाशय ग्रीवा और अंडाशय में अलग.
- गर्भाशय से भ्रूण को कैंची से निकालें और उन्हें l15 गर्म में तुरंत जगह. (सभी निम्न कार्यविधियों एक विदारक माइक्रोस्कोप और भ्रूण के तहत पूरा कर रहे हैं और dissected डोरियों हर समय गर्म l15 में डूबे हुए किया जाना चाहिए.) ठोड़ी के आसपास संदंश बंद और खोपड़ी के नीचे पश्चकपाल हड्डी भ्रूण सिर काटना.
7. 3 विच्छेदन
- भ्रूण को एक तरफ रखें. संदंश के एक सेट के साथ रीढ़ की हड्डी की रक्षा करते हुए दूसरे सेट का उपयोग अंग और पेट अंगों को दूर पट्टी.
- भ्रूण मुड़ें और संदंश का एक सेट के साथ इसे स्थिर पकड़ है. भ्रूण की लंबाई के साथ कटाव, गर्दन से पूंछ के लिए, जब तक पूरी की हड्डी उजागर है.
- गर्भनाल के अंत सावधानी से समझ और वह खुद पर पूंछ की ओर हटायें खींच. कॉर्ड झिल्ली और पृष्ठीय रूट (DRG) ganglia संलग्न के साथ मुक्त खींच जाएगा.
- यदि explant या dissociated संवेदी न्यूरॉन संस्कृति DRG प्रदर्शन किया जा रहा है, गर्भनाल से DRG कटाव और उन्हें गर्म l15 के एक ताजा डिश के लिए स्थानांतरण.
- Explant संस्कृति DRG के लिए, करने के लिए 10.2 कदम को छोड़
- Dissociated संवेदी न्यूरॉन संस्कृति के लिए, करने के लिए 9 कदम को छोड़
- मोटर न्यूरॉन संस्कृति के लिए, DRG 7.5 चरण में झिल्ली के साथ हटा दिया जाएगा
- यह गर्भनाल के शीर्ष के अंत में लोभी और यह नीचे छीलने के द्वारा रीढ़ की हड्डी से झिल्ली, एक लंबे जुर्राब हटाने के लिए समान निकालें. सभी भ्रूण के लिए दोहराएँ और फिर छोटे टुकड़ों (2-3 मिमी) में डोरियों काटना.
- 2-3 मिनट के लिए गोली के टुकड़े के लिए 1000 RPM में एक शंक्वाकार और स्पिन में कटा डोरियों और l15 डालो.
- बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और pelleted डोरियों trypsin के 3 एमएल जोड़ने. 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं.
- शंक्वाकार और 2-3 मिनट के लिए फिर से गोली 1000 RPM में स्पिन करने के लिए 3 एमएल FBS जोड़ें.
- सतह पर तैरनेवाला और कोट एक आग FBS साथ पॉलिश पाश्चर विंदुक डालो.
- शंक्वाकार के लिए एक l15 के विंदुक भरा पाश्चर जोड़ें और फिर धीरे triturate जब तक समाधान नहीं दिखाई clumps के साथ समरूप है. बुलबुले से बचें.
- L15 में Optiprep की एक 9% समाधान तैयार है. Optiprep समाधान के 3 एमएल के साथ हर दो भ्रूण (अगर वहाँ भ्रूण के एक विषम संख्या है, ऊपर दौर) के लिए एक ट्यूब तैयार करें.
- Optiprep समाधान पर homogenized समाधान ड्रॉप, यह सभी ट्यूबों के बीच समान रूप से विभाजित. 15 मिनट के लिए 2000 RPM में ट्यूबों स्पिन.
- ध्यान से प्रत्येक पूल और एक 50 एमएल शंक्वाकार में ट्यूब से ऊपर 2 एमएल इकट्ठा. L15 और स्पिन के साथ 5 मिनट के लिए 1000 आरपीएम पर शंक्वाकार Optiprep की कोशिकाओं कुल्ला भरें.
- बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और चढ़ाना मीडिया (250-500 μl) की एक छोटी राशि में कोशिकाओं resuspend. Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग करने के लिए जीवित कोशिकाओं की पहचान कोशिकाओं की गणना. 10.1 कदम छोड़ें
9. संवेदी न्यूरॉन (एस.एन.) प्रसंस्करण 7
- गोली के टुकड़े को 2-3 मिनट के लिए 1000 RPM में एक चोटीदार ट्यूब और स्पिन में रीढ़ की हड्डी डोरियों और l15 से हटा DRG डालो.
- बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और pelleted DRG trypsin के 3 एमएल जोड़ने. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते हैं.
- शंक्वाकार और 2-3 मिनट के लिए फिर से गोली 1000 RPM में स्पिन करने के लिए 3 एमएल FBS जोड़ें.
- सतह पर तैरनेवाला और कोट एक आग FBS साथ पॉलिश पाश्चर विंदुक डालो.
- शंक्वाकार के लिए एक l15 के विंदुक भरा पाश्चर जोड़ें और फिर धीरे triturate जब तक समाधान नहीं दिखाई clumps के साथ समरूप है. बुलबुले से बचें.
- 5 मिनट के लिए 1000 RPM में homogenate स्पिन. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो और एस.एन. चढ़ाना मीडिया (250-500 μl) की एक छोटी राशि में कोशिकाओं resuspend. Trypan नीले बहिष्करण का उपयोग करने के लिए जीवित कोशिकाओं की पहचान कोशिकाओं की गणना. 10.1 कदम जारी रखें
10. चढ़ाना और संस्कृति
- Dissociated एस.एन. या एम.एन. संस्कृति के लिए:
- मीडिया की कुछ बूंदों के साथ substrates के कवर तो सेल निलंबन का एक उचित मात्रा में जोड़ें. Dissociated कोशिकाओं की एक कम घनत्व (25-50 कोशिकाओं / मिमी 2) पर चढ़ाया जाना चाहिए . कोशिकाओं को कम से कम एक घंटे के लिए मीडिया के साथ कुओं बाढ़ से पहले पालन करने के लिए अनुमति दें.
- Explant संस्कृति DRG के लिए:
- मीडिया की कुछ बूंदों के साथ substrates के कवर तो मीडिया को DRG जोड़ने के. DRG व्यवस्था है ताकि वे समान रूप से सब्सट्रेट (लगभग 4 DRG एक 22x22 मिमी कवर पर्ची पर फिट होगा) भर में वितरित कर रहे हैं. DRG कम से कम 4 घंटे के लिए मीडिया के साथ कुओं बाढ़ से पहले पालन करने के लिए अनुमति दें.
- संस्कृतियों के लिए बनाए रखा जा सकता है मीडिया परिवर्तन के बिना 4 दिनों के लिए. अब संस्कृतियों के लिए, आधा मीडिया परिवर्तन फ़ीड मीडिया के साथ किया जाना चाहिए. फ़ीड मीडिया चढ़ाना मीडिया शून्य एल glutamine के रूप में एक ही संरचना है.
11. 1,5,8 Immunocytochemistry
- कोशिकाओं फिक्सिंग: Aspirate मीडिया गर्म 4% पीएफए (paraformaldehyde) के साथ 30 मिनट के लिए जगह और. फिर 3X 5 मिनट 1x पीबीएस washes के प्रदर्शन.
- अवरुद्ध / permeabilization: / ब्लॉक पर्म समाधान (1.25% गोजातीय 1X पीबीएस में albumin सीरम, 0.05% ट्राइटन X-100 और 2.0% सामान्य बकरी सीरम) तैयार है. Aspirate पीबीएस और ब्लॉक / 30 मिनट के लिए नमूनों को पर्म समाधान लागू. फिर 1X 5 मिनट 1x पीबीएस washes के प्रदर्शन.
- प्राथमिक एंटीबॉडी: प्राथमिक एंटीबॉडी काम कर समाधान तैयार (10% सामान्य बकरी सीरम, 1.25% गोजातीय सीरम albumin, 0.1% ना azide, 1x पीबीएस के साथ 0.05% ट्राइटन एमएल X-100 और 10). प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित राशि जोड़ें (तालिका 2 देखें). रेखा parafilm साथ कई व्यंजन. प्रत्येक सब्सट्रेट के लिए parafilm पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200μl मनका रखें. Substrates के उलटें, उन्हें सेल की ओर तैर नीचे प्राथमिक एंटीबॉडी काम कर समाधान पर रातोंरात (अगर कमरे वातानुकूलित या विशेष रूप से शुष्क हवा है, पानी संतृप्त कागज का एक टुकड़ा पकवान के एक कोने में जोड़ा जा सकता है काम समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के) .
