Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכנת המצע tRNA סינתטי עבור
Abstract
טפילים protozoan הם בין גורמים מדבקים הרסנית ביותר של בני אדם אחראי מגוון רחב של מחלות כולל amebiasis, שהוא אחד משלושת הגורמים השכיחים ביותר למוות ממחלות טפיליות. הסוכן של amebiasis הוא טפיל האמבה Entamoeba histolytica שקיים תחת שני שלבים: ציסטה זיהומיות למצוא מזון או מים חיים trophozoite פולשנית במעי. הביטויים הקליניים של מגוון amebiasis מלהיות אסימפטומטיים עד מורסות, קוליטיס דיזנטריה או כבד. E. histolytica הוא אחד הטפיל unicellular נדיר עם 5-methylcytosine (5mC) בגנום שלו. 1, 2 הוא מכיל דנ"א יחיד methyltransferase, Ehmeth, אשר שייך למשפחת Dnmt2. 2 Dnmt2 תפקיד בשליטה על אלמנטים חוזרים יש הוקמו E. histolytica, 3 discoideum Dictyostelium 4,5 ו תסיסנית. 6 העבודה האחרונה שלנו הוכיח כי Ehmeth methylates tRNA ASP, ממצא זה מראה כי אנזים זה יש DNA כפול / tRNA פעילות methyltransferase-ASP. 7 תצפית זו עולה בקנה אחד עם פעילות כפולה כך דווחה עבור ד discoideum וד melanogaster. 8 משמעות תפקודית של סגוליות DNA / tRNA של Dnmt2 אנזימים עדיין לא ידוע. כדי לענות על שאלה זו, שיטה כדי לקבוע את פעילות tRNA methyltransferase של Dnmt2 חלבונים הוקמה. בסרטון הזה, אנו מתארים גישה פשוטה להכין מצע tRNA מתאים Dnmt2 ו שיטה למדידת פעילות tRNA methyltransferase שלה.
Protocol
דרישות מוקדמות לפני ביצוע הניסוי:
- RNase ללא מים משמש בטיפול של רנ"א במעבדה כדי להפחית את הסיכון של רנ"א להיות מושפל על ידי RNases. לענין זה, המים מטופלים בדרך כלל במשך שעה לפחות 1 עם 0.1% diethylpyrocarbonate v / v (DEPC) בשעה 37 ° C ו autoclaved אז (לפחות 15 דקות) כדי להשבית עקבות DEPC.
- Pipettes Pipetman מנקים עם פתרון טיהור RNase (RNase מדביר, ביולוגית התעשייה בית העמק) לפני השימוש.
- צינורות Eppendorf וטיפים צריכה להיות מוסמך ללא DNase ו RNase כדי לשמור על שלמות המדגם.
1. tRNA-ASP הכנה
הליך זה מתאר בתעתיק נגר במבחנה אשר ניתן להשתמש בהם עבור סינתזה של tRNA כלשהו. הליך זה הוא עיבוד של שיטת ribozyme שפורסמו בעבר. 9 למטרה זו תבנית עוצבה המורכב של האמרגן T7 לבין רצפים משלימים עצמית ביקוע פטיש ribozyme ואת tRNA הנדרש. תמלול של זה תוצאות תבנית במוצר השחיטה עצמה בסוף, `5 באופן tRNA באורך מלא מתקבל עם 5`-OH במקום הקצה `phosphorylated 5. TRNA באורך מלא יכול להיות מטוהרים מן ביקע פטיש ribozyme ומוצרים uncleaved ידי-אוריאה.
- PCR פריימר עיצוב תבנית:
על מנת לקבל תבנית יעיל בתיווך RNA-פולימראז T7 ב שעתוק במבחנה שלוש דרישות צריך להתגשם.- רצף T7-האמרגן (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) צריך להיות מעורב התבנית.
- כדי להגביר את יעילות השעתוק, הראשון שלושה נוקלאוטידים של רנ"א עיבד צריך להיות guanosine.
- רצף משלים נכונה של tRNA ספציפי נדרש.
