Summary
Этот протокол описывает подготовку синтетический субстрат для тРНК
Abstract
Простейшие паразиты являются одними из самых разрушительных инфекционных агентов человека ответственным за различных заболеваний, включая амебиаз, который является одним из трех наиболее распространенных причин смерти от паразитарных заболеваний. Агент амебиаза является амеба Entamoeba histolytica паразит, который существует в рамках двух этапов: инфекционного кисты содержатся в пище или воде и инвазивных жизни трофозоит в кишечнике. Клинические проявления амебиаза диапазоне от бессимптомных до колит, дизентерия, или абсцессы печени. E. histolytica является одним из редких одноклеточного паразита с 5-метилцитозин (5mC) в своем геноме. 1, 2 содержит один ДНК-метилтрансферазы, Ehmeth, который принадлежит Dnmt2 семьи. 2 Dnmt2 роль в контроле за повторяющихся элементов имеет была создана в E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 и дрозофилы. 6 Наши последние исследования показали, что Ehmeth метилирует тРНК Asp, и эти данные показывают, что этот фермент имеет двойную ДНК / тРНК Asp метилтрансферазы деятельности. 7 Это наблюдение согласуется с двойной активностью , которые были сообщены для D. discoideum и D. MELANOGASTER 8. функциональное значение ДНК / специфичность тРНК Dnmt2 ферменты, пока неизвестно. Для решения этого вопроса, метод определения тРНК метилтрансферазы деятельности Dnmt2 белков была создана. В этом видео мы опишем простой подход для подготовки адекватного субстрата тРНК для Dnmt2 и метод измерения его тРНК метилтрансферазы деятельности.
Protocol
Предпосылки Перед началом эксперимента:
- РНКазы без воды используется в обработке РНК в лаборатории, чтобы уменьшить риск РНК деградирует от РНКазы. Для этого воду обычно лечится с 0,1% об. / diethylpyrocarbonate (DEPC) не менее 1 часа при температуре 37 ° С и затем автоклавного (по крайней мере 15 мин) для инактивации следы DEPC.
- Pipetman пипетки моют решение РНКазы дезактивации (РНКазы истребитель, биологической промышленности Бейт ха-Эмек) перед использованием.
- Эппендорф труб и советы должны быть сертифицированы как свободные ДНКазы и РНКазы сохранить образец честности.
1. тРНК Asp подготовка
Эта процедура описывает, в пробирке стоки транскрипции, которые могут быть использованы для синтеза любых тРНК. Эта процедура адаптации рибозим метод опубликованы ранее. 9 С этой целью был разработан шаблон, состоящий из промоутер T7 и дополнительных последовательностей самостоятельно рассекая молот рибозим и требуется тРНК. Транскрипция этого шаблона приводит продукта расщепления себя на 5 `-конец таким образом, что во всю длину тРНК, полученных с 5`-ОН, а не фосфорилированных 5 `-конце. Полнометражный тРНК может быть очищена от расщепляется молот рибозим и uncleaved продукции мочевины-PAGE.
- ПЦР праймера и шаблона дизайна:
Для того чтобы получить эффективный шаблон для Т7 РНК-полимеразы в транскрипции опосредованное пробирке три требования должны быть выполнены.- T7-промотора (5 `-TAATACGACTCACTATA-3`) должен быть замешан в шаблоне.
- Для повышения эффективности транскрипции, первые три нуклеотидов РНК транскрибируется должны быть гуанозин.
- Правильное комплементарную последовательность конкретных тРНК необходима.
- ПЦР
Для усиления ДНК-матрицы, мы использовали стандартные реакции ПЦР в конечном объеме 50 мкл. В таблице 1 подробно конечные концентрации (реакция подготовлена на льду) и программа для ПЦР. Низкие температуры отжига используются во время первых 10 циклов составляет лишь частичного связывания прямого праймера для ДНК. Для уменьшения неспецифического связывания температура отжига была увеличена для дальнейшего 25 циклов амплификации.
Успех шаблон усиление было проверено 1,3% агарозном геле prestained с 1X GelRed решения (рис. 2). - Транскрипция
- T7 премикса можно приготовить 5X концентрированный (200 мМ Трис-HCl, рН 8,1, 30 мМ MgCl 2, 1 мМ спермидина, 5 мМ ДТТ, 2 мкг / мл БСА и 0,01% Тритон Х-100) и использовался в течение по крайней мере один неделю или пяти циклов замораживания-оттаивания.
- Транскрипции смеси должна быть подготовлена при комнатной температуре.
- Транскрипция реакции были подготовлены с использованием 80 мкл премикс T7, 80 мкл продукта ПЦР, 80 мкл смеси NTP (25 мМ) и доводили до 385 мкл с водой MilliQ. 15 мкл (1,34 мг / мл) Т7 РНК-полимеразы (конечная концентрация 0,05 мкг / мкл) добавляются в начало реакции.
- Реакцию проводили в течение 4 часов при температуре 37 ° C. Белый осадок пирофосфата указывает на успешное транскрипции.
- Очистка
- Пирофосфат был