Summary
Detta protokoll beskriver förberedelserna av ett syntetiskt tRNA substrat för den
Abstract
Protozo parasiter är bland de mest förödande infektioner av människor med ansvar för en rad olika sjukdomar, bland annat amebiasis, som är en av de tre vanligaste dödsorsakerna från parasitsjukdom. Agenten av amebiasis är amöba parasit Entamoeba histolytica som finns i två steg: det smittsamma cysta som finns i mat eller vatten och invasiva trophozoite lever i tarmen. Den kliniska manifestationer av amebiasis variera från att vara asymtomatiska till kolit, dysenteri eller lever abscesser. E. histolytica är en av de få encelliga parasiten med 5-methylcytosine (5mC) i sin arvsmassa. 1, 2 Det innehåller en enda DNA-metyltransferas, Ehmeth, som tillhör Dnmt2 familjen. 2 En roll för Dnmt2 i kontrollen av repetitiva element har fastställts i E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 och Drosophila. 6 Vårt senaste arbete har visat att Ehmeth methylates tRNA Asp, och detta fynd tyder på att detta enzym har en dubbel DNA / tRNA Asp metyltransferas aktivitet. 7 Detta konstaterande är i överensstämmelse med den dubbla verksamheten som har rapporterats för D. discoideum och D. melanogaster. 8 Den funktionella betydelsen av DNA / tRNA-specificiteten hos Dnmt2 enzymer är fortfarande okänd. För att lösa denna fråga, var en metod för att bestämma tRNA metyltransferas aktivitet Dnmt2 proteiner fastställts. I denna video beskriver vi en okomplicerad metod för att förbereda en lämplig tRNA substrat för Dnmt2 och en metod för att mäta sin tRNA metyltransferas aktivitet.
Protocol
Förutsättning innan inleda experiment:
- RNas-fria vatten används i hanteringen av RNA i laboratoriet för att minska risken av RNA som bryts ned av RNaser. För detta ändamål är vatten behandlas vanligtvis med 0,1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) i minst 1 timme vid 37 ° C och därefter autoklaveras (minst 15 min) för att inaktivera spår av DEPC.
- Pipetman pipetter rengörs med en RNas sanering lösning (RNase UTROTARE, biologiska industri Beit Haemek) innan användning.
- Eppendorf-rör och tips bör vara certifierade fri från DNase och RNas att bevara prov integritet.
1. tRNA Asp Förberedelser
Denna procedur beskriver ett in vitro avrinning transkription som kan användas för syntes av tRNA. Detta förfarande är en anpassning av ribozyme metoden publicerats tidigare. 9 För detta ändamål en mall har utformats som består av T7 promotorn och den kompletterande sekvenser av en själv klyva hammarhaj ribozyme och erforderliga tRNA. Transkription av den här mallen resulterar i en produkt som klamrar sig vid 5 `slut på ett sätt som de hellånga tRNA fås med en 5`-OH i stället för en fosforyleras 5 `slut. Den hellånga tRNA kan renas från klyvs hammarhaj ribozyme och uncleaved produkter av urea-PAGE.
- PCR-Primer och Mall Design:
För att få en effektiv mall för T7 RNA-polymeras medierad in vitro transkription tre krav måste uppfyllas.- Den T7-promotor sekvens (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) måste vara inblandad i mallen.
- För att öka transkription effektivitetsskäl bör de första tre nukleotider i transkriberade RNA guanosin.
- Den korrekta kompletterande sekvens av den specifika tRNA behövs.
- PCR
För amplifiering av templat-DNA, använde vi en standard PCR-reaktion i en slutlig volym av 50 mikroliter. Tabell 1 redovisar slutkoncentrationer (reaktion förberedda på is) och program för PCR. Den låga glödgning temperatur används under de första 10 cykler står för den bara delvis binds framåt primer till DNA-mall. För att minska ospecifik bindning av glödgning temperaturen höjdes för ytterligare 25 förstärkning cykler.
Framgången med mallen förstärkning testades med en 1,3% agarosgel prestained med 1X GelRed lösning (Figur 2). - Transkription
- T7 premix kan förberedas 5X koncentrerad (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, 1 mm spermidine, 5 mm DTT, 2 mikrogram / mL BSA och 0,01% Triton X-100) och användes för minst en vecka eller fem frysa cykler tina.
