Summary
정렬 electrospun 섬유는 체외에서 뉴런의 성장을 직접 신경 재생 공사장 공중 발판의 잠재적인 구성 요소입니다. 우리는 electrospun 섬유 기판 및 기본 쥐 E15 감각 (DRG)와 모터 뉴런의 혈청이없는 문화를 준비 절차를 설명합니다. immunocytochemistry에 의해 뉴런의 시각화도 포함되어 있습니다.
Abstract
Electrospinning은 나노 규모의 섬유 마이크로로 생산을위한 기법입니다. 섬유는 높은 완전히 무작위로 정렬에서 정렬의 학위를 변화와 electrospun 수 있습니다. 또한, 섬유 등 폴리 - L - 젖산 (PLLA)와 같은 생분해성 고분자를 포함하여 재료의 다양한에서 냈지 수 있습니다. 이러한 특성은 조직 공학 비계의 다양한 어플 리케이션에 적합한 electrospun 섬유를합니다. 우리의 초점은 신경 재생에 대한 정렬 electrospun 섬유의 사용에 있습니다. 우리는 이전에 정렬 electrospun PLLA 섬유는 체외에서 모두 기본 감각과 운동 신경의 가지를 직접 것으로 나타났습니다. 우리는 밀접하게 가능한 생체내에있는 모델을 실제 뉴런에 biomaterials을 평가할 때 기본 세포 배양 시스템의 사용이 필수적입니다 유지합니다. 여기, 우리는 섬유 공사장 공중 발판과 문화 등의 루트 신경의 explants뿐만 아니라 electrospun의 공사장 공중 발판 dissociated 감각과 운동 뉴런을 electrospin 우리의 실험실에서 사용되는 기법을 설명합니다. 그러나, electrospinning 및 / 또는 여기에 소개 문화 기술은 쉽게 다른 응용 프로그램에서 사용하기 위해 적응하고 있습니다.
Protocol
1. 솔루션 스피닝 폴리 - L - 젖산 (PLLA)
- 낮은 열 이상의 감동으로 9 ML 클로로포름에 0.4 g PLLA을 디졸브.
- DMF 9시 1분 (V / V) : 클로로포름에 4% PLLA (W / V)로 솔루션의 최종 농도를 데리고, 솔루션 1 ML의 dimethylformamide를 추가합니다.
- 뭉툭한 23ga 금속 팁이있는 폴리 프로필렌이나 유리 주사기의 솔루션을 놓으십시오.
2. 기판 준비 1 스피닝
- 낮은 열 이상의 감동에 의해 클로로포름에 85:15 PLGA의 8 % (W / V) 솔루션 (폴리 - 락트 - 공동 glycolic 수 소산)합니다.
- PLGA 솔루션으로 각 표지 전표의 표면을 커버하여 PLGA의 외투 깨끗한 유리 커버 풀렸는데. PLGA는 박막 (약 30 분)로 건조 수 있습니다.
3. Electrospinning이
- 보안 PLGA 코팅 유리 커버 전도성 카본 테이프 수집기에 전표. 정렬된 섬유 들어, 컬렉터는 모터 구동 바퀴입니다. 임의 섬유 들어, 컬렉터는 고정 플레이트입니다.
- 컬렉터 휠에서 팁 20cm와 펌프에 넣어 주사기. 약 2 ML / 시간에 펌프를 설정하고 바퀴를 사용하여 300-400 RPM으로 모터를 설정하는 경우. 가능하면, -2 KV 직류 수집기에 바이어스와 15 KV 금속 팁로 적용됩니다. 바이폴라 전원 공급 장치에 대한 액세스 권한이없는에서는 수집기를 지상.
- 섬유 주사기 팁에서 제트와 회전 바퀴를 수집합니다. 섬유 원하는 밀도를 얻을 때까지 회전을 계속합니다. 문지은 종이 타월로 금속 팁 정기적으로 끝에 막히는 것을 방지하기 위해 비 전도성 막대에 붙인.
