Summary
Este protocolo describe la preparación de un sustrato sintético para el tRNA
Abstract
Parásitos protozoarios se encuentran entre los agentes infecciosos más devastadores de los seres humanos responsables de una variedad de enfermedades, incluyendo la amibiasis, la cual es una de las tres causas más comunes de muerte por enfermedades parasitarias. El agente de la amibiasis es la ameba Entamoeba histolytica parásito que existe en dos etapas: el quiste infeccioso en los alimentos o el agua y la vida trofozoíto invasivo en el intestino. Las manifestaciones clínicas de la amebiasis de ser asintomática hasta abscesos colitis, disentería o el hígado. E. histolytica es uno de los raros parásito unicelular con 5-metilcitosina (5mC) en su genoma. 1, 2 contiene un ADN único metiltransferasa, Ehmeth, que pertenece a la familia Dnmt2. 2 El papel de Dnmt2 en el control de elementos repetitivos se ha establecido en E. histolytica, 3 discoideum Dictyostelium 4,5 y Drosophila. 6 Nuestro trabajo reciente ha demostrado que Ehmeth metila tRNA Asp, y este hallazgo indica que esta enzima tiene un ADN de doble / tRNA Asp actividad metiltransferasa. 7 Esta observación está de acuerdo con la doble actividad que se ha informado de D. discoideum y D. melanogaster. 8 La importancia funcional de la especificidad ADN / tRNA de Dnmt2 enzimas es aún desconocido. Para abordar esta cuestión, un método para determinar la actividad de la metiltransferasa tRNA Dnmt2 proteínas se estableció. En este video, se describe un método sencillo para preparar un sustrato adecuado para el tRNA Dnmt2 y un método para medir su actividad tRNA metiltransferasa.
Protocol
Requisito previo antes de iniciar el experimento:
- RNasa libre de agua se utiliza en el manejo de ARN en el laboratorio para reducir el riesgo de ARN siendo degradados por RNasas. Para ello, el agua se trata con v / v 0,1% dietilpirocarbonato (DEPC) durante al menos 1 hora a 37 ° C y luego en autoclave (por lo menos 15 minutos) para inactivar los restos de DEPC.
- Pipetas Pipetman se limpian con una solución descontaminante RNasa (RNasa exterminador, Industria Biológica Beit Haemek) antes de su uso.
- Tubos Eppendorf y consejos deben ser certificados como libres de DNasa y RNasa para preservar la integridad de la muestra.
1. tRNA Asp Preparación
Este procedimiento describe un in vitro segunda vuelta de la transcripción que puede ser utilizado para la síntesis de los tRNA. Este procedimiento es una adaptación del método de ribozima publicó anteriormente con el 9. Para ello se diseñó un modelo que consiste en el promotor T7 y las secuencias complementarias de una ribozima auto-cleaving martillo y el tRNA requiere. La transcripción de esta plantilla de resultados en un producto de sí mismo cortando a los 5 'de fin de una manera que el tRNA de larga duración se obtiene con un 5 `-OH en lugar de un fosforilado 5`-end. El tRNA de larga duración puede ser purificado de escindirse ribozima cabeza de martillo y productos uncleaved de urea-PAGE.
- PCR Primer y de la plantilla:
Con el fin de obtener una plantilla eficiente para T7 RNA polimerasa mediada por la transcripción in vitro tres requisitos se deben cumplir.- La secuencia T7-promotor (5 `-TAATACGACTCACTATA-3 ') tiene que estar implicado en la plantilla.
- Para aumentar la eficacia de la transcripción, los primeros tres nucleótidos del ARN transcrito debe guanosina.
- La secuencia correcta complementaria del tRNA específico que se necesita.
- PCR
Para la amplificación de ADN, se utilizó un estándar de la reacción de PCR en un volumen final de 50 mL. La tabla 1 detalla las concentraciones finales (reacción preparada en el hielo) y el programa para la PCR. La baja temperatura de recocido utilizado durante las primeras 10 cuentas de los ciclos de la unión solamente parcial de la cartilla con interés a la plantilla de ADN. Para reducir inespecíficos vinculante de la temperatura de hibridación se incrementó de más de 25 ciclos de amplificación.