- Transkriptionen blandningen måste vara beredd vid rumstemperatur.
- Transkription reaktioner har sammanställts med 80 mikroliter T7 premix, 80 mikroliter PCR-produkten, 80 mikroliter NTP-mix (25 mm) och justeras till 385 mikroliter med MilliQ vatten. 15 mikroliter (1,34 mg / ml) T7 RNA-polymeras (slutlig koncentration 0,05 mikrogram / l) läggs för att starta reaktionen.
- Reaktionen har genomförts i 4 h vid 37 ° C. Den vita fällningen av pyrofosfat indikerar lyckade transkription.
- Rening
- Pyrophosphate knoppades ner i 1 minut vid 10.000 rpm.
- Supernatanterna försågs med en volym formamid laddningsfärg och renas på ett 12% urea-sida med20 W i 2 timmar. Demontera gelen och placera den på Saran wrap.
- Färga gelen med 3XGelRed lösning kompletteras med 0,1 M NaCl i 20 minuter. Vid UV-excitation, märk tRNA band på Saran wrap med en permanent markör för senare excision. Alternativt kan om den förväntade avkastningen är högre än 50 mikrogram band ses av UV-skuggning. För UV-skugga, placera gelen på en fluorescerande tunnskiktskromatografi tallrik och lysa med en UV-hand-lampa ovanifrån. Etikett band, som visas som icke-fluorescerande skuggor i gelen (Figur 3), för senare excision.
- tRNA banden klippts med en skalpell och tas i 1,5 ml Eppendorf koppar.
- Efter tillsats av 450 mikroliter av 0,5 M NH 4 Oac proverna frysas ned till -80 ° C i 2 timmar och därefter inkuberas vid 20 ° C, skaka med 550 rpm på ett Eppendorf Thermoshaker över natten. 6. Supernatanten NH 4 Oac lösningar från steg 5 filtreras med Nanosep tuber (0,45 mikrometer), spinning 90 sekunder vid 8500 rpm för att ta bort SIDA skräp.
- Utfällning av elueras tRNAs utfördes genom att tillsätta 2,5 volymer av -80 ° C ren etanol (PA), lagring vid -20 ° C över natten och 2,5 h centrifugering vid 4 ° C och 15.500 rpm.
- Efter att supernatanten pellets var torkas i SpeedVac och suspenderade i MilliQ vatten.
- Koncentrationer bestämmas med hjälp av en Nanodrop-ND1000. Avkastningen av en 400 mikroliter transkription var ca 80-100 mikrogram.
Felsökning:
- Inga PCR-produkt. → är sekvensen av primers och mall kompatibla och alla komponenter inne i reaktionsblandningen?
- Inga transkription produkt. → PCR kanske har misslyckats. Korrekt T7-promotor sekvens. Lösningar för kallt medan du förbereder reaktionen. T7 Foder för gammal.
- Produkt på gelen, men ingen eluerade produkt. → Etanol för nederbörd inte tillräckligt kallt, inte ren, inte den rätta volymen.
2. Uttryck och rening av rekombinanta E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Protein i E. coli BL21
Detta protokoll är också lämplig för beredning av Dnmt2 protein från människa 10 och Drosophila. 11
- E. histolytica Ehmeth gen förökas med PCR, klonade i pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) och verifieras med sekvensering
- Det rekombinant plasmid förvandlades till E. coli (BL21) för uttryck av rekombinanta proteiner.
- Omvandlas bakterier valdes ut Luria-Bertani (LB) agar ampicillin (100 mikrogram / ml) medium. Fyra till fem kolonier plockades upp och inokuleras i 5 ml LB-media med passande selektiv markör (100 mikrogram / ml ampicillin) och inkuberas över natten i en roterande skak vid 37 ° C.
- Den kultur vuxit över en natt blev inokuleras i 500 ml 2X Jästextrakt Trypton (2XYT) medium med 100 mikrogram / ml ampicillin, och inkuberas i en oscillerande skak vid 37 ° C tills OD 600 av kulturen nådde 0,8.