- माध्यमिक एंटीबॉडी: प्राथमिक (काम कर समाधान, एकत्र किया जा सकता है 4 में संग्रहीत ° C और reused) से substrates निकालें और 2X 5 मिनट 1x पीबीएस washes के प्रदर्शन. 200 μl माध्यमिक 1:200 पतला पीबीएस (भी parafilm पंक्तिवाला पकवान पर औंधा) में 4 घंटा के लिए एंटीबॉडी लागू करें.
- माध्यमिक से निकालें तो 2X 5 मिनट 1x पीबीएस washes के प्रदर्शन. स्लाइड्स पर माउंट substrates के साथ लम्बा DAPI या किसी अन्य उपयुक्त परमाणु काउंटर दाग युक्त गोल्ड.
12. प्रतिनिधि परिणाम:
गठबंधन किया और यादृच्छिक एल के ठेठ आकारिकीectrospun फाइबर चित्र 1 में दिखाया जाता है. आम तौर पर हम> इस प्रोटोकॉल के साथ 90% 7,8 न्यूरॉन्स के एम.एन. पवित्रता प्राप्त है और हम के रूप में लंबे समय से एक सप्ताह के लिए किसी भी महत्वपूर्ण fibroblast वृद्धि के बिना संस्कृतियों DRG बनाए रखा है. चित्रा 2 संस्कृति और immunostaining के 24 घंटे के बाद ग्लास और फाइबर पर ठेठ एम.एन. उपस्थिति से पता चलता है. Immunostained कांच और फाइबर पर तीन दिनों के लिए सुसंस्कृत DRG 3 चित्र में चित्रित कर रहे हैं.
चित्रा फाइबर 1. संरेखण कलेक्टर की पसंद से छेड़छाड़ है. ए) एक rotating पहिया कलेक्टर और बी पर घूमती निरपेक्ष फाइबर) यादृच्छिक फाइबर एक स्थिर प्लेट संग्राहक पर घूमती है. स्केल सलाखों = 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2 प्रतिनिधि मोटर TuJ1 () हरे और DAPI (नीला) के लिए PLL लेपित ए पर 24 बजे के बाद संस्कृति का दाग) फाइबर और बी न्यूरॉन्स) गिलास . स्केल सलाखों = 20 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 प्रतिनिधि neurofilament लिए DRG दाग (हरा) संस्कृति के दिनों के बाद PLL लेपित ए पर 3) ग्लास और बी) फाइबर. स्केल सलाखों = 200 सुक्ष्ममापी.
| स्टॉक समाधान: | एम.एन. मीडिया: | DRG / एस.एन. मीडिया: |
| 10 मिलीग्राम एमएल albumin -1 | 12.5 μl | - |
| 10 मिलीग्राम एमएल APO-transferrin -1 | 50 μl | 40 μl |
| 50 μg एमएल β-estradiol -1 | 2.7 μl | 2.2 μl |
| 0.1 मिलीग्राम एमएल -1 बायोटिन | 50 μl | - |
| 16 मिलीग्राम एमएल -1 catalase | 8 μl | - |
| 15 मिलीग्राम एमएल डी galactose -1 | 50 μl | - |
| 50 μg एमएल -1 hydrocortisone | 3.7 μl | 2.9 μl |
| 0.63 मिलीग्राम एमएल -1 प्रोजेस्टेरोन | 0.5 μl | - |
| 16 मिलीग्राम एमएल -1 putrescine | 50 μl | - |
| 50 μg एमएल -1 सेलेनियम | 3.4 μl | 4.1 μl |
| 2.5 मिलीग्राम एमएल -1 superoxide dismutase | 50 μl | - |
| * 500 एनजी एमएल -1 तंत्रिका वृद्धि कारक | - | 1 एमएल |
| * 100X PSN | 0.5 एमएल | 0.5 एमएल |
| B27 * | 1 एमएल | 1 एमएल |
| * 2 मिमी एल glutamine | 35 μl | 35 μl |
| * Neurobasal | 50 एमएल के लिए | 50 एमएल के लिए |
तालिका 1. तारांकित जोड़ें (*) घटक मीडिया को सिर्फ पहले उपयोग करने के लिए. शेष घटकों के एक शेयर के समाधान के रूप में तैयार किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जब तक 6,7 की जरूरत है.
