Summary
Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il tRNA
Abstract
Protozoi parassiti sono tra gli agenti infettivi più devastanti degli esseri umani responsabili di una varietà di malattie tra cui amebiasi, che è una delle tre più comuni cause di morte per malattie parassitarie. L'agente di amebiasi è l'ameba parassita Entamoeba histolytica che esiste in due fasi: la cisti infettive presenti nel cibo o acqua e la vita trofozoite invasivo a livello intestinale. Le manifestazioni cliniche della gamma amebiasi da essere asintomatica per ascessi colite, dissenteria o di fegato. E. histolytica è uno dei rari parassita unicellulare con 5-metilcitosina (5mC) nel suo genoma. 1, 2 contiene un singolo DNA metiltransferasi, Ehmeth, che appartiene alla famiglia Dnmt2. 2 Un ruolo per Dnmt2 nel controllo di elementi ripetitivi ha stato stabilito in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 e Drosophila. 6 I nostri lavori più recenti hanno dimostrato che Ehmeth metila tRNA Asp, e questo dato indica che questo enzima ha un DNA a doppia / tRNA attività Asp metiltransferasi. 7 Questa osservazione è in accordo con la duplice attività che è stato segnalato per D. discoideum e D. melanogaster. 8 Il significato funzionale del DNA / tRNA specificità del Dnmt2 enzimi è ancora sconosciuta. Per affrontare questo problema, un metodo per determinare l'attività metiltransferasi tRNA Dnmt2 di proteine è stata stabilita. In questo video, si descrive un approccio semplice per preparare un adeguato substrato tRNA per Dnmt2 e un metodo per misurare la sua attività metiltransferasi tRNA.
Protocol
Premessa prima di iniziare l'esperimento:
- RNasi-free l'acqua viene utilizzata nel trattamento di RNA in laboratorio per ridurre il rischio di RNA di essere degradati da RNasi. A tal fine, l'acqua è di solito trattati con 0,1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) per almeno 1 ora a 37 ° C e poi in autoclave (almeno 15 min) per inattivare tracce di DEPC.
- Pipette Pipetman vengono puliti con una soluzione la decontaminazione da RNasi (RNase sterminatore, biologico Industria Beit Haemek) prima dell'uso.
- Provette Eppendorf e suggerimenti devono essere certificate come esenti da DNasi e RNasi per preservare l'integrità del campione.
1. tRNA Asp Preparazione
Questa procedura descrive un in vitro ballottaggio trascrizione che può essere utilizzato per la sintesi di un tRNA. Questa procedura è un adattamento del metodo ribozima pubblicate in precedenza. 9 A questo scopo è stato progettato un modello costituito dal promotore T7 e le sequenze complementari di un self-fende martello ribozima e il tRNA necessari. Trascrizione di questo modello di risultati in un prodotto si fende al 5 `-end in modo che il full-length tRNA si ottiene con un 5`-OH al posto di un fosforilato 5 `-end. Il full-length tRNA può essere purificato da spaccati martello ribozima e prodotti uncleaved da urea-PAGE.
- PCR Primer e Design Template:
Al fine di ottenere un modello efficiente per la T7 RNA polimerasi nella trascrizione in vitro mediata tre requisiti devono essere soddisfatti.- Il promotore T7-sequenza (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) deve essere implicato nel modello.
- Per aumentare l'efficienza di trascrizione, i primi tre nucleotidi del RNA trascritto dovrebbe essere guanosina.
- La corretta sequenza complementare del tRNA specifico è necessario.
- PCR
Per l'amplificazione del DNA template, abbiamo usato una reazione standard di PCR in un volume finale di 50 microlitri. Tabella 1 i dettagli, le concentrazioni finali (reazione preparati su ghiaccio) e del programma per la PCR. La bassa temperatura di ricottura utilizzata durante i primi cicli di 10 account per l'unico legame parziale del primer avanti per il modello del DNA. Per ridurre aspecifici vincolante la temperatura di ricottura è stato aumentato di altri 25 cicli di amplificazione.
Il successo di amplificazione modello è stato testato da un 1,3% gel prestained con 1X soluzione GelRed (Figura 2). - Trascrizione
- Premix T7 può essere preparato 5X concentrato (200 mM Tris-HCl, pH 8,1, 30 mM MgCl 2, 1 spermidina mM, 5 mM DTT, 2 mg / ml BSA e 0,01% Triton X-100) ed è stato usato per almeno un settimana o cinque cicli di gelo disgelo.