- Uttrycket för Dnmt2 rekombinant protein var en följd av att lägga isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) vid en slutlig koncentration av 0,5 mm till kulturen. Kulturen ytterligare inkuberas i en skakapparat i 16 timmar vid 24 ° C. Den tid och temperatur för inkubering har optimerats för att undvika bildandet av inbegripande kroppar.
- Kulturen var centrifugeras vid 4 ° C, 6000 rpm, i 200 ml Nalgene tuber i 15 minuter. Supernatanten var kasseras och pellets frystes vid -70 ° C i minst 1 timme. Denna frysning steg förbättrar lysering av bakterier.
- Pelleten har skördats i 30 ml lyseringsbuffert (100 mM KCl, 1mm DTT, 1mm PMSF, 100 mikrogram / ml Lysozym och Leupeptine 100 mikrogram / ml fosfatbuffert saltlösning (PBS)). Från denna punkt var det viktigt att hålla lysat på is för att förhindra att inaktivering av rekombinant protein. Den lysat var sonicated i en is-vattenbad vid inställning nej. 4 av MSE (London, Förenade kungariket) sonifier (kraft hög amplitud 5, 30 sekunder puls, 30 sekunder vila i 5 minuter). Bakteriellt DNA som kan knytas till Ehmeth togs bort med bensonas nukleasfritt (Novagen) behandling (5 U / mL sonicated lysat), i 30 minuter på is. Lys slutfördes genom tillsats av 300 mikroliter av BugBuster protein Extraktionsreagens (Novagen) under 30 minuter vid 4 ° C under försiktig omrörning på en skakapparat (100 rpm).
- Den rekombinanta GST-Ehmeth protein renas i modersmål villkor på ett glutation-agaros harts enligt tillverkarens anvisningar (Sigma). För 25 ml lysat var 500 mikroliter av slam harts pärlor läggas till och inkuberas vid 24 ° C i 1 timme.
- Kulorna spolades två gånger med lyseringsbuffert (10 volymer av lyseringsbuffert per volym av pärlor) och 6 gånger med kallt PBS. Dessa omfattande tvätta steg försäkra att det inte fanns kvar av bensonas innan elution steg.
- Rekombinant Ehmeth protein elueras från glutation agarosen pärlor genom inkubering av kulor med 5 ml glutation eluering buffert (Tris HCl 50 mM pH 8,0, glutation (Sigma) 10 mm) för 12 timmar vid 4 ° C med varsam rotering. Kulorna togs bort genom centrifugering (2000 rpm, 5 minuter) och supernatanten samlades in.
- Elueringen buffert i supernatanten ersattes av en lagrings buffert (KCl 200 mm, EDTA 10 mm, 0,1 mM DTT, Glycerol 60% i PBS). För detta ändamål var 5 ml av supernatanten lastade ovanpå ett Millipore Microcon YM-30 centrifugal filter enheter (30 kDa avskuren kolumn) och centrifugeras vid 8000 rpm i 20 minuter vid 4 ° C. Koncentratet proteinet späddes i lager buffert (5 ml) och lastas på resp. Samma förfarande bör upprepas minst 3 gånger för att försäkra att fullständigt byta ut elueringen buffert genom lagring buffert. Slutligen koncentrerat protein bör spädas i ungefär 300 mikroliter av lagring buffert.
- Koncentrationen av rekombinant protein mättes med en Bradford protein analys. Den rekombinanta enzympreparat har förvarats vid -20 ° C. Slutlig koncentration av enzymet bör inte vara mindre än 3 mikrogram / mikroliter som en lämplig koncentration för metylering analysen.
- Proteinet förberedelse kontrollerades av SDS-PAGE.
Observera: att försäkra att förbereda ett aktivt enzym, bör alla reningssteg göras på is och DTT bör beredas och läggas till lagring buffert. Detta garanterar ett aktivt enzym i 6 månader.
3. In vitro-tRNA Metylering analys
Lösningar och reagenser som bör vara beredd:
- 1 M lösning av tris (hydroxymetyl) aminomethane. Justera lösningens pH till 8,0 med koncentrerad saltsyra (HCl).
- 5X Metylering buffert (MB): 100 mM Tris pH 8,0, 100mm NH 4 Oac, 0,1 mM EDTA, 10 mm MgCl 2. MB kan förberedas i förväg och förvaras vid -20 ° C utan ditiotreitol (DTT).
- Förbered omärkta S-adenosylmetionin (AdoMet) lager (slutlig koncentration 1,5 mM) genom att blanda 5 mikroliter AdoMet (New England Biolabs, 32 mM koncentration) med 101,67 ml destillerat vatten.
- 5% triklorättiksyrelösning (TCA)
- 100% etanol
- Scintillationsvätska 3 ml per prov flaska.
Analysen:
- En pipeting system är beredd (Tabell 2) för en 40 mikroliter slutlig volym på metylering analys.
- I ett 1,5 ml Eppendorf-rör, var tRNA utspätt med DEPC renat vatten till en slutlig koncentration av 5 mikroM (1μg tRNA motsvarar 40 pmol)
- 4 mikroliter av DTT inkom (koncentration av beståndet lösningen) till 8 mikroliter av 5XMB lösning.
- Den tRNA Lösningen blev inkuberas vid 85 ° C i 2 minuter och den lösning som beretts i Steg 3 lades genast till det. Blandningen fick svalna i rumstemperatur i 15 minuter för att låta tRNA gånger korrekt.
- Den AdoMet mix (slutkoncentration 200 M) har utarbetats genom att blanda 50 mikroM av märkt AdoMet (250 μCi, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) med 150 mikroM av omärkta AdoMet. För en AdoMet mix lämpar sig för 10 märkning reaktioner, blandade vi 5,2 mikroliter av omärkta AdoMet (från de utspädda lösningen), 29 mikroliter av märkt AdoMet och 5,8 mikroliter destillerat vatten.
- 4 mikroliter av AdoMet mixen beredd ovan har lagts till i tRNA-lösningen och inkuberas i 2 minuter vid 37 ° C.
- Den tRNA metyltransferas, Ehmeth (1-10 mikroM slutlig koncentration) lades till den lösning som innehåller tRNA-substrat och-märkta omärkta AdoMet kofaktor. Blandningen var inkuberas i 3 timmar vid 37 ° C. Rören var blandade regelbundet under tiden för inkubation genom att försiktigt vända dem. En kinetisk kurva av den enzymatiska reaktionen byggdes genom att varje 20 minuter ett prov (8 mikroliter) från reaktionsblandningen under en period av tre timmar.
- Varje prov blev genast såg i mitten av en Whatman filter (0,5 cm diameter) och filtret var indränkt i en 5% TCA-lösning och upprörd på is i 10 minuter (utom för AdoMet provet, tabell 2 kolumn E som inte bör tvättade). Tvätten steg med 5% TCA lösning upprepades ytterligare två gånger
- Filtret spolades med 100% etanol på is i 10 minuter.
- Filtret var lufttorkad i minst 20 minuter.
- Varje torkade filtret var placerad i ett rör (specifikation) som tidigare var fylld med 3 mL scintillationsvätska (CytoScint)
- Radioaktiviteten som ingår i tRNA använde en scintillationsräknare (Counter Beta Tri-Carb 2100TR).
4. Felsökning
- Höga värden i kolumn A eller B (tabell 3), var det stickprov värden motsvarade den förväntade från metylering reaktionen i kolumn C eller D (tabell 3) → filtren inte tvättas ordentligt.
- Låga värden i kolumn C eller D (tabell 3) hade metylering experiment liknande värden till kontrollen reaktionen i kolumn A eller B (tabell 3) → enzymet var inte beredd på rätt sätt, vilket innebär att det inte fanns någon Adomet bolagsordningen. Ett annat alternativ är att tRNA degraderades och var inte ett lämpligt substrat för enzymet, kan detta kontrolleras genom att köra tRNA-prov på en urea akrylamid gel (se 1.2) och färgning av gelen med etidiumbromid att undersöka integriteten av tRNA .
- Låga värden i kolumn D (tabell 3) → sedan aktivitet Ehmeth är svagare då hDnmt2 enzymet prestanda kan förbättras genom att öka DTT koncentrationen i lager buffert (kan variera mellan 1 till 10 mm) eller för att öka enzymet koncentrationen till lindra den dåliga kvaliteten på enzymet.
- Låga värden i kolumn E (tabell 3) → denna kolumn representerar den totala radioaktiviteten av den märkta AdoMet värdet (kallas 100%), om värdet i denna kolumn är låg innebär det att AdoMet inte längre är aktiv och har förlorat sin radioaktivitet.
5. Representativa resultat
| Reagens | Slutlig koncentration | PCR - program | |||||
| Gentherm PCR-buffert | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3,0 mm | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP mix | 1,2 mm | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Mall DNA | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Framåt Primer | 3,0 mikroM | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Omvänd Primer | 3,0 mikroM | 2.-4. 10 cykler | 5.-7. 25 cykler | ||||
| Taq-polymeras | 0,1 U / l | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Ad 50 l | locket 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabell 1: Pipettera system för PCR och PCR-programmet.
| En Negativ kontroll (Ehmeth endast) | B Negativ kontroll (TRNA endast) | C Positiv kontroll med mänskliga Dnmt2 | D Standard Reaktion (Enz + subst + kaffe) | E Totala värdet av AdoMet på filtret | |
| tRNA | - | (3 mikrog) | (3 mikrog) | (3 mikrog) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 mikrogram) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 mikrogram) | (2,48 mikrogram) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Totalt | 40 mikroliter | 40 mikroliter | 40 mikroliter | 40 mikroliter | 1 mikroliter |
Tabell 2:. Exempel på pipeting system Varje kolumn i systemet representerar ett prov.
* Både Ehmeth och hDnmt2 hade smält till en GST tagg med en uppskattad protein storlek på 62 kDa.
A-Negativ kontroll som inkluderar Ehmeth bara.
B-Negativ kontroll som innehåller tRNA bara.
C-positiva kontroll med mänskliga Dnmt2. Detta enzym har tio gånger mer aktivitet än Ehmeth
D-standard reaktion som innehåller enzym, substrat och kofaktor
E-Totalt värde av AdoMet på filtret. Detta värde används för beräkning av andelen metylgruppen införlivas.
| En Negativ kontroll (Ehmeth endast) | B Negativ kontroll (TRNA endast) | C Positiv kontroll med mänskliga Dnmt2 | D Standard Reaktion (Enz + subst + kaffe) | E Totala värdet av AdoMet på filtret | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51.653 |
Tabell 3:. Exempel på värden som läses av scintillationsräknare Varje kolumn i systemet representerar ett prov från tabell 1.
Figur 1: (A) T7 transkription mall och grundfärger för in vitro transkription. Alla sekvenser är skrivna i 5 'till 3' riktning. Färgkod: se text. (B) ordning för produkten bildas under transkription. RNA betygsdokument syntetiseras av T7 RNA-polymeras. Hammerhead ribozyme och tRNA vika i sina respektive 2D-strukturer och ribozyme klyver sig av tRNA lämnar en hydroxylgrupp på deras 5'-änden (anpassad från 9).
Figur 2:. PCR-reaktionen kontroll på en 1,3% agarosgel prestained med 1X GelRed PCR-reaktioner på två olika mallar visas tillsammans med ett 100 baspar plus stege. Omfattar en "mall bara" körfält och reaktioner där omvänd primern utelämnats.
Figur 3:. UV-shadowing EN SIDA separation av två transkription blandningar visas. Band av prekursor avskrifter (före klyvning), full längd tRNA och hammarhaj ribozyme bli synliga som skuggor eftersom de hindrar UV-ljus från att nå fluorescerande TLC-plattan. Totalt tRNA från E. coli används som storlek markör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna presentation illustrerade vi hur man förbereder aktiva komponenter för mätning av tRNA metyltransferas aktivitet E. histolytica Ehmeth enzym. Detta förfarande kan fungera som en utgångspunkt och lätt anpassas till åtgärden av andra tRNA metyltransferaser. Det är viktigt att följa de förfaranden som bevarar kvaliteten och integriteten i tRNA-substrat och tRNA metyltransferas protein för att försäkra en optimal mått på den enzymatiska aktiviteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats med bidrag från Israel Science Foundation och Rappaport Familj Institutet för forskning inom medicinska vetenskaper, och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
