Summary
这个协议描述为合成tRNA的衬底准备
Abstract
原虫是最具毁灭性的传染性病原体对人类负责各种疾病，包括阿米巴病，寄生虫病的三种最常见的死亡原因之一。阿米巴剂是阿米巴寄生虫阿米巴存在下两个阶段：发现感染性囊肿的食物或水，并在肠道内侵入滋养体生活。阿米巴范围的临床表现从无症状大肠杆菌肠炎，痢疾或肝脓肿。 阿米巴是一个罕见的单细胞寄生虫，它的基因组与5 -甲基胞嘧啶（5mC）1，2，它包含一个单一的DNA甲基化，Ehmeth，属于Dnmt2家庭。2一个Dnmt2在重复元素的控制作用建立了在大肠杆菌中3， 阿米巴粘菌 4,5和果蝇 。6我们最近的工作表明，Ehmeth甲基化tRNA 的 ASP，这一发现表明，这种酶具有双重DNA / tRNA 的 ASP甲基转移酶活性。7这个观察的双重活动的协议已报告为D。 discoideum和 D。 果蝇 。8 Dnmt2酶的DNA / tRNA的特异性的功能意义，仍是未知数。为了解决这个问题，成立了一个方法来确定的tRNA Dnmt2蛋白甲基转移酶活性。在这段视频中，我们描述了一个简单的方法，准备Dnmt2足够的tRNA基板和方法来衡量它的tRNA甲基转移酶活性。
Protocol
然后才开始实验的前提条件：
- 无RNase的水是用于在实验室中的RNA处理，以减少风险的RNA被RNase的降解。为此，水通常是治疗至少1小时，0.1％V / V酸二乙酯（DEPC）在37℃，然后高压灭菌（至少15分钟），灭活的DEPC的痕迹。
- Pipetman移液器核糖核酸酶净化解决方案（核糖核酸灭虫，生物产业拜特哈Haemek）在使用前清洗。
- Eppendorf管和提示应认证DNase和RNase的自由，以保持样品的完整性。
1。 tRNA的天冬氨酸的制备
此过程介绍了可用于任何的tRNA合成的体外决胜转录。此过程是，此前公布的核酶的方法适应。9这个模板设计的T7启动子和自我切割的核酶和所需的tRNA的互补序列组成的目的。在产品模板转录裂解5的方式结束，全长tRNA的是获得了5`- OH，而不是一个磷酸5`年底。全长度的tRNA可切割的核酶和uncleaved产品纯化尿素页。
- PCR引物和模板设计：
为了获得一个有效的模板，T7 RNA 聚合酶体外转录介导的三个方面的要求必须满足。- 的T7启动子序列（5`- TAATACGACTCACTATA - 3'）在模板的牵连。
- 为了提高转录效率，前三转录RNA的核苷酸应鸟苷。
- 特定的tRNA的正确的互补序列是必要的。
- PCR扩增
对于模板DNA扩增，我们用一个标准的PCR反应在50μL的最终体积。表1详细的最终浓度（反应准备上冰）和PCR技术方案。退火温度低，在最初的10个循环，唯一的正向引物部分DNA为模板的结合的帐户使用。为了减少非特异性结合退火温度的进一步增加了25个扩增循环。
模板扩增的成功是由1.3％琼脂糖凝胶预染1X GelRed解决方案（图2）测试。 - 转录
- T7预混料可准备的5倍浓缩（200毫米的Tris - HCl，pH值8.1; MgCl 2的30毫米，1毫米的亚精胺，5毫米的数码地面电视，2μg/ mL的BSA和0.01％的Triton X - 100），并至少有一个使用星期或5个冻融。
- 转录混合物在室温下配制。
- 转录反应，准备用80μL的T7号预混料，80μLPCR产物，80μL的NTP混合（25毫米），并调整为385μLMilliQ水。 15μL（1.34毫克/毫升）T7 RNA聚合酶（终浓度为0.05微克/μL）被添加到启动反应。
- 在37 ° C 4 H的反应进行了焦磷酸的白色沉淀，表示成功的转录。
- 净化
- 焦磷酸纺1分钟，以10,000 rpm。
- 上清液提供一个卷formamid样染料和PURified上使用2小时20瓦的12％尿素PAGE。卸除凝胶放在保鲜膜。
- 染色的凝胶补充0.1 M氯化钠20分钟3XGelRed解决方案。紫外线激发后，标签上保鲜膜一个永久性标记以供日后切除tRNA的乐队。另外，如果预期收益率是50微克带以上可以看出，紫外线遮蔽。紫外线遮蔽，放在一个荧光薄层层析板凝胶和紫外手灯，照亮从上面。标签频段，作为非荧光的阴影，在凝胶（图3），后来切除，出现。
- 用手术刀切除tRNA的频段为1.5毫升的Eppendorf杯。