El éxito de la ampliación de plantilla se puso a prueba por un 1,3% en gel de agarosa prestained con 1X solución GelRed (Figura 2). - Transcripción
- Premezcla T7 se puede preparar concentrado 5x (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, espermidina 1 mM, DTT 5 mM, 2 mg / ml de BSA y 0,01% de Triton X-100) y se utilizó por lo menos un semana o cinco ciclos de congelación y descongelación.
- La mezcla de la transcripción tiene que estar preparado a temperatura ambiente.
- Reacciones de transcripción se prepararon con 80 l de premezcla T7, 80 l producto de PCR, 80 l de mezcla NTP (25 mM) y se ajusta a 385 ml con agua MilliQ. 15 l (1,34 mg / mL) T7 RNA polimerasa (concentración final de 0,05 mg / l) se añaden para iniciar la reacción.
- La reacción se llevó a cabo durante 4 horas a 37 º C. El precipitado blanco indica la transcripción de pirofosfato de éxito.
- Purificación
- Pirofosfato se centrifugó durante 1 minuto a 10.000 rpm.
- Sobrenadantes se suministra con un volumen de carga de tintes formamid y propósitosficados en un 12% de urea-PAGE con 20 W durante 2 horas. Desmontar el gel y lo coloca en el abrigo de saran.
- Tinción del gel con una solución de 3XGelRed suplementado con 0,1 M de NaCl durante 20 minutos. La excitación UV, sello de la banda tRNA en el abrigo de saran con un marcador permanente para la escisión posterior. Alternativamente, si el rendimiento esperado es superior a 50 mg bandas pueden ser vistos por la radiación UV-sombra. Por UV-sombra, colocar el gel en una placa de cromatografía en capa fina fluorescentes e iluminar con UV con lámpara de mano desde arriba. Las bandas de la etiqueta, que aparecen como no fluorescente sombras en el gel (Figura 3), para la escisión posterior.
- tRNA bandas fueron extirpados con un bisturí y poner en vasos de 1,5 ml Eppendorf.
- Después de la adición de 450 l de 0,5 M de NH 4 OAc las muestras se congelan a -80 ° C durante 2 horas y después se incuba a 20 ° C, agitando con 550 rpm en un Thermoshaker Eppendorf durante la noche. 6. El sobrenadante NH 4 OAc soluciones desde el punto 5 se filtran con Nanosep tubos (0,45 m), girando 90 segundos a 8500 rpm para eliminar los restos PAGE.
- La precipitación de los tRNAs eluido se llevó a cabo mediante la adición de 2,5 volúmenes de -80 ° C etanol puro (PA), el almacenamiento a -20 ° C durante la noche y centrifugación h 2,5 a 4 ° C y 15.500 rpm.
- Después de quitar las pastillas sobrenadante se secaron en una SpeedVac y resuspendido en agua MilliQ.
- Las concentraciones se determinaron mediante un Nanodrop-ND1000. El rendimiento de un 400 l de transcripción fue cerca de 80-100 mg.
Solución de problemas:
- Ningún producto de PCR. → ¿La secuencia de los cebadores y la plantilla y son compatibles con todos los componentes dentro de la mezcla de reacción?
- Ningún producto de la transcripción. → PCR podría haber tenido éxito. Correcta secuencia promotora T7-. Soluciones demasiado frío mientras se prepara la reacción. T7 demasiado viejo premezcla.
- Producto en el gel, pero no producto eluido. → El etanol para la precipitación no enfría lo suficiente, no es puro, no el volumen correcto.
2. Expresión y purificación de la recombinante E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) La proteína en E. coli BL21
Este protocolo también es adecuado para la preparación de proteínas de Dnmt2 humanos 10 y Drosophila. 11
- La E. histolytica Ehmeth gen fue amplificado por PCR, clonado en pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) y se verificó con la secuencia
- El plásmido recombinante se transformó en E. coli (BL21) para la expresión de proteínas recombinantes.
- Bacterias transformadas se seleccionaron en Luria-Bertani (LB) agar ampicilina (100 mg / mL) medio. De cuatro a cinco colonias fueron recogidos y se inoculó en 5 ml de medio LB con marcador adecuado selectivo (100 mg / ml ampicilina) y se incubó durante la noche en un agitador orbital a 37 º C.
