Summary
Alignés fibres électrofilées diriger la croissance des neurones in vitro et sont un élément potentiel de régénération nerveuse échafaudages. Nous décrivons une procédure pour la préparation des substrats de fibres électrofilé et la culture sans sérum de rat E15 sensorielles primaires (DRG) et les neurones moteurs. Visualisation des neurones par immunocytochimie est également inclus.
Abstract
Électrofilage est une technique pour produire des micro-nano-échelle des fibres. Les fibres peuvent être électrofilé avec divers degrés de l'alignement, de très alignés complètement aléatoire. En outre, les fibres peuvent être tissés à partir de divers matériaux, y compris les polymères biodégradables tels que la poly-L-lactique (PLLA). Ces caractéristiques font de fibres électrofilées approprié pour une variété d'applications d'échafaudages en ingénierie tissulaire. Notre accent est mis sur l'utilisation de fibres électrofilé alignés pour la régénération des nerfs. Nous avons précédemment montré que les fibres alignées électrofilé PLLA directe l'excroissance des deux neurones sensoriels et moteurs primaires in vitro. Nous soutenons que l'utilisation d'un système de culture de cellules primaires est essentielle lors de l'évaluation des biomatériaux pour les neurones véritable modèle in vivo trouve aussi près que possible. Ici, nous décrivons les techniques utilisées dans notre laboratoire pour electrospin échafaudages fibreux et la culture des explants ganglions de la racine dorsale, ainsi que dissocié neurones sensoriels et moteurs, sur des échafaudages électrofilé. Toutefois, l'électrofilage et / ou des techniques de culture présentées ici sont facilement adaptés pour une utilisation dans d'autres applications.
Protocol
1. Poly-L-lactique (PLLA) filage en solution
- Dissoudre 0,4 g PLLA dans 9 ml de chloroforme en agitant à feu doux.
- Ajouter 1 ml de diméthylformamide à la solution, amenant la concentration finale de la solution à 4% PLLA (p / v) dans le chloroforme: DMF 9:1 (v / v).
- Placer la solution dans un polypropylène ou d'une seringue en verre avec une pointe en métal 23ga émoussé.
2. Filature 1 Préparation du support
- Faire une solution à 8% (p / v) de 85:15 PLGA (poly-lactique-co-acide glycolique) dans le chloroforme en agitant à feu doux.
- Manteau glisse propre couvercle de verre dans PLGA en recouvrant la surface de chaque lamelle avec la solution de PLGA. Laisser sécher le PLGA d'un film mince (env. 30 min).
3. Électrofilage 2
- Fixez PLGA couvercle verre enduit glisse vers le collecteur avec du ruban de carbone conducteur. Pour les fibres alignées, le collecteur est une roue motorisée. Pour les fibres au hasard, le collecteur est un plateau fixe.
- Placer dans une seringue à embout de la pompe de 20 cm de la roue de collecteur. Régler la pompe à environ 2 ml / h et si vous utilisez une roue, régler le moteur à 300-400 RPM. Si possible, appliquer un malus de -2 kV DC biais vers le collecteur et le 15 kV à pointe métallique. En l'absence d'accès à une alimentation bipolaire, terrain du collecteur.
- Fibres va jet du bout de la seringue et recueillir sur la roue en rotation. Continuez jusqu'à ce que la filature de fibres de densité désirée est obtenue. Glissez la pointe en métal avec une serviette en papier fixée à une tige non conductrice périodiquement pour éviter le colmatage à la pointe.
4. Moating 1
- Suite à filer, «fossé» les échantillons électrofilé par pipetage une ligne de PLGA autour du périmètre de la lamelle. Autoriser le PLGA à sécher. Ce sera de maintenir l'alignement des fibres au cours de la culture.
5. Revêtement des protéines
- Fibres de verre et de contrôles électrofilées besoin d'être recouvert de protéines avant la culture cellulaire. Couvrir les substrats dans une solution de protéines pour moins d'une heure et puis aspirer l'excès de solution et continuer jusqu'à ce que l'aspiration des substrats sont secs. Solutions de protéines possibles comprennent: PLL (poly-L-lysine) (100 pg / ml), la laminine (25 ug / ml) ou de la fibronectine (50 ug / ml). Si PLL est utilisée, les supports doivent être rincés à l'eau stérile et séché deux fois par la suite le revêtement initial.