- 后加入450μL0.5M NH 4醋酸样品冷冻在-80 °孵育2小时，并随后在20 ° C，550上的Eppendorf Thermoshaker转速超过晚晃动。 6。 Nanosep管（0.45微米）过滤上清液中的NH 4 OAC解决方案，从第5步，在8500 rpm到删除页面碎片旋转90秒。
- 洗脱tRNA的降水量增加2.5卷-80 °彗星纯乙醇（PA），储存在-20 ° C隔夜和2.5小时离心4℃，15500 RPM。
- 取出后上清颗粒干SpeedVac MilliQ水悬浮。
- 使用Nanodrop - ND1000的浓度进行了测定。一个400μL的转录产量约80-100微克。
故障排除：
- 无PCR产物。 →是兼容的引物和模板的顺序和反应混合物内的所有组件吗？
- 无转录产物。 →PCR有可能不成功。正确的T7启动子序列。太冷的解决方案，同时准备反应。 T7预混料太旧。
- 凝胶的产品，但没有洗脱产品。 →乙醇沉淀，不冷，不够纯，不正确的卷。
2。重组大肠杆菌的表达及纯化阿米巴 Dnmt2（Ehmeth）在大肠杆菌中的蛋白质大肠杆菌 BL21
此协议也适用于编制Dnmt2 10人类和果蝇的蛋白质 11 。
- 的大肠杆菌阿米巴 Ehmeth基因经PCR扩增，克隆PGEX 4NT1（GE生命科学），测序验证
- 重组质粒转化E.表达的重组蛋白的大肠杆菌（BL21） 。
- 卢里亚- Bertani（LB）琼脂氨苄青霉素（100微克/毫升）培养基上选择转化菌。四，五殖民地被拾起，接种到5 mL LB培养基中，用合适的选择标记（100μg/ mL氨苄青霉素）和轨道摇床孵育过夜在37 ° C。
- 过夜文化接种到500毫升2X酵母提取蛋白胨（2XYT）中型，100μg/ mL氨苄青霉素，并在轨道摇床在37 ° C，直至文化的OD 600 0.8 。
- Dnmt2重组蛋白的诱导表达异丙基-β- D -硫代半乳糖苷（IPTG），加入终浓度为0.5毫米的文化。文化是进一步培养16小时，在24 ° C，在一个轨道摇床孵化温度和时间都得到了优化，以避免形成包涵体。
- 文化是在4 ° C，在200毫升NALGENE管，15分钟6000转离心。弃上清液，沉淀在-70℃冻至少1小时。这冻结一步提高的细菌裂解。
- 收获在30 mL裂解缓冲液（100毫米氯化钾，1mm的数码地面电视服务，为1mM PMSF，100微克/毫升溶菌酶和Leupeptine 100微克/毫升磷酸盐缓冲液（PBS））中的颗粒。从这一点来说，至关重要的是保持在冰上的裂解液，以防止重组蛋白的灭活。设置没有在冰水浴超声裂解液。 4一个微型和小型企业（英国伦敦）sonifier（休息5分钟，30秒，30秒脉冲功率高，振幅5）。细菌的DNA可能会附加到Ehmeth Benzonase核酸（Novagen公司）的治疗（5 U / mL的超声裂解）在冰上30分钟，被删除。此外BugBuster蛋白抽提试剂（Novagen公司）300μL30分钟完成的裂解是由在4 ° C与轨道摇床（100转）轻轻摇动。
- 重组GST - Ehmeth蛋白质纯化谷胱甘肽琼脂糖树脂的天然条件下，根据制造商的说明（Sigma公司）。 25 mL裂解液中，分别加入500μL浆树脂和孵育24℃，1小时。
- 珠裂解液单位体积珠裂解缓冲液（10卷）和6倍，用冷PBS洗两次。这些广泛的清洗步骤insurE的没有Benzonase保持洗脱步骤之前。
- 重组Ehmeth蛋白谷胱甘肽琼脂糖珠洗脱孵化谷胱甘肽洗脱缓冲液5毫升（三盐酸50 mM的pH值8.0，谷胱苷肽（Sigma公司）10毫米），12小时在4℃与轻柔旋转的珠子。珠被拆除离心（2,000 RPM，5分钟），收集上清。
- 洗脱缓冲液上清中被替换的存储缓冲区（氯化钾200毫米，EDTA的10毫米，0.1毫米的DTT，甘油60％的PBS）。为此，5毫升上清液装上顶部的一个微孔单片机YM - 30离心式过滤装置（切断列30 kDa的）和离心20分钟在8000转4 ° C。在存储缓冲区（5毫升）稀释，浓缩蛋白和过滤装置上的重载。同样的程序应至少重复3次，以确保完成更换洗脱缓冲液的存储缓冲区。最后浓缩蛋白应约300存储缓冲液稀释。