- La cultura crecido durante la noche se inoculó en 500 ml de extracto de levadura 2X triptona (2XYT) medio con 100 ug / ml ampicilina, y se incubaron en un agitador orbital a 37 º C hasta los 600 OD de la cultura llegó a 0,8.
- La expresión de la proteína recombinante Dnmt2 fue inducida por la adición de isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM a la cultura. El cultivo se incubó más en un agitador orbital durante 16 horas a 24 ° C. El tiempo y la temperatura de incubación se han optimizado para evitar la formación de cuerpos de inclusión.
- El cultivo se centrifugó a 4 º C, 6.000 rpm, en 200 ml de tubos de Nalgene de 15 minutos. El sobrenadante fue descartado y el pellet fue congelado a -70 ° C durante al menos 1 hora. Este paso de congelación mejora la lisis de las bacterias.
- El pellet se cosecha en 30 ml de solución amortiguadora de lisis (100 mM KCl, 1mM DTT, 1 mM PMSF, 100 ug / ml lisozima y Leupeptine 100 ug / ml en tampón fosfato salino (PBS)). Desde este punto, es fundamental para mantener el lisado en hielo para evitar la inactivación de la proteína recombinante. El lisado se sonicated en un baño de agua helada en el ajuste no. 4 de un MSE (Londres, Reino Unido) Sonifier (alta potencia, amplitud de 5, 30 pulso segundos, 30 segundos de descanso de 5 minutos). ADN de la bacteria que puede estar unido a Ehmeth se retiró con Benzonase nucleasa (Novagen) Tratamiento (5 U / mL de lisado sonicado), durante 30 minutos en hielo. La lisis se completó con la adición de 300 l de reactivo de extracción BugBuster proteína (Novagen) durante 30 minutos a 4 ° C con agitación suave en un agitador orbital (100 rpm).
- El recombinante GST-Ehmeth proteína se purificó en condiciones nativas en una resina de glutation-agarosa de acuerdo a las instrucciones de fabrica (Sigma). De 25 mL de lisado, 500 l de suspensión de partículas de resina y se incubaron a 24 º C durante 1 hora.
- Las bolas se lavaron dos veces con solución amortiguadora de lisis (10 volúmenes de tampón de lisis por volumen de cuentas) y 6 veces con PBS frío. Estos pasos de lavado amplio seguroe que no se quedará de Benzonase antes de la etapa de elución.
- Proteína recombinante Ehmeth se eluyó de las perlas de glutatión agarosa mediante la incubación de las cuentas con 5 ml de tampón de elución de glutatión (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, el glutatión (Sigma) 10 mM) durante 12 horas a 4 ° C con rotación suave. Las cuentas fueron retirados por centrifugación (2.000 rpm, 5 minutos) y el sobrenadante se recogió.
- El tampón de elución en el sobrenadante fue sustituido por un tampón de almacenamiento (KCl 200 mM, EDTA 10 mM, 0,1 mM DTT, glicerol 60% en PBS). Para este propósito, 5 ml de sobrenadante se cargó en la parte superior un Millipore Microcon YM-30 dispositivos de centrífuga de filtro (30 kDa cortar la columna) y se centrifuga a 8.000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. El concentrado de proteínas se diluyó en tampón de almacenamiento (5 ml) y se vuelve a cargar en el dispositivo de filtro. El mismo procedimiento se debe repetir por lo menos 3 veces para asegurar la sustitución completa del tampón de elución por el buffer de almacenamiento. Por último, la proteína concentrada debe ser diluida en aproximadamente 300 l de buffer de almacenamiento.
- La concentración de la proteína recombinante se midió mediante un ensayo de proteínas Bradford. La preparación de la enzima recombinante se almacenó a -20 ° C. La concentración final de la enzima no debe ser inferior a 3 mg / l en una concentración adecuada para el análisis de metilación.
- La preparación de proteínas fue verificada por SDS-PAGE.
Aviso: para asegurar la preparación de una enzima activa, todos los pasos de purificación se debe hacer sobre el hielo y la TDT debe estar recién preparado y se agrega a la memoria intermedia de almacenamiento. Esto asegura una enzima activa durante 6 meses.