| प्राथमिक (एकाग्रता) | न्यूरॉन्स: | Glia: | Fibroblasts: |
| (TuJ1) विरोधी β ट्यूबिलिन (1:1000) | ✓ | एक्स | एक्स |
| विरोधी neurofilament (1:1000) | ✓ | एक्स | एक्स |
| विरोधी S-100 (1:250) | एक्स | ✓ | ✓ |
| विरोधी p75-NGFR (1:500) | ✓ | ✓ | एक्स |
टेबल 2 प्राथमिक एंटीबॉडी के चयन अन्वेषक के लक्ष्यों पर निर्भर है. ऊपर कई एंटीबॉडी और सांद्रता हम हमारी प्रयोगशाला में सफलता के साथ इस्तेमाल किया है रहे हैं. 100 - एस की पहचान करने के लिए श्वान कोशिकाओं और / या fibroblasts contaminating की जांच करने के लिए के लिए, लेकिन कृपया ध्यान दें कि यह p75 NGFR के साथ संयोजन में उपयोग किया जाना चाहिए glia और fibroblasts4 के बीच अंतर विशेष रूप से उपयोगी है. हम भी देखा है कि p75 NGFR दाग को बहुत हल्के से neurites जबकि neurofilament या TuJ1 उत्कृष्ट पसंद कर रहे हैं अगर लक्ष्य व्यक्तिगत neurites कल्पना है.
Discussion
इस प्रोटोकॉल के कई महत्वपूर्ण कदम है. पहले electrospun फाइबर substrates के समुचित उत्पादन शामिल है. तरल मीडिया में PLLA फाइबर, PLGA फिल्म और PLGA खाई एक एकल इकाई के रूप में कांच के कवर पर्ची से अलग कर देगा. यदि PLGA छोड़ा जाता है, PLLA फाइबर एक फ्लैट शीट नहीं रहेगा - वे एक व्यर्थ उलझन में कर्ल जाएगा. इस प्रकार, PLGA फिल्म संस्कृति के दौरान फाइबर संरेखण को बनाए रखने के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट के रूप में शामिल है. खाई दोनों कताई करने के लिए सुनिश्चित करें कि फाइबर सुरक्षित PLGA फिल्म तय कर रहे हैं और फिल्म के लिए संरचनात्मक कठोरता जोड़ने के बाद जोड़ा है. खाई भी एक उपयोगी संभाल के रूप में कार्य करता है जब substrates फिक्सिंग, धुंधला हो जाना और बढ़ते के दौरान छेड़छाड़ कर रहे हैं. Trituration दूसरा महत्वपूर्ण कदम है. बुलबुले के गठन से बचने के हर संभव प्रयास किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, हम बहुत अधिक पैदावार प्राप्त की है जब एक आग पॉलिश विंदुक इस कदम के लिए प्रयोग किया जाता है. पॉलिश आग, एक Bunsen बर्नर प्रकाश और विंदुक के लिए एक बल्ब देते हैं. पिपेट की नोक जल्दी से लौ के माध्यम से 2-3 बार दर्रे जबकि लगातार फैलाएंगे और बल्ब जारी विंदुक के माध्यम से हवा का प्रवाह पूरी तरह से बंद करने से टिप को रोकने में मदद मिलेगी. विंदुक टिप जांच करने के लिए सुनिश्चित छेद अभी भी खुला है और कि किनारों दिखाई देते हैं उपयोग करने से पहले थोड़ा गोल.
Electrospinning एक बहुत बहुमुखी प्रक्रिया है, electrospinning मापदंडों morphologies की एक किस्म के साथ फाइबर का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. टैन एट अल (2005) PLLA electrospun फाइबर के व्यास को प्रभावित करने वाले मापदंडों के एक व्यवस्थित अध्ययन के विवरण. वैंग एट अल (2009) electrospun PLLA फाइबर के संरेखण को प्रभावित मापदंडों का एक विस्तृत अध्ययन प्रस्तुत करता है .
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
K08 EB003996 एनआईएच
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