6. Obtenir E15 embryons de rat 3
* Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec le Guide du NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire approuvé par l'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et l'entretien des animaux.
- Préparation: Vérifiez si l'animal est enceinte. Dégel 3 ml de trypsine, 3 ml de FBS et chaleureuse d'une bouteille de L15. Incendie polir une pipette Pasteur. Désinfecter tous les instruments chirurgicaux dans l'éthanol 70% pendant 30 min.
- Préparer et chaleureux des médias placage (voir tableau 1).
- Euthanasie: Effectuer une injection IP de kétamine / xylazine. Attendez 10-15 minutes et vérifiez l'absence de la cornée et la pédale réflexes de retrait. Une fois que les réflexes sont absents, exécuter une injection IC de pentobarbital (FatalPlus).
- Tente de la peau de l'abdomen. Couper à travers la peau et les couches musculaires pour exposer la cavité abdominale. Localisez l'utérus et le détacher au niveau du col et des ovaires.
- Retirez les embryons dans l'utérus avec des ciseaux et de les placer immédiatement dans L15 chaud. (Toutes les procédures suivantes sont accomplies sous un microscope à dissection et d'embryons et les cordons disséqués doit être immergé dans L15 chaude à tout moment.) Décapitez les embryons par la fermeture des pinces autour du menton et en dessous de l'os occipital du crâne.
7. Dissection 3
- Placez l'embryon d'un côté. Protéger la moelle épinière avec un jeu de pinces tout en utilisant l'autre ensemble de dépouiller membres et des organes abdominaux.
- Tournez l'embryon et le tient stable avec un jeu de pinces. Snip le long de la longueur de l'embryon, à partir du cou à la queue, jusqu'à ce que le cordon entier est exposé.
- Saisir l'extrémité de la corde et tirez soigneusement sur lui-même vers la queue à enlever. Le cordon va tirer gratuitement à membrane et les ganglions de la racine dorsale (DRG) ci-joint.
- Si DRG explant ou dissocié de la culture neurone sensoriel doit être exécuté, snip la DRG hors du cordon et les transférer sur un plat frais de L15 chaud.
- Pour la culture DRG explant, passez à l'étape 10.2
- Pour la culture des neurones sensoriels dissocié, passez à l'étape 9
- Pour des neurones moteurs de la culture, la DRG sera supprimée avec la membrane à l'étape 7.5
- Retirer la membrane de la moelle épinière en la saisissant à l'extrémité supérieure du cordon et le peler bas, similaire à enlever une chaussette longue. Répétez l'opération pour tous les embryons puis hachez les cordes en petits (2-3 mm) pièces.
- Verser les cordes coupées et L15 dans une conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux.
- Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour les cordes en granulés. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 20 min.
- Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés.
- Décanter le surnageant et le manteau d'un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS.
- Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu'à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles.
- Préparer une solution de 9% des Optiprep au L15. Préparer un tube avec 3 mL de la solution Optiprep pour deux embryons (s'il ya un nombre impair d'embryons, arrondir).
- Déposer la solution homogénéisée sur la solution Optiprep, en le divisant équitablement entre tous les tubes. Faites tourner les tubes à 2000 RPM pendant 15 min.
- Recueillir soigneusement les premiers 2 ml de chaque tube et d'une piscine dans un cône de 50 mL. Remplissez le conique avec L15 et tournent à 1000 RPM pendant 5 min pour se rincer les cellules de Optiprep.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passer à l'étape 10.1
9. Sensory Neuron (SN) Transformation 7
- Verser le DRG retiré de la moelle épinière et L15 dans un tube conique et tourne à 1000 RPM pendant 2-3 min pour culotter les morceaux.
- Décanter le surnageant et ajouter 3 ml de trypsine pour la DRG granulés. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 10 min.
- Ajouter 3 ml de FBS à conique et tournent à 1000 RPM pendant 2-3 min à nouveau à granulés.
- Décanter le surnageant et le manteau d'un incendie polie pipette Pasteur avec du FBS.
- Ajoutez une pipette Pasteur plein de L15 à la forme conique et ensuite triturer doucement jusqu'à ce que la solution est homogène, sans grumeaux visibles. Eviter les bulles.