3. Ensayo in vitro de metilación TRNA
Soluciones y reactivos que se deben preparar:
- 1 M solución de tris (hidroximetil) aminometano. Ajustar el pH de la solución a 8,0 con ácido clorhídrico (HCl).
- La metilación 5X buffer (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NH 4 OAc, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. El MB se pueden preparar con antelación y almacenadas a -20 ° C sin ditiotreitol (DTT).
- Prepare la etiqueta S-adenosilmetionina (AdoMet) acciones (concentración final 1,5 mM) mediante la mezcla de 5 l AdoMet (New England Biolabs, 32 mM de concentración) con 101,67 ml de agua destilada.
- 5% de solución de ácido tricloroacético (TCA)
- 100% de etanol
- Centelleo líquido 3 ml por vial.
El ensayo:
- Un esquema de pipeteado se prepara (Tabla 2) para un volumen de 40 l final del ensayo de metilación.
- En un tubo de 1,5 ml Eppendorf, tRNA se diluyó con agua tratada con DEPC a una concentración final de 5 M (1 g tRNA es equivalente a 40 pmol)
- 4 l de la TDT se añadió (concentración de la solución) a 8 L de solución 5XMB.
- La solución de tRNA se incubó a 85 ° C durante 2 minutos y la solución preparada en el paso 3 se añadió de inmediato a la misma. La mezcla se deja enfriar a temperatura ambiente durante 15 minutos para que el pliegue tRNA correctamente.
- La mezcla de AdoMet (concentración final 200 mM) se preparó mezclando 50 M de la etiqueta AdoMet (250 Ci, Ci 10,0 / mmol, PerkinElmer) con 150 M de la etiqueta de AdoMet. Para una mezcla AdoMet adecuado para 10 reacciones de etiquetado, se mezclan 5,2 l de la etiqueta de AdoMet (a partir de la solución diluida), 29 l de AdoMet etiquetados y 5,8 l de agua destilada.
- 4 l de la mezcla preparada anteriormente AdoMet se añadió a la solución de tRNA y se incubó durante 2 minutos a 37 ° C.
- El tRNA metiltransferasa Ehmeth, (la concentración final de M 1-10) se añadió a la solución que contiene el sustrato tRNA y el cofactor etiqueta-etiqueta AdoMet. La mezcla se incubó durante 3 horas a 37 º C. Los tubos se mezclaron con regularidad durante el tiempo de la incubación de mover de un tirón suavemente. Una curva de cinética de la reacción enzimática se construyó tomando cada 20 minutos una muestra (8 l) de la mezcla de reacción durante un período de tres horas.
- Cada muestra fue visto inmediatamente en el centro de un filtro Whatman (0,5 cm de diámetro) y el filtro se sumergen en una solución al 5% TCA y agitado en hielo durante 10 minutos (a excepción de la muestra AdoMet, el cuadro 2 de la columna E que no se debe lavado). La etapa de lavado con solución al 5% TCA se repitió dos veces más
- El filtro se lavó con etanol al 100% en hielo durante 10 minutos.
- El filtro fue secado al aire durante un mínimo de 20 minutos.
- Cada filtro seco se colocó en un tubo (especificación) que fue llenado previamente con 3 ml de líquido de centelleo (CytoScint)
- La radiactividad incorporada en el tRNA estaba usando un contador de centelleo (contador beta Tri-Carb 2100TR).
4. Solución de problemas
- Los valores altos en la columna A o B (Tabla 3), los valores de la muestra de control fueron similares a las esperadas de la metilación reacción en la columna C o D (Tabla 3) → los filtros no se lavan correctamente.
- Los valores bajos en la columna C o D (Tabla 3), los experimentos de metilación tuvieron valores similares a la reacción de control de la columna A o B (Tabla 3) → la enzima no se prepara correctamente, lo que significa que no hubo incorporación AdoMet. Otra opción es que el tRNA fue degradado y no era un sustrato adecuado para la enzima, esto se puede comprobar mediante la ejecución de la muestra tRNA en un gel de acrilamida urea (ver 1.2) y la tinción del gel con bromuro de etidio para examinar la integridad de los tRNA .
- Los valores bajos en la columna D (Tabla 3) → ya que la actividad de Ehmeth es más débil entonces hDnmt2 el rendimiento de las enzimas puede ser mejorada mediante el aumento de la concentración de la TDT en el tampón de almacenamiento (puede variar entre 1 a 10 mm) o para aumentar la concentración de la enzima de paliar la mala calidad de la enzima.