- 由Bradford蛋白测定重组蛋白的含量测定。重组酶制剂存放在-20 ° C。酶的最终浓度不应超过3微克/μL作为适宜浓度的甲基化检测。
- 经SDS - PAGE蛋白制备检查。
注意：投保的一种活性酶的制备，纯化步骤应在冰上和数码地面电视应新鲜配制和添加到存储缓冲区。这保证6个月的活性酶。
（3） 在体外 tRNA的甲基化检测
解决方案和应准备的试剂：
- 1个M解决方案三（羟甲基）氨基甲烷。用浓盐酸（HCl）溶液的pH值调整到8.0。
- 5X甲基缓冲区（MB）：100毫米的Tris pH值8.0，100MM NH 4醋酸，EDTA的0.1毫米，10毫米MgCl 2的 。 MB可提前做好准备，并储存在-20 ° C，无二硫苏糖醇（DTT）。
- 准备101.67 mL蒸馏水混合5μL，AdoMet（New England Biolabs公司，32毫米的浓度）的未标记的S -腺苷甲硫氨酸（AdoMet）股票（终浓度为1.5毫米）。
- 5％三氯乙酸溶液（TCA）
- 100％的乙醇
- 闪烁液3毫升，每样品瓶。
该试剂盒：
- 一个pipeting计划的准备（见表2）为40μL，甲基化检测的最终体积。
- 在1.5 mL Eppendorf管中，tRNA的DEPC处理水稀释到5微米的终浓度为（1μgtRNA的是相当于40 pmol）
- 4μL数码地面电视（原液浓度）8μL5XMB解决方案。
- 孵育85 ° C为2分钟，在步骤3中准备的解决方案是立即添加到tRNA的解决方案。混合物被允许降温15分钟，在室温下让tRNA的正确折叠。
- AdoMet组合（终浓度为200μM）混合标记AdoMet未标注AdoMet 150微米50微米（250μCi，10.0次/毫摩尔，珀金埃尔默）。我们AdoMet适合10个标记反应的组合，混合5.2μL无标签AdoMet（稀释液），29μL标记AdoMet和5.8μL蒸馏水。
- 4μL准备以上的AdoMet混合添加到tRNA的解决方案，并在37 ° C孵育2分钟
- tRNA的甲基化，Ehmeth（1-10微米的最终浓度）被添加到解决方案中包含的tRNA基材和标记的未标记的AdoMet辅酶。混合物在37℃孵育3小时定期在孵化时，轻轻翻转试管混合。采取从反应混合物超过三个小时，期间每隔20分钟一个样品（8μL）建一个酶促反应的动力学曲线。
- 每个样本被立即发现用Whatman过滤器（直径0.5厘米的）的中心和过滤器在5％TCA溶液浸泡，搅拌10分钟冰（除AdoMet样品，表2的E列，不应该水洗）。 5％TCA溶液洗涤步骤重复两次
- 该过滤器是100％冰浴10分钟乙醇洗涤。
- 该过滤器是空气干燥至少20分钟。
- 每个干燥过滤器被放置在一个以前充满闪烁液3毫升（CytoScint）管（规格）
- 在tRNA的注册成立的放射性，是用闪烁计数器（计数器的Beta三- CARB 2100TR）。
4。故障排除
- 在列A或B（表3）的高值，控制样本值，预计从M乙基化反应，在列C或D（见表3）→过滤器，冲不正常。
- 在列C或D（见表3）低值，甲基化的实验也有类似的值来控制反应列A或B（见表3）→酶是不正确准备，也就是说，有没有Adomet纳入。另一种选择是tRNA的退化，并没有一个合适的酶底物，这可能是尿素的丙烯酰胺凝胶上运行tRNA的样本（见1.2），并用溴化乙锭染色凝胶研究的tRNA的完整性检查。
- 低列D值（见表3）→自Ehmeth活动较弱然后hDnmt2的酶的性能，可通过增加存储缓冲区的数码地面电视的浓度（范围可以1至10毫米之间）或增加酶浓度提高缓和的酶的质量差。
- 列E值低（见表3）→此列表示的总放射性标记AdoMet值（简称为100％），如果在此列的值是低的，这意味着，AdoMet不再是活动的，已经失去了放射性物质。
5。代表性的成果
| 试剂 | 终浓度 | PCR -方案 | |||||
| Gentherm PCR缓冲液 | 1X | 1。 | 90℃ | 2分钟 | |||
| MgCl 2的 | 3.0毫米 | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP混合液 | 1.2毫米 | 2。 | 90℃ | 30秒 | 5。 | 90℃ | 30秒 |