- Spin l'homogénat à 1000 RPM pendant 5 min. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans une petite quantité de médias plaquage SN (250-500 pi). Compter les cellules en utilisant exclusion du bleu trypan pour identifier les cellules vivantes. Passez à l'étape 10.1
10. Placage et Culture
- Pour dissocier SN ou MN culture:
- Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias, puis ajouter un volume approprié de cellules en suspension. Les cellules dissociées doivent être étalées à une faible densité (25-50 cellules / mm 2). Laisser les cellules adhérer pendant au moins une heure avant l'inondation du puits avec les médias.
- Pour la culture des explants DRG:
- Couvrir les substrats avec quelques gouttes de médias puis ajouter DRG aux médias. Disposez les DRG de sorte qu'ils sont répartis à travers le substrat (environ 4 GHM tient sur une lamelle mm 22x22). Laisser le DRG adhérer pendant au moins 4 heures avant l'inondation du puits avec les médias.
- Les cultures peuvent être maintenues jusqu'à 4 jours sans changer de support. Pour plus des cultures, la moitié des modifications des médias doit être fait avec les médias nourrissent. Flux des médias est la même composition que les médias plaquage moins la L-glutamine.
11. Immunocytochimie 1,5,8
- Fixation des cellules: les médias et la remplacer par Aspirer chaude 4% PFA (paraformaldéhyde) pendant 30 min. Effectuez ensuite 3X 5 min 1x lave PBS.
- Blocage / perméabilisation: Préparer bloc / perm solution (1,25% de sérum albumine bovine dans du PBS 1X, 0,05% Triton X-100 et de 2,0% de sérum de chèvre normal). Aspirer PBS et appliquer bloc / perm solution pour échantillons pendant 30 minutes. Effectuez ensuite 1X 5 min 1x lave PBS.
- L'anticorps primaire: Préparer la solution d'anticorps primaire de travail (10% de sérum de chèvre normal, 1,25% d'albumine sérique bovine, 0,1% de Na azide, 0,05% de Triton X-100 et à 10 mL avec du PBS 1X). Ajouter la quantité appropriée d'anticorps primaire (voir tableau 2). Ligne plusieurs plats avec du parafilm. Placer un cordon de 200 ul de solution d'anticorps primaire sur la parafilm pour chaque substrat. Inverser les substrats, flottant entre eux cellule vers le bas côté de la solution d'anticorps primaire travaille la nuit (si la salle est climatisée ou particulièrement sec, un morceau de papier saturé d'eau peut être ajoutée à un coin du plat pour éviter l'évaporation de la solution de travail) .
- L'anticorps secondaire: Enlever les substrats de la primaire (la solution de travail peuvent être collectées, stockées à 4 ° C et réutilisés) et d'effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Appliquer 200 ul d'anticorps secondaires dilué 1:200 dans du PBS (également inversé sur parafilm plat bordé) pendant 4 heures.
- Retirer du secondaire, puis effectuer 2x 5 min 1x lave PBS. Substrats mont sur des lames d'or avec Prolongez contenant DAPI ou un autre compteur convient colorant nucléaire.
12. Les résultats représentatifs:
La morphologie typique d'alignement et de hasard elfibres ectrospun sont présentés dans la figure 1. Nous généralement obtenir une pureté de MN> 90% des neurones 7,8 avec ce protocole et nous avons maintenu DRG cultures aussi longtemps que une semaine sans aucune croissance des fibroblastes significative. La figure 2 montre l'aspect typique de MN sur les fibres de verre et après 24 heures de culture et d'immunomarquage. DRG immunocolorés culture pendant trois jours sur le verre et les fibres sont illustrés dans la Figure 3.
L'alignement des fibres Figure 1. Est manipulé par le choix du collectionneur. A.) alignés fibres filées sur un collecteur de roue tournante et B.) fibres aléatoire filé sur un collecteur de plaque stationnaire. Barres d'échelle = 20 um.
Figure 2. Neurones moteurs Représentant colorées pour TuJ1 (vert) et le DAPI (bleu) après 24 heures de culture sur A. revêtement PLL) fibres et B.) en verre. Barres d'échelle = 20 um.