4. 1 Moating
- 다음 회전, 커버 슬립의 주위에 PLGA의 라인을 pipetting하여 '해자'electrospun 샘플. PLGA 건조하도록 허용합니다. 이것은 문화 중에 섬유의 정렬을 유지합니다.
5. 단백질 코팅
- Electrospun 섬유 및 유리 컨트롤은 세포 배양하기 전에 단백질 코팅해야합니다. 적어도 한 시간 동안 단백질 용액에 기판을 커버하고 초과 솔루션을 기음과 기판 건조 때까지 aspirating 계속합니다. 가능한 단백질 솔루션은 다음과 같습니다 : PLL (폴리 - L - 라이신) (100 μg / ML), laminin (25 μg / ML) 또는 fibronectin (50 μg / ML). PLL을 사용하는 경우, 기판은 무균 물에 씻어서 초기 코팅 다음 번 건조해야합니다.
6. E15 랫 태아에게 3 획득
* 모든 실험은 관리와 같은 동물의 사용 및 관리에 대한 미시간위원회의 대학에 의해 승인된 실험실 동물의 사용에 대한 NIH 가이드에 따라 수행되었다.
- 준비 : 동물이 임신 있는지 확인하십시오. 3 ML 트립신, 3 ML FBS 및 L15의 따뜻한 한 병 해동. 화재 파스퇴르 피펫을 폴란드어. 30 분 70 % 에탄올의 모든 수술기구를 소독.
- (표 1 참조) 도금 미디어를 준비하고 따뜻하게.
- 안락사 : 마취제 / xylazine의 IP 주사를 수행합니다. 10-15분 후에 각막의 부족 확인하고 인출 반사 신경 페달. 반사 신경이 부재되면, pentobarbital (FatalPlus)의 IC 주사를 수행합니다.
- 텐트 복부의 피부를. 복강을 노출하기 위해 피부와 근육층을 통해 잘라. 자궁을 찾아 자궁 경부와 난소에서 그것을 분리합니다.
- 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 따뜻한 L15에 바로 놓으십시오. (모든 다음 절차는 해부 현미경 및 배아에 따라 완료하고 해부하는 코드는 항상 따뜻한 L15에 빠져들해야합니다.) 턱 주위 포셉을 폐쇄하고 아래 후두 골이 두개골에 의해 배아 목을 벨.
7. 해부 3
- 한쪽에있는 배아를 놓습니다. 다리와 복부 장기를 벗겨 다른 세트를 사용하는 동안 포셉 한 세트로 척수를 보호합니다.
- 배아를 켜고 포셉 한 세트로 잡을. 전체 코드가 노출 때까지 목에 꼬리로 배아의 길이를 따라 싹둑.
- 조심스럽게 코드의 끝 부분을 파악하고 제거하는 꼬리쪽으로 자체를 통해 그것을 당겨. 코드가 막과 지느러미 루트 신경 (DRG) 첨부와 함께 무료로 끌어 것입니다.
- explant 또는 dissociated 감각 신경 세포의 문화를 DRG하면 수행되어야하는 경우, 코드에서 DRG를 싹둑 따뜻한 L15의 신선한 요리로 전송할 수 있습니다.
- explant 문화를 DRG 들어, 10.2 단계로 건너 뜁니다
- dissociated 감각 신경 세포 배양을위한 9 단계로 건너 뜁니다
- 모터 신경 세포의 문화, DRG는 7.5 단계에서 막과 함께 제거됩니다
- 긴 양말을 제거하기 위해 유사한 코드의 맨 끝에 쥐고 그것을 아래로 필링하여 척수에서 멤브레인를 제거합니다. 모든 배아에 대한 반복하고 소형 (2-3 ㎜) 조각으로 코드를 들어온다.
- 펠렛 조각에 2-3 분 1,000 RPM에서 원뿔과 스핀에 다진 코드와 L15 하거라.
- 뜨는을 붓고하고 pelleted 코드에 트립신 3 ML를 추가합니다. 20 분 37 ° C의 물을 욕조에 품어.