- Los valores bajos de la columna E (Tabla 3) → esta columna representa la radioactividad total del valor de AdoMet etiqueta (en adelante, 100%), si el valor de esta columna es baja, significa que el AdoMet ya no está activa y ha perdido su radioactividad.
5. Resultados representante
| Reactivo | La concentración final | PCR - programa | |||||
| Gentherm PCR Buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl2 | 3,0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| Mezcla de dNTP | 1,2 mM | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Plantilla de ADN | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Primer avance | 3,0 M | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Primer inversa | 3,0 M | 2.-4. 10 ciclos | 5.-7. 25 ciclos | ||||
| Taq polimerasa | 0,1 U / l | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Anuncio 50 l | tapa de 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabla 1: Esquema de una pipeta de PCR y PCR programa.
A | B Control negativo (TRNA solamente) | C Control positivo con humanos Dnmt2 | D La reacción estándar (Enz + Sust + Cof) | E Valor total de la AdoMet en el filtro | |
| tRNA | - | (3 mg) | (3 mg) | (3 mg) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 mg) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 mg) | (2,48 mg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| TDT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Total | 40 l | 40 l | 40 l | 40 l | 1 l |
Tabla 2:. Ejemplo de esquema de pipeteado Cada columna en el esquema representa una muestra.
* Ambos Ehmeth hDnmt2 y se fundieron en una etiqueta GST con un tamaño estimado de la proteína de 62 kDa.
A-Control negativo que incluye sólo Ehmeth.
B-Control negativo que incluye sólo tRNA.
C-control positivo con Dnmt2 humanos. Esta enzima tiene diez veces más unactividad que Ehmeth
D-estándar, que incluye la reacción de la enzima, el sustrato y el cofactor
E-Valor total de la AdoMet en el filtro. Este valor se utiliza para el cálculo del porcentaje del grupo metilo incorporado.
| A Control negativo (Ehmeth solamente) | B Control negativo (TRNA solamente) | C Control positivo con humanos Dnmt2 | D La reacción estándar (Enz + Sust + Cof) | E Valor total de la AdoMet en el filtro | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tabla 3:. Ejemplo de los valores leídos por el contador de centelleo Cada columna en el esquema representa una muestra de la Tabla 1.
Figura 1: (A) modelo T7 transcripción y cebadores para la transcripción in vitro. Todas las secuencias están escritos en el 5 'a 3' de orientación. ColorCode: véase el texto. (B) Plan de formación de producto durante la transcripción. La transcripción del ARN es sintetizado por la RNA polimerasa T7. Ribozima cabeza de martillo y doble tRNA en sus respectivas estructuras en 2D y ribozima en sí rompe el tRNA dejando un grupo hidroxilo en su extremo 5 '(adaptado de 9).
Figura 2:. Control de la reacción de PCR en un 1,3% en gel de agarosa prestained con 1X GelRed reacciones de PCR en dos diferentes plantillas se muestran junto a 100 pares de bases, más la escalera. Los controles incluyen un "modelo único" de carril y reacciones en las que se omitió el primer inversa.
Figura 3:. UV-remedo de separación de páginas de dos mezclas de transcripción se muestra. Bandas de las transcripciones de los precursores (antes de la escisión), de cuerpo entero tRNA y ribosoma cabeza de martillo se hacen visibles como sombras, ya que evitan que la luz ultravioleta llegue a la placa de TLC fluorescentes. Total de tRNA de E. coli se utiliza como marcador de tamaño.
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Discussion
En esta presentación, se muestra cómo preparar los componentes activos de la medida de la actividad metiltransferasa tRNA de E. histolytica Ehmeth enzima. Este procedimiento puede servir como punto de partida y ser fácilmente adaptado a la medida de las metiltransferasas tRNA otros. Es importante seguir los procedimientos que permiten preservar la calidad y la integridad del sustrato tRNA y de la proteína tRNA metiltransferasa para asegurar una medida óptima de la actividad enzimática.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación de Israel Ciencia y el Instituto de la Familia Rappaport de Investigación en Ciencias Médicas, y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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