Figure 3. Teinté DRG Représentant pour neurofilaments (vert) après 3 jours de culture sur PLL revêtement A.) en verre et B.) des fibres. Barres d'échelle = 200 pm.
| Solution mère: | MN médias: | DRG / SN médias: |
| 10 mg mL -1 d'albumine | 12,5 ul | - |
| 10 mg mL -1 apo-transferrine | 50 ul | 40 ul |
| 50 pg ml -1 β-estradiol | 2,7 ul | 2,2 ul |
| 0,1 mg mL -1 biotine | 50 ul | - |
| 16 mg mL -1 catalase | 8 pl | - |
| 15 mg mL -1 D-galactose | 50 ul | - |
| 50 mg mL -1 d'hydrocortisone | 3,7 ul | 2,9 ul |
| 0,63 mg mL -1 progestérone | 0,5 ul | - |
| 16 mg mL -1 putrescine | 50 ul | - |
| 50 pg ml -1 sélénium | 3,4 ul | 4,1 ul |
| 2,5 mg ml -1 superoxyde dismutase | 50 ul | - |
| * 500 ng mL -1 facteur de croissance nerveuse | - | 1 ml |
| * 100X PSN | 0,5 ml | 0,5 ml |
| * B27 | 1 ml | 1 ml |
| * 2 mM L-glutamine | 35 pl | 35 pl |
| * Neurobasal | à 50 mL | à 50 mL |
Tableau 1. Ajouter astérisque (*) des composants aux médias juste avant l'utilisation. Les autres composants peuvent être préparées comme une solution de réserve et conservés à -20 ° C jusqu'au moment de servir 6,7.
| Primaire (concentration) | Neurones: | Glia: | Fibroblastes: |
| anti-β-tubuline (TuJ1) (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-neurofilaments (1:1000) | ✓ | X | X |
| anti-S-100 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anti-p75 NGFR (1:500) | ✓ | ✓ | X |
Tableau 2. La sélection d'anticorps primaire dépend des objectifs de l'enquêteur. Le ci-dessus sont plusieurs anticorps et les concentrations, nous avons utilisé avec succès dans notre laboratoire. S-100 est particulièrement utile pour identifier les cellules de Schwann et / ou vérifier les contaminer les fibroblastes, mais notez qu'il doit être utilisé en combinaison avec NGFR p75 de distinguer entre les cellules gliales et de fibroblasts4. Nous avons également remarqué que NGFR p75 taches neurites très légèrement tout en neurofilaments ou TuJ1 sont d'excellents choix si le but est de visualiser neurites individuels.
Discussion
Ce protocole comporte plusieurs étapes cruciales. Le premier concerne la production proprement dite des substrats de fibres électrofilé. Dans les milieux liquides, les fibres PLLA, PLGA films et les douves PLGA sera séparée de la lamelle de verre comme une seule unité. Si le PLGA est omis, les fibres PLLA ne restera pas une feuille plate - ils se recroquevillent dans un enchevêtrement inutilisable. Ainsi, le film de PLGA est inclus comme un substrat adéquat pour maintenir l'alignement des fibres pendant la culture. Le fossé est ajouté après le filage à la fois pour s'assurer que les fibres sont solidement fixées au film PLGA et d'ajouter à la rigidité structurelle du film. Le fossé est aussi une poignée utile lorsque les substrats sont manipulés lors de la fixation, la coloration et de montage. La trituration est la deuxième étape critique. Tous les efforts doivent être faits pour éviter la formation de bulles. De plus, nous avons obtenu des rendements beaucoup plus élevés quand une pipette polie au feu est utilisé pour cette étape. Pour le feu polonais, allumer un bec Bunsen et joindre une ampoule à la pipette. Passez l'extrémité de la pipette rapidement à travers la flamme 2-3 fois tout en continuant à presser et relâcher l'ampoule - le débit d'air grâce à la pipette aidera à prévenir la pointe de se refermer complètement. Examiner la pointe de la pipette pour s'assurer que le trou est toujours ouverte et que les bords apparaissent légèrement arrondi avant l'utilisation.
Électrofilage est un processus très polyvalent; les paramètres électrofilage peuvent être modifiés pour produire des fibres avec une variété de morphologies. Tan et al. (2005) détaille une étude systématique des paramètres affectant le diamètre des fibres électrofilées PLLA. Wang et al. (2009) présente une étude détaillée des paramètres influençant l'alignement des fibres PLLA électrofilé.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