- 원뿔 다시 펠렛으로 2-3 분 1,000 RPM에서 스핀 3 ML FBS를 추가합니다.
- 뜨는와 코트 FBS와 화재 광택 파스퇴르 피펫을 하거라.
- 원뿔 하나 파스퇴르 피펫 - L15의 완전을 추가하고 솔루션은 눈에 띄는 대단히 짧은 시간과 동질 때까지 부드럽게 가루로 빻다. 거품을 피하십시오.
- L15의 Optiprep의 9 % 용액을 준비합니다. 생명의 배아 (배아의 홀수가있다면, 최대 원형)에 대한 Optiprep 솔루션 3 ML 하나의 튜브를 준비합니다.
- 모든 튜브 사이에 균등하게 그것을 나누어, Optiprep 솔루션에 균질 솔루션을 놓으십시오. 15 분 2000 RPM에서 튜브를 스핀.
- 조심스럽게 50 ML 원뿔 각 관과 수영장에서 최고 2 ML를 수집합니다. Optiprep의 세포를 씻어 5 분 1,000 RPM에서 L15과 스핀으로 원뿔을 입력합니다.
- 뜨는을 붓고 및 도금 미디어 (250-500 μl)의 소량의 세포를 resuspend. 라이브 세포를 식별하는 trypan 파랑 배제를 사용하여 셀을 계산합니다. 10.1 단계로 건너 뜁니다
9. 감각 신경 세포 (SN) 가공 7
- 펠렛 조각에 2-3 분 1,000 RPM에서 원뿔 관과 스핀으로 척추 코드와 L15 제거 DRG 하거라.
- 뜨는을 붓고하고 pelleted DRG에 트립신 3 ML를 추가합니다. 10 분 37 ° C의 물을 욕조에 품어.
- 원뿔 다시 펠렛으로 2-3 분 1,000 RPM에서 스핀 3 ML FBS를 추가합니다.
- 뜨는와 코트 FBS와 화재 광택 파스퇴르 피펫을 하거라.
- 원뿔 하나 파스퇴르 피펫 - L15의 완전을 추가하고 솔루션은 눈에 띄는 대단히 짧은 시간과 동질 때까지 부드럽게 가루로 빻다. 거품을 피하십시오.
- 5 분 1,000 RPM의 homogenate를 스핀. 뜨는을 붓고 및 SN 도금 미디어 (250-500 μl)의 소량의 세포를 resuspend. 라이브 세포를 식별하는 trypan 파랑 배제를 사용하여 셀을 계산합니다. 10.1 단계로 진행
10. 도금 문화
- : dissociated SN 또는 MN 문화
- 미디어 몇 방울로 기판을 커버하는 것은 다음 세포 현탁액의 적절한 볼륨을 추가합니다. Dissociated 세포는 저밀도 (25-50 셀 / mm 2) 도금되어야합니다. 세포 미디어 우물 홍수 전에 적어도 한 시간 준수하도록 허용합니다.
- explant 문화를 DRG 경우 :
- 미디어 몇 방울로 기판 커버는 다음 미디어에 DRG 추가할 수 있습니다. 그들이 골고루 기판 (약 4 DRG는 22x22 mm 커버 슬립에 맞게)를 통해 배포됩니다 그래서 DRG를 정렬. DRG 미디어와 우물 홍수 전 최소한 4 시간에 대한 준수하도록 허용합니다.
- 문화가 미디어 변화없이 사일을 위해 유지하실 수 있습니다. 더 이상 문화 절반 미디어 변경 피드 매체와 완료해야합니다. 피드 미디어 도금 미디어 마이너스 L - 글루타민과 같은 구성입니다.
11. Immunocytochemistry 1,5,8
- 세포를 고정 : 대기음 미디어는 30 분 따뜻한 4퍼센트 PFA (paraformaldehyde)로 대체합니다. 그런 다음 배 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다.