- La miscela di trascrizione deve essere preparato a temperatura ambiente.
- Reazioni di trascrizione sono stati preparati con 80 microlitri premix T7, 80 microlitri di prodotto PCR, 80 microlitri mix NTP (25 mm) e adattato a 385 microlitri di acqua MilliQ. 15 microlitri (1,34 mg / ml) T7 RNA polimerasi (concentrazione finale di 0,05 mg / mL) sono aggiunte per iniziare la reazione.
- La reazione è stata effettuata per 4 ore a 37 ° C. Il precipitato bianco di pirofosfato indica trascrizione di successo.
- Purificazione
- Pirofosfato era centrifugare per 1 minuto a 10.000 giri.
- Surnatanti sono stati forniti con un volume di carico formammide colorante e PURified su un 12% di urea-PAGE utilizzando 20 W per 2 ore. Smontare il gel e posizionarlo sul Saran Wrap.
- Macchia il gel con la soluzione integrata 3XGelRed con 0,1 M di NaCl per 20 minuti. Al momento di eccitazione UV, etichetta della band tRNA sul avvolgere saran con un pennarello indelebile per escissione più tardi. In alternativa, se il rendimento atteso è superiore a 50 bande mcg possono essere visti da UV-shadowing. Per UV-shadowing, posizionare il gel su un fluorescente lastrina cromatografia e illuminare con una UV-mano-lampada dall'alto. Bande etichetta, che appaiono come ombre non fluorescente nel gel (Figura 3), per l'asportazione in seguito.
- bande tRNA sono stati asportati con un bisturi e messo in 1,5 ml tazze Eppendorf.
- Dopo l'aggiunta di 450 ml di NH 4 0.5M OAc i campioni sono congelati a -80 ° C per 2 ore e poi incubate a 20 ° C, agitando con 550 giri su un Thermoshaker Eppendorf durante la notte. 6. Il supernatante NH 4 soluzioni OAc dal punto 5 sono filtrati con Nanosep tubi (0,45 micron), la filatura 90 secondi a 8.500 giri per rimuovere i detriti PAGINA.
- Precipitazione di tRNA eluita è stata eseguita con l'aggiunta di 2,5 volumi di -80 ° C etanolo puro (pa), la conservazione a -20 ° C durante la notte centrifugazione e 2,5 ore a 4 ° C e 15.500 giri al minuto.
- Dopo aver tolto il pellet surnatante sono state essiccate in un SpeedVac e risospeso in acqua MilliQ.
- Le concentrazioni sono stati determinati utilizzando un NanoDrop-ND1000. Il rendimento di una trascrizione 400 microlitri è stato circa 80-100 mcg.
Risoluzione dei problemi:
- Nessun prodotto di PCR. → E 'la sequenza dei primer e il modello sono compatibili e tutti i componenti all'interno della miscela di reazione?
- Nessun trascrizione prodotto. → PCR avrebbe avuto successo. Corretta T7-promotore sequenza. Soluzioni troppo freddo mentre si prepara la reazione. T7 Premix troppo vecchio.
- Prodotto in gel, ma nessun prodotto eluiti. → L'etanolo per le precipitazioni non abbastanza freddo, non puro, non il volume corretto.
2. Espressione e purificazione della ricombinante E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Proteine in E. coli BL21
Questo protocollo è adatto anche per la preparazione di proteine da Dnmt2 umano Drosophila 10 e 11.
- La E. histolytica Ehmeth gene è stato amplificato mediante PCR, clonati in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) e verificato con il sequenziamento
- Il plasmide ricombinante è stato trasformato in E. coli (BL21) per l'espressione di proteine ricombinanti.
- Batteri trasformati sono stati selezionati in Luria-Bertani (LB) agar ampicillina (100 mg / ml) di media. Da quattro a cinque colonie furono presi e inoculata in 5 ml di LB con mezzi idonei marcatori selettivi (100 mg / ml ampicillina) e incubato per una notte in un agitatore orbitale a 37 ° C.
- La cultura cresciute overnight è stato inoculato in 500 ml di estratto di lievito Triptone 2X (2XYT) di media con 100 mg / ml ampicillina, e incubate in un agitatore orbitale a 37 ° C fino a quando il diametro esterno 600 di cultura raggiunto 0,8.