- PCR
עבור הגברה של DNA תבנית, השתמשנו תגובה רגילה PCR בכרך האחרון של μL 50. טבלה 1 פרטים הריכוזים הסופי (תגובה מוכנה על הקרח) ואת התוכנית של ה-PCR. הטמפרטורה חישול נמוך בשימוש במהלך 10 מחזורים חשבונות הראשוני מחייב רק חלקית של פריימר קדימה לתבנית ה-DNA. כדי להפחית נוקבים מחייב את הטמפרטורה חישול הוגדל להמשך 25 מחזורים הגברה.
ההצלחה של הגברה תבנית נבדק ב -1.3% agarose ג'ל prestained עם פתרון 1X GelRed (איור 2). - שעתוק
- Premix T7 ניתן להכין 5X מרוכז (200 מ"מ טריס-HCl, pH 8.1, 30 מ"מ MgCl 2, 1 Spermidine מ"מ, 5 מ"מ DTT, 2 מיקרוגרם / מ"ל ו - BSA טריטון 0.01% X-100) והוא משמש אחד לפחות שבוע או חמישה מחזורי ההפשרה להקפיא.
- תערובת השעתוק צריך להיות מוכן בטמפרטורת החדר.
- תגובות תמלול הוכנו באמצעות 80 μL premix T7, 80 μL מוצר ה-PCR, 80 μL לערבב NTP (25 מ"מ) מותאם μL 385 עם מים MilliQ. 15 μL (1.34 מ"ג / מ"ל) T7 RNA פולימראז (הריכוז הסופי 0.05 מיקרוגרם / μL) מתווספים כדי להתחיל את התגובה.
- התגובה בוצעה עבור 4 שעות ב 37 ° C. משקע לבן של pyrophosphate מציין שעתוק מוצלח.
- טהרה
- Pyrophosphate היה סובב מטה במשך דקה 1 בסל"ד 10,000.
- Supernatants סופקו עם אחד formamid נפח העמסה לצבוע וטיהר בדף, אוריאה 12% באמצעות20 וואט למשך 2 שעות. לרדת את הג'ל ומניחים אותו על בניילון נצמד.
- הכתם ג'ל עם פתרון 3XGelRed בתוספת 0.1 M NaCl במשך 20 דקות. לאחר עירור UV, התווית על הלהקה tRNA את הפלסטיק עם טוש קבע כריתה מאוחר יותר. לחילופין, אם התשואה הצפויה היא מעל 50 מיקרוגרם להקות ניתן לראות על ידי הצללה-UV. עבור הצללה-UV, במקום ג'ל על צלחת דק שכבת ניאון כרומטוגרפיה ולהאיר עם מנורה UV-יד מלמעלה. לייבל להקות, אשר מופיעים כלא פלורסנט הצללים הג'ל (איור 3), עבור כריתה מאוחר יותר.
- להקות tRNA היו נכרת עם אזמל והכניסו 1.5 כוסות מ"ל Eppendorf.
- לאחר תוספת של 450 μL של 0.5m NH 4 דגימות OAc הם קפוא ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות מודגרות לאחר מכן ב 20 ° C, רועד עם 550 סל"ד על Thermoshaker Eppendorf במשך הלילה. 6. Supernatant NH 4 פתרונות OAc משלב 5 מסוננים עם Nanosep צינורות (0.45 מיקרומטר), ספינינג 90 שניות בסל"ד 8500 כדי להסיר שאריות PAGE.
- רטיבות של tRNAs eluted בוצעה על ידי הוספת 2.5 כרכים של -80 ° C אתנול טהור (רש"פ), אחסון ב -20 ° C במשך הלילה צנטריפוגה 2.5 שעות ב 4 ° C ו - 15,500 סל"ד.
- לאחר הסרת כדורי supernatant יובשו SpeedVac ו resuspended במים MilliQ.
- ריכוזים נקבעו באמצעות Nanodrop-ND1000. התשואה של שעתוק 400 one μL היה על 80-100 מיקרוגרם.
פתרון בעיות:
- אין מוצר PCR. → האם את רצף primers ותבנית תואם הם מרכיבים את כל התערובת בתוך התגובה?
- אין מוצר שעתוק. → PCR יכול להיות מוצלח. רצף נכון T7-האמרגן. פתרונות קר מדי זמן להכין את התגובה. T7 זקן מדי Premix.
- מוצר על ג'ל, אך לא מוצר eluted. → אתנול עבור משקעים לא קר מספיק, לא טהור, לא את נפח הנכון.
2. הביטוי טיהור של א רקומביננטי histolytica Dnmt2 (Ehmeth) חלבון ה coli BL21
פרוטוקול זה מתאים גם להכנת Dnmt2 חלבונים אנושיים 10 ו תסיסנית 11.
- E. histolytica Ehmeth הגן היה מוגבר על ידי ה-PCR, משובטים ב pGEX 4NT1 (GE מדעי החיים) ומאומת עם רצף
- פלסמיד רקומביננטי הפך E. coli (BL21) לביטוי של חלבונים רקומביננטי.
- החיידקים שינו נבחרו על לוריא-Bertani (LB) אגר אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) בינוני. ארבע עד חמש מושבות היו הרים מחוסן לתוך 5 מ"ל של LB התקשורת עם סמן סלקטיבי מתאים (100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין) ו מודגרות לילה בשעה 37 ב שייקר מסלולית ° C.
- התרבות גדל בן לילה היה מחוסן לתוך 500 מ"ל של מדיום 2X תמצית שמרים (2XYT) Tryptone עם 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין, וטופחו שייקר מסלולית ב 37 ° C עד 600 OD של התרבות הגיעו 0.8.
- ביטוי של חלבון רקומביננטי Dnmt2 היה המושרה על ידי הוספת איזופרופיל-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) בריכוז סופי של 0.5 מ"מ לתרבות. תרבות הודגר נוספת 16 שעות שייקר מסלולית ב 24 ° C. השעה והטמפרטורה של דגירה מוטבו כדי למנוע היווצרות של גופים הכללה.
- התרבות היתה centrifuged ב 4 ° C, 6000 סל"ד, ב 200 מ"ל צינורות Nalgene במשך 15 דקות. Supernatant היה מושלך לבין גלולה הוקפא ב -70 ° C למשך שעה לפחות 1. צעד זה משפר את הקפאת תמוגה של החיידקים.
- גלולה היה לקצור 30 מ"ל של חיץ תמוגה (100 מ"מ KCl, 1mm DTT, 1mm PMSF, 100 מיקרוגרם / מ"ל ליזוזים ו Leupeptine 100 מיקרוגרם / מ"ל ב חיץ מלוחים פוספט (PBS)). מנקודה זו, זה היה חיוני כדי לשמור על lysate על הקרח כדי למנוע את איון של חלבון רקומביננטי. Lysate היה sonicated באמבט קרח מים על הגדרה לא. 4 של MSE (לונדון, בריטניה) sonifier (מתח גבוה, משרעת 5, דופק 30 שניות, 30 שניות מנוחה 5 דקות). ה-DNA בקטריאלי שעשוי להיות מחוברים Ehmeth הוסר עם טיפול Benzonase (Novagen) nuclease (5 U / mL של lysate sonicated), במשך 30 דקות על הקרח. תמוגה הושלמה על ידי תוספת של 300 μL של חלבון מגיב מיצוי BugBuster (Novagen) במשך 30 דקות ביום על 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה על שייקר מסלולית (100 סל"ד).
- חלבון רקומביננטי GST-Ehmeth היה מטוהרים בתנאים המקומיים על שרף גלוטתיון-agarose פי הוראות מייצרת (Sigma). במשך 25 מ"ל של lysate, 500 μL של חרוזים slurry שרף נוספו מודגרות על 24 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- החרוזים נשטפו פעמיים עם חיץ תמוגה (10 כרכים של חיץ תמוגה לכל נפח של חרוזים) ו 6 פעמים עם PBS קר. צעדים אלה לשטוף נרחב להבטיח שאין להישאר על Benzonase לפני elutioצעד n.
- חלבון רקומביננטי Ehmeth היה eluted מן חרוזים agarose גלוטתיון ידי דוגרים את החרוזים עם 5 מ"ל של חיץ elution גלוטתיון (טריס 50 HCl pH 8.0 mM, גלוטתיון (Sigma) 10 mM) במשך 12 שעות על 4 מעלות עם סיבוב עדין. החרוזים הוסרו על ידי צנטריפוגה (2,000 סל"ד, 5 דקות) ואת supernatant נאסף.
- המאגר elution ב supernatant הוחלף חיץ אחסון (KCl 200 מ"מ, EDTA 10 מ"מ, DTT 0.1 מ"מ, גליצרול 60% PBS). לצורך זה, 5 מ"ל של supernatant הועמס על העליונה Millipore Microcon YM-30 התקנים מסנן צנטריפוגלי (30 kDa לנתק עמודה) ו centrifuged בסל"ד 8000 למשך 20 דקות ב 4 ° C. חלבון להתרכז היה מדולל חיץ אחסון (5 מ"ל) וטען במכשיר מסנן. ההליך אותו יש לחזור לפחות 3 פעמים כדי להבטיח החלפת מלאה של המאגר elution ידי למאגר אחסון. לבסוף החלבון מרוכזים צריך להיות מדולל μL כ -300 מאגר האחסון.
- הריכוז של חלבון רקומביננטי נמדדה על ידי assay חלבון ברדפורד. הכנה אנזים רקומביננטי אוחסן ב -20 ° C. הריכוז הסופי של האנזים לא צריך להיות פחות מ 3 מיקרוגרם / μL כמו ריכוז מתאים assay מתילציה.
- הכנה החלבון נבדקה על ידי SDS-PAGE.
שימו לב: על מנת להבטיח את הכנת אנזים פעיל, כל השלבים לטיהור צריך להיעשות על קרח DTT אמור להיות מוכן טרי הוסיף למאגר אחסון. זו מבטחת אנזים פעיל במשך 6 חודשים.
3. Assay מתילציה tRNA חוץ גופית
פתרונות ריאגנטים כי יש להכין:
- 1 M פתרון של aminomethane (hydroxymethyl) טריס. התאם את ה-pH של התמיסה עד 8.0 עם חומצה הידרוכלורית מרוכזת (HCl).
- מתילציה חיץ 5X (MB): 100 מ"מ טריס pH 8.0, 100mm NH 4 OAc, 0.1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. MB ניתן להכין מראש ומאוחסנים ב -20 ° C ללא dithiothreitol (DTT).
- הכן את תווית ה-S-adenosylmethionine (AdoMet) מניות (מ"מ הסופי 1.5 ריכוז) על ידי ערבוב 5 AdoMet μL (ניו אינגלנד Biolabs, ריכוז 32 מ"מ) עם 101.67 מ"ל של מים מזוקקים.
- 5% חומצה פתרון Trichloroacetic (TCA)
- 100% אתנול
- Scintillation מ"ל נוזל לכל 3 בקבוקון המדגם.
Assay:
- תכנית pipeting מוכן (טבלה 2) עבור נפח 40 סופי μL של assay מתילציה.
- ב 1.5 מ"ל Eppendorf צינור, tRNA היה מדולל במים שטופלו DEPC לריכוז סופי של 5 מיקרומטר (tRNA 1μg שווה pmol 40)
- 4 μL של DTT נוספה (ריכוז של הפתרון המלאי) כדי μL 8 של פתרון 5XMB.
- הפתרון tRNA הודגר על 85 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואת פתרון מוכן בשלב 3 נוספה מיד אליו. התערובת הורשה להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי לאפשר לקפל tRNA כראוי.
- לערבב AdoMet (ריכוז סופי 200 מיקרומטר) הוכן על ידי ערבוב של 50 מיקרומטר AdoMet שכותרתו (250 μCi, 10.0 Ci / mmol, PerkinElmer) עם 150 מיקרומטר של AdoMet ללא תווית. לקבלת תערובת AdoMet מתאים 10 תגובות תיוג, אנו מעורבים 5.2 μL של AdoMet ללא תווית (מפתרון בדילול מלא), 29 μL של AdoMet שכותרתו 5.8 μL של מים מזוקקים.
- 4 μL של תמהיל AdoMet מוכן לעיל נוספה הפתרון tRNA וטופחו במשך 2 דקות על 37 ° C.
- Methyltransferase tRNA, Ehmeth (ריכוז 1-10 מיקרומטר הסופי) נוספה פתרון המכיל את המצע tRNA לבין cofactor שכותרתו-AdoMet ללא תווית. התערובת הודגר במשך 3 שעות על 37 ° C. הצינורות היו מעורבות באופן קבוע על ידי בעדינות מרפרף אותם בתקופת הדגירה. העקומה הקינטית של התגובה האנזימטית נבנה על ידי לקיחת כל 20 דקות מדגם (8 μL) מתערובת התגובה על פני תקופה של שלוש שעות.
- מדגם כל זוהה מיד על מרכז מסנן Whatman (קוטר 0.5 ס"מ) המסנן היה ספוג בתמיסה TCA 5% ונסער על קרח במשך 10 דקות (למעט המדגם AdoMet, לוח 2 טור E זה לא אמור להיות שטף). צעד כביסה עם פתרון TCA 5% חזר על עצמו עוד פעמיים
- מסנן נשטף עם אתנול 100% על קרח במשך 10 דקות.
- מסנן האוויר היה יבש למשך תקופה מינימלית של 20 דקות.
- כל מסנן יבשים הוכנס צינור (מפרט) כי היה מלא בעבר עם 3 מ"ל של נוזל הנצנץ (CytoScint)
- רדיואקטיביות שולבו tRNA היה באמצעות מונה נצנץ (מונה בטא Tri-Carb 2100TR).
4. פתרון בעיות
- ערכים גבוהים בעמודה A או B (לוח 3), המדגם ערכים לשלוט היו דומים לאלה צפוי מן התגובה מתילציה בטור ג'או ד '(לוח 3) → המסננים לא נשטפו כראוי.
- ערכים נמוכים בעמודה C או D (לוח 3), הניסויים מתילציה היו ערכים דומים התגובה לשלוט בעמודה A או B (לוח 3) → האנזים לא היה מוכן כראוי, כלומר לא היה שילוב Adomet. אפשרות נוספת היא כי tRNA היה מושפל ולא היה מצע מתאים האנזים, זה ניתן לבדוק על ידי הפעלת מדגם tRNA על ג'ל acrylamide אוריאה (ראה 1.2) ו מכתים את הג'ל עם ברומיד ethidium לבחון את היושרה של tRNA .
- ערכים נמוכים בטור ד '(לוח 3) → מאז את פעילותו של Ehmeth חלש אז הביצועים hDnmt2 האנזים יכול להיות משופרת על ידי הגברת הריכוז DTT במאגר אחסון (יכול לנוע בין 1-10 מ"מ) או להגדיל את ריכוז האנזים להקל על איכות ירודה של האנזים.
- ערכים נמוכים בעמודה E (לוח 3) → הטור הזה מייצג את הרדיואקטיביות הכולל של הערך AdoMet שכותרתו (המכונה 100%), אם הערך בעמודה זו הוא נמוך זה אומר AdoMet כבר אינו פעיל איבד שלה רדיואקטיביות.
5. נציג תוצאות
| מגיב | הריכוז הסופי | PCR - תוכנית | |||||
| Gentherm PCR הצפת | 1X | 1. | 90 ° C | 2 דקות | |||
| MgCl 2 | 3.0 mM | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP לערבב | 1.2 מ"מ | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| תבנית ה-DNA | 15.0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| קדימה פריימר | 3.0 מיקרומטר | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| הפוך פריימר | 3.0 מיקרומטר | 2.-4. 10 מחזורים | 5.-7. 25 מחזורים | ||||
| תקי פולימראז | 0.1 U / μl | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | מודעות 50 μl | מכסה 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 דקות | ||
טבלה 1: תוכנית פיפטה עבור תוכנית ה-PCR PCR.
| בקרה שלילית (Ehmeth בלבד) | ב בקרה שלילית (TRNA בלבד) | ג בקרה חיובית עם Dnmt2 אדם | D תקן התגובה (Enz + + subst COF) | E הערך הכולל של AdoMet על המסנן | |
| tRNA | - | (3 מיקרוגרם) | (3 מיקרוגרם) | (3 מיקרוגרם) | - |
| hDnmt2 | - | (2.48 מיקרוגרם) | - | ||
| Ehmeth | (2.48 מיקרוגרם) | (2.48 מיקרוגרם) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| סך הכל | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 1 μL |
טבלה 2:. דוגמה pipeting תכנית כל עמודה במערך מייצגת דגימה אחת.
* שני Ehmeth ו hDnmt2 היו התמזגו לתג GST עם גודל חלבון מוערך של 62 kDa.
A-Negative מלאה הכוללת רק Ehmeth.
B-Negative מלאה הכוללת tRNA בלבד.
C-Positive שליטה עם Dnmt2 האדם. אנזים זה יש פעילות עשר בלילה זמן יותר Ehmeth
D-רגיל התגובה הכוללת את האנזים, המצע ואת cofactor
E-סה"כ ערך AdoMet על המסנן. ערך זה משמש לחישוב של אחוז מתיל הקבוצה התאגדה.
| בקרה שלילית (Ehmeth בלבד) | ב בקרה שלילית (TRNA בלבד) | ג בקרה חיובית עם Dnmt2 אדם | D תקן התגובה (Enz + + subst COF) | E הערך הכולל של AdoMet על המסנן | |
| עותקים לדקה | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
לוח 3:. דוגמה של ערכים לקריאה על ידי מונה הנצנץ כל עמודה במערך מייצגת דגימה אחת מתוך טבלה מס '1.
איור 1: (א) תבנית T7 שעתוק primers עבור ב שעתוק במבחנה. רצפים כל כתובים 5 'ל 3' כיוון. Colorcode: לראות את הטקסט. (ב) תוכנית של יצירת מוצר במהלך השעתוק. תעתיק רנ"א מסונתז על ידי RNA פולימראז T7. Hammerhead ribozyme ו tRNA לקפל לתוך שלהם 2D מבנים המתאימים ואת ribozyme cleaves עצמה של tRNA להשאיר קבוצת הידרוקסיל בסוף 5'-שלהם (מותאם מ - 9).
איור 2:. לשלוט PCR תגובה על 1.3% agarose ג'ל prestained עם 1X תגובות GelRed PCR על שתי תבניות שונות מוצגות לצד 100 basepairs פלוס בסולם. בקרת כוללים "רק תבנית" נתיב ותגובות שבו תחל להפוך הושמט.
איור 3:. UV-הצללה ההפרדה PAGE של שתי תערובות שעתוק מוצג. להקות של תמלילי מבשר (לפני המחשוף), אורך tRNA מלא פטיש ribozyme להיות גלוי כמו צללים שכן הם מונעים אור UV מלהגיע צלחת TLC ניאון. TRNA סך של E. coli המשמש כסמן גודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במצגת זו, הדגמנו איך להכין את הרכיבים הפעילים במשך למדוד את הפעילות של ה tRNA methyltransferase histolytica אנזים Ehmeth. הליך זה יכול לשמש כנקודת פתיחה ו להתאים בקלות מידה של methyltransferases tRNA אחרים. חשוב לבצע את ההליכים לשמר את איכות על שלמות המצע tRNA של החלבון tRNA methyltransferase כדי להבטיח אמצעי אופטימלי של הפעילות האנזימטית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע ומכון רפפורט למחקר במדעי הרפואה, ואת Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