- / permeabilization를 차단하면 차단 / 파마 솔루션 (1X PBS에서 알부민 1.25 % 소 혈청, 0.05 % 트리톤 X - 100과 2.0 % 정상 염소 혈청)를 준비합니다. 대기음 PBS는 30 분 동안 샘플 차단 / 파마 솔루션을 적용할 수 있습니다. 다음 1X 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다.
- 차 항체 : 항체 기본 작업 솔루션을 준비 (10 % 정상 염소 혈청, 1.25 % 소 혈청 알부민, 0.1 % 나 azide, 1X PBS로 0.05 % 트리톤 X - 100 10 ML). (표 2 참조) 기본 항체의 적절한 금액을 추가합니다. parafilm과 일치 여러 요리. 각 기판에 대한 parafilm에 기본 항체 솔루션의 200μl 비드를 놓습니다. 기판 반전, 하룻밤 차 항체 작업 솔루션을 그들에게 휴대 쪽 떠내려하기 (객실 에어컨하거나 특히 건조한 경우에, 물, 포화 종이가 작업 솔루션의 증발을 방지하기 위해 요리의 코너에 추가할 수 있습니다) .
- 차 항체 (작업 솔루션 ° 4 저장, C를 수집하고 활용할 수 있습니다) 기본에서 기판을 제거하고 2X 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. 4 시간을위한 PBS (또한 parafilm 줄지어 접시에 거꾸로)에서 1:200 희석 200 μl 차 항체를 적용합니다.
- 보조에서 제거 후 배 5 분 1X PBS의 세척을 수행합니다. 와 슬라이드 마운트 기판은 DAPI 또는 다른 적합한 핵 카운터를 포함하는 골드 얼룩 연장.
12. 대표 결과 :
정렬 및 무작위 엘의 전형적인 형태ectrospun 섬유는 그림 1에 표시됩니다. 우리는 일반적으로이 프로토콜과 함께> 90 % 7,8 뉴런의 MN 순도를 얻을 우리는 어떤 중요한 fibroblast의 성장없이 한 것과 주일 동안 문화를 DRG 유지합니다. 그림 2는 문화와 immunostaining의 24 시간 이후 유리 섬유 전형 MN의 모습을 보여줍니다. 유리 섬유에 사흘 동안 교양 Immunostained DRG는 그림 3에 그려져 있습니다.
그림 1. 광섬유 정렬은 컬렉터의 선택에 의해 조작할 수 있습니다. A.)) 회전 바퀴 수집기와 B에 늘인 섬유 연합 무작위 섬유는 고정 플레이트 수집기에 불러 냈어요. 스케일 바 = 20 μm의.
그림 2.) PLL 코팅 A.에 대한 문화의 24 시간 이후 TuJ1 (녹색) 및 DAPI (파란색)에 대한 섬유와 B를 스테인드 대표 모터 뉴런) 유리. 스케일 바 = 20 μm의.
그림 3. PLL 코팅 A.에 대한 문화의 3 일 후에 neurofilament에 대한 대표 DRG 자국 (녹색)) 유리와 B.) 섬유. 스케일 바 = 200 μm의.
| 증권 솔루션 : | MN 미디어 : | DRG / SN 미디어 : |
| 10 MG ML -1 알부민 | 12.5 μl | - |
| 10 MG ML -1 APO - 트랜스페린 | 50 μl | 40 μl |
| 50 μg ML -1 β - estradiol | 2.7 μl | 2.2 μl |
| 0.1 MG ML -1 비오틴 | 50 μl | - |
| 16 MG ML -1 카탈 라 아제 | μl 8 | - |
| 15 MG ML D - 갈락토 오스 -1 | 50 μl | - |
| 50 μg ML -1 하이드로코티손 | 3.7 μl | 2.9 μl |
| 0.63 MG ML -1 progesterone | 0.5 μl | - |
| 16 MG ML -1 putrescine | 50 μl | - |
| 50 μg ML -1 셀레늄 | 3.4 μl | 4.1 μl |
| 2.5 MG ML -1 초과 산화물의 dismutase | 50 μl | - |
| * 500 NG ML -1 신경 성장 인자 | - | 1 ML |
| * 100X PSN | 0.5 ML | 0.5 ML |
| * B27 | 1 ML | 1 ML |
| * 2 MM L - 글루타민 | 35 μl | 35 μl |
| * Neurobasal | 50 ML에 | 50 ML에 |
표 1. 사용하기 직전 미디어 (*) 구성 요소를 별표를 추가합니다. 나머지 구성 요소는 주식 솔루션으로 준비하고 6,7 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관하실 수 있습니다.