- L'espressione della proteina ricombinante Dnmt2 è stata indotta con l'aggiunta di isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 0,5 mM alla cultura. La cultura è stata ulteriormente incubato in un agitatore orbitale per 16 ore a 24 ° C. Il tempo e la temperatura di incubazione sono stati ottimizzati per evitare la formazione di corpi di inclusione.
- La cultura è stato centrifugato a 4 ° C, 6.000 giri al minuto, in 200 mL tubi Nalgene per 15 minuti. Il supernatante è stato scartato e il pellet è stato congelato a -70 ° C per almeno 1 ora. Questa fase di congelamento migliora la lisi dei batteri.
- Il pellet è stato raccolto in 30 ml di tampone di lisi (100 mM KCl, 1 mM DTT, 1mM PMSF, 100 mg / ml lisozima e Leupeptine 100 microg / mL in tampone salino fosfato (PBS)). Da questo punto, è stato fondamentale per mantenere il lisato su ghiaccio per evitare che l'inattivazione della proteina ricombinante. Il lisato è stato sonicato in un bagno di acqua e ghiaccio a fissare no. 4 di MSE (Londra, Regno Unito) sonifier (ad alta potenza, ampiezza 5, 30 impulsi secondi, 30 secondi per riposare 5 minuti). DNA batterico che può essere accompagnata da Ehmeth è stato rimosso con benzonasi nucleasi (Novagen) trattamento (5 U / ml di lisato sonicato), per 30 minuti in ghiaccio. La lisi è stato completato con l'aggiunta di 300 ml di reagente di estrazione di proteine BugBuster (Novagen) per 30 minuti a 4 ° C con agitazione su un agitatore orbitale (100 giri).
- Il ricombinante GST-Ehmeth proteina è stata purificata in condizioni native su un resina glutatione-agarosio secondo le istruzioni produce (Sigma). Per 25 ml di lisato, 500 ml di gocce di resina liquami sono stati aggiunti e incubate a 24 ° C per 1 ora.
- Le perle sono stati lavati due volte con tampone di lisi (10 volumi di tampone di lisi per volume di perline) e 6 volte con PBS freddo. Queste ampie lavare passi assicurazionee che non c'era rimangono benzonasi prima della fase di eluizione.
- Proteina ricombinante Ehmeth è stato eluito dalla perle agarosio glutatione incubando le perle con 5 ml di tampone di eluizione glutatione (Tris HCl 50 mM pH 8,0, glutatione (Sigma) 10 mM) per 12 ore a 4 ° C con rotazione dolce. Le perle sono stati rimossi mediante centrifugazione (2.000 rpm, 5 minuti) e il surnatante è stato raccolto.
- Il buffer di eluizione nel supernatante è stato sostituito da un buffer di memoria (KCl 200 mM, EDTA 10 mM, DTT 0,1 mM, Glicerolo 60% in PBS). A tal fine, 5 ml di sopranatante è stato caricato sul monte una Millipore microcontrollore YM-30 dispositivi centrifughi filtro (30 kDa tagliato colonna) e centrifugati a 8.000 giri per 20 minuti a 4 ° C. Il concentrato di proteine è stato diluito in tampone di conservazione (5 ml) e ricaricati sul dispositivo di filtro. La stessa procedura deve essere ripetuta almeno 3 volte a garantire la sostituzione completa del tampone di eluizione dal buffer di memoria. Infine la proteina concentrato deve essere diluito in circa 300 ml di buffer di memoria.
- La concentrazione della proteina ricombinante è stata misurata mediante un test di proteine Bradford. La preparazione enzima ricombinante è stato conservato a -20 ° C. Concentrazione finale dell'enzima non deve essere inferiore a 3 mg / mL come una concentrazione adatta per il test di metilazione.
- La preparazione di proteine è stata verificata mediante SDS-PAGE.
Avviso: per assicurare la preparazione di un enzima attivo, tutti i passaggi di purificazione dovrebbe essere fatto su ghiaccio e DTT dovrebbe essere rinnovato ed aggiunto al buffer di memoria. Questo assicura un enzima attivo per 6 mesi.
3. Test in vitro Metilazione tRNA
Soluzioni e reagenti che devono essere preparati:
- Soluzione 1 M di tris (idrossimetil) amminometano. Regolare il pH della soluzione a 8,0 con acido cloridrico concentrato (HCl).