| 模板DNA | 15.0海里 | 3。 | 54℃。 | 30秒 | 6。 | 60℃ | 30秒 |
| 正向引物 | 3.0μM | 4。 | 72℃ | 45秒 | 7。 | 72℃ | 45秒 |
| 反向引物 | 3.0μM | 2. - 4。 10个周期 | 五，7。 25个循环 | ||||
| Taq聚合酶 | 0.1 U /μL | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | 公元50μL | 盖95 ° C | 8。 | 72℃ | 3分钟 | ||
表1：移液器PCR和PCR方案的计划 。
一 | 乙 阴性对照 （只tRNA的） | 彗星 阳性对照与人类Dnmt2 | ð 标准反应 （Enz + SUBST + COF） | Ë 在过滤器上的总价值的AdoMet | |
| tRNA的 | - | （3微克） | （3微克） | （3微克） | - |
| hDnmt2 | - | （2.48微克） | - | ||
| Ehmeth | （2.48微克） | （2.48微克） | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| 数码地面电视 | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| 共有 | 40微升 | 40微升 | 40微升 | 40微升 | 1微升 |
表2：pipeting计划的例子在该计划中的每一列代表一个样本。
* Ehmeth和hDnmt2融合估计62 kDa的蛋白大小与GST标签。
一个阴性对照，包括Ehmeth只。
B超阴性对照只包括tRNA的。
C -阳性与人类Dnmt2的控制。这种酶有十个时间多了ctivity比Ehmeth
标准的D -的反应，其中包括的酶，底物和辅酶
电子的总价值在过滤器上的AdoMet。此值用于甲基集团股份有限公司的百分比计算。
| 一 阴性对照 （只Ehmeth） | 乙 阴性对照 （只tRNA的） | 彗星 阳性对照与人类Dnmt2 | ð 标准反应 （Enz + SUBST + COF） | Ë 在过滤器上的总价值的AdoMet | |
| CPM | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
表3：闪烁计数器读值的例子在该计划中的每一列从表1中的一个样本。
图1：（一）T7转录模板和引物在体外转录。所有序列都写在5'到3'方向。 Colorcode：看到文字。 （二） 计划的产品形成过程中的转录 。 T7 RNA聚合酶合成RNA转录。核酶和tRNA折叠成各自的二维结构的核酶切割留在他们的5' -端（从9适应）羟基的tRNA。
图2：PCR扩增反应控制在1.3％琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增1X GelRed反应，在两个不同的模板预染旁边一个100个碱基对，加上阶梯。控制包括一个“模板只有”巷和反向引物被省略的反应。
图3：紫外线遮蔽一个PAGE分离的两个转录混合物显示。带易制毒化学成绩单（前乳沟），全长tRNA和核酶作为阴影成为可见的，因为它们可以防止紫外线灯，从深远的荧光薄层板上。总的tRNA 从 E 大肠杆菌是使用大小标记。
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Discussion
在此演示中，我们说明如何准备tRNA 的 E.甲基转移酶活性的措施中的活性成分阿米巴 Ehmeth酶。这个程序可以作为一个起点和衡量其他的tRNA甲基很容易适应。重要的是要遵循的程序，维护tRNA的衬底和tRNA的甲基蛋白质的质量和完整性，以确保酶活性的最佳措施。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是由以色列科学基金会和拉帕波特医学科学院研究家庭研究所和德意志研究联合会（DFG）的资助的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
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