| 차 (농도) | 뉴런 : | Glia : | 섬유아 세포 : |
| 안티 - β - tubulin (TuJ1) (1:1000) | ✓ | 엑스 | 엑스 |
| 안티 neurofilament (1:1000) | ✓ | 엑스 | 엑스 |
| 안티 - S - 100 (1:250) | 엑스 | ✓ | ✓ |
| 안티 NGFR p75 (1:500) | ✓ | ✓ | 엑스 |
표 2. 차 항체의 선택은 조사의 목적에 따라 달라집니다. 위의 몇 가지 항체와 우리 연구실에 성공 사용한 농도입니다. S - 100은 Schwann 세포 및 / 식별하거나 섬유아 세포를 오염 확인하지만, 그것이 glia와 fibroblasts4을 구별하기 NGFR p75와 함께 사용해야합니다 특히 유용합니다. 우리는 또한 목표가 개별 neurites을 시각화하는 경우 neurofilament 또는 TuJ1이 우수한 선택하는 동안 NGFR p75 얼룩이 매우 가볍게 neurites 것으로 나타났습니다.
Discussion
이 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 electrospun 섬유 기판의 적절한 생산을 포함한다. 액체 미디어, PLLA 섬유, PLGA 필름과 PLGA의 해자는 단일 단위로 유리 커버 슬립에서 분리합니다. PLGA가 생략되면, PLLA 섬유 평면 시트 유지되지 않습니다 - 그들은 사용할 수 없게 탱글로 내면됩니다. 따라서 PLGA 필름은 문화 중 광섬유 정렬을 유지하기 위해 적당한 기판으로 포함되어 있습니다. 해자는 섬유가 안전하게 PLGA 필름으로 고정되고 필름 구조적 강성을 추가할 수 있도록 모두 회전 후 추가됩니다. 기판은, 고정 얼룩 및 장착 중에 조작하는 경우 해자는 또한 유용한 손잡이 역할을합니다. 가루약 두 번째 중요한 단계입니다. 모든 노력은 거품의 형성을 피하기 위해하여야한다. 불타는 광택 피펫이 단계에 사용되는 경우 또한, 우리는 훨씬 높은 수익률을 획득했습니다. 폴란드어 화재, 알콜 램프를 조명하고 피펫에 전구를 연결합니다. 지속적으로 압박하고 전구를 발표하면서 불꽃을 통해 신속하게 2-3 번 피펫의 팁을 패스 - 피펫을 통해 공기 흐름을 완전히 닫는에서 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. 구멍이 아직 열려 있도록 피펫의 팁을 확인하고 사용하기 전에 약간 둥글게 가장자리가 보인다.
Electrospinning은 매우 다양한 과정, electrospinning 매개 변수가 morphologies의 다양한 섬유를 생산하는 수정할 수 있습니다. 탄 외. (2005) 자세한 내용 PLLA electrospun 섬유의 직경에 영향을 미치는 매개 변수의 체계적 연구를. 왕 외. (2009) electrospun PLLA 섬유의 정렬에 영향을 미치는 매개 변수에 대한 자세한 연구를 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
NIH K08 EB003996
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apo-transferrin | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotin | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Superoxide dismutase | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamine | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsin | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Anti-neurofilament | EMD Millipore | AB1987 | |
| Anti-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Anti-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Carbon tape | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
References
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