- Metilazione del buffer 5X (MB): 100 mM Tris pH 8.0, 100mM NH 4 OAc, 0,1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2. La MB può essere preparato in anticipo e conservati a -20 ° C senza ditiotreitolo (DTT).
- Preparare il senza etichetta S-adenosilmetionina (AdoMet) stock (concentrazione finale 1,5 mm): mescolare 5 microlitri AdoMet (New England Biolabs, 32 mM concentrazione) con 101,67 ml di acqua distillata.
- 5% di soluzione di acido tricloroacetico (TCA)
- 100% di etanolo
- Scintillazione liquida 3 ml per flaconcino campione.
Il saggio:
- Uno schema pipeting è preparato (Tabella 2) per un volume di 40 microlitri finale di test di metilazione.
- In un tubo Eppendorf da 1,5 ml, tRNA è stato diluito con acqua trattata DEPC ad una concentrazione finale di 5 micron (1μg tRNA equivale a 40 pmol)
- 4 l di DTT è stato aggiunto (concentrazione della soluzione di riserva) a 8 ml di soluzione 5XMB.
- La soluzione tRNA è stata incubata a 85 ° C per 2 minuti e la soluzione preparata al punto 3 è stato aggiunto immediatamente ad esso. La miscela è stato permesso di raffreddare a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la piega tRNA correttamente.
- Il mix AdoMet (concentrazione finale 200 micron) è stato preparato mescolando 50 micron di etichettate AdoMet (250 μCi, 10,0 Ci / mmol, PerkinElmer) con 150 mM di AdoMet senza etichetta. Per un mix AdoMet adatto per 10 reazioni etichettatura, abbiamo miscelato 5,2 l di AdoMet senza etichetta (dalla soluzione diluita), 29 ml di AdoMet etichettati e 5,8 ml di acqua distillata.
- 4 l di mix AdoMet preparato sopra è stata aggiunta alla soluzione tRNA e incubate per 2 minuti a 37 ° C.
- Il metiltransferasi tRNA, Ehmeth (concentrazione 1-10 mM finale) è stata aggiunta alla soluzione contenente il substrato tRNA e l'etichetta-senza etichetta cofattore AdoMet. La miscela è stata incubata per 3 ore a 37 ° C. I tubi sono stati mescolati regolarmente durante il periodo di incubazione da parte delicatamente flipping. Una curva cinetica della reazione enzimatica è stata costruita prendendo ogni 20 minuti un campione (8 mL) dalla miscela di reazione per un periodo di tre ore.
- Ogni campione è stato subito notato al centro di un filtro Whatman (0,5 cm di diametro) e il filtro è imbevuto di una soluzione al 5% TCA e agitato in ghiaccio per 10 minuti (tranne per il campione AdoMet, la tabella 2 colonna E che non deve essere lavati). La fase di lavaggio con soluzione al 5% TCA è stato ripetuto altre due volte
- Il filtro è stato lavato con etanolo al 100% in ghiaccio per 10 minuti.
- Il filtro è stato asciugato all'aria per un minimo di 20 minuti.
- Ogni filtro essiccato è stato posto in un tubo (specifica) che è stato precedentemente riempito con 3 ml di liquido di scintillazione (CytoScint)
- La radioattività incorporato nel tRNA stava usando un contatore a scintillazione (Counter Beta Tri-Carb 2100TR).
4. Risoluzione dei problemi
- Valori elevati nella colonna A o B (tabella 3), i valori dei campioni di controllo sono state simili a quelle attese dal mreazione etilazione nella colonna C o D (tabella 3) → i filtri non sono stati lavati in modo corretto.
- Valori bassi nella colonna C o D (tabella 3), gli esperimenti di metilazione aveva valori simili alla reazione di controllo nella colonna A o B (tabella 3) → l'enzima non è stato preparato correttamente, nel senso che non c'era incorporazione Adomet. Un'altra opzione è che il tRNA è stato degradato e non era un substrato adatto per l'enzima, questo può essere verificato eseguendo il campione tRNA su un gel di acrilamide urea (vedi 1.2) e colorare il gel con bromuro di etidio per esaminare l'integrità dei tRNA .
- Valori bassi nella colonna D (tabella 3) → in quanto l'attività di Ehmeth è più debole allora hDnmt2 le prestazioni enzima può essere migliorata aumentando la concentrazione DTT nel buffer di memoria (può variare tra 1 e 10 mm) o di aumentare la concentrazione di enzima ovviare alla scarsa qualità dell'enzima.
- Valori bassi nella colonna E (Tabella 3) → questa colonna rappresenta il radioattività totale del valore AdoMet etichettati (indicato come 100%), se il valore in questa colonna è bassa significa che il AdoMet non è più attivo e ha perso la sua radioattività.
5. Rappresentante Risultati
| Reagente | Concentrazione finale | PCR - Programma | |||||
| Gentherm PCR Buffer | 1X | 1. | 90 ° C | 2 min | |||
| MgCl 2 | 3,0 mm | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP mix | 1,2 mm | 2. | 90 ° C | 30 s | 5. | 90 ° C | 30 s |
| Modello di DNA | 15,0 nM | 3. | 54 ° C | 30 s | 6. | 60 ° C | 30 s |
| Primer avanti | 3,0 mM | 4. | 72 ° C | 45 s | 7. | 72 ° C | 45 s |
| Primer reverse | 3,0 mM | 2.-4. 10 cicli | 5.-7. 25 cicli | ||||
| Taq polimerasi | 0,1 U / mL | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Ad 50 microlitri | coperchio di 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 min | ||
Tabella 1: schema di pipette per PCR e programma PCR.
A | B Controllo negativo (TRNA solo) | C Controllo positivo con umana Dnmt2 | D Reazione di serie (Enz Sost + + Cof) | E Valore totale dei AdoMet sul filtro | |
| tRNA | - | (3 mg) | (3 mg) | (3 mg) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 mg) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 mg) | (2,48 mg) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Totale | 40 microlitri | 40 microlitri | 40 microlitri | 40 microlitri | 1 ml |
Tabella 2:. Esempio di schema pipeting Ogni colonna nello schema rappresenta un campione.
* Sia Ehmeth e hDnmt2 sono stati fusi in un tag GST con una dimensione stimata proteina di 62 kDa.
A-negativo di controllo che include solo Ehmeth.
B-negativo di controllo che include solo tRNA.
C-Controllo positivo con Dnmt2 umano. Questo enzima ha dieci più un tempoTTIVITÀ di Ehmeth
D-standard di reazione che comprende l'enzima, il substrato e il cofattore
E-Valore totale della AdoMet sul filtro. Questo valore viene utilizzato per il calcolo della percentuale di gruppo integrato di metile.
| A Controllo negativo (Ehmeth solo) | B Controllo negativo (TRNA solo) | C Controllo positivo con umana Dnmt2 | D Reazione di serie (Enz Sost + + Cof) | E Valore totale dei AdoMet sul filtro | |
| cpm | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Tabella 3:. Esempio di valori letti dal contatore a scintillazione Ogni colonna nello schema rappresenta un campione della Tabella 1.
Figura 1: (A) modello di trascrizione T7 e primer per la trascrizione in vitro. Tutte le sequenze sono scritte in 5 'a 3' orientamento. ColorCode: vedi testo. (B) Schema di formazione del prodotto durante la trascrizione. La trascrizione RNA è sintetizzato da RNA polimerasi di T7. Hammerhead ribozima e tRNA volte nei loro rispettivi 2D-strutture e il ribozima si unirà del tRNA uscita da un gruppo ossidrile al loro 5'-end (adattato da 9).
Figura 2:. Reazione di controllo di PCR su un 1,3% gel prestained con 1X GelRed reazioni PCR su due diversi modelli a cui si affiancano più di 100 paia di basi scala. Controlli includono un "modello unico" corsia e reazioni in cui è stato omesso il primer reverse.
Figura 3:. UV-shadowing PAGE Una separazione di due miscele trascrizione è mostrato. Bande di trascrizioni precursore (prima scissione), pieno lunghezza tRNA e martello ribozima diventano visibili come le ombre in quanto impediscono ai raggi UV di raggiungere la piastra fluorescente TLC. TRNA totale E. coli è utilizzato come marcatore di dimensione.
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Discussion
In questa presentazione, abbiamo illustrato come preparare componenti attivi per la misura dell'attività tRNA metiltransferasi di E. histolytica Ehmeth enzima. Questa procedura può servire come punto di partenza ed essere facilmente adattato per la misura della metiltransferasi tRNA altri. E 'importante seguire le procedure che preservano la qualità e l'integrità del substrato tRNA e della proteina tRNA metiltransferasi per assicurare una misura ottimale della attività enzimatica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation e l'Istituto per la Famiglia Rappaport ricerca nelle scienze mediche, e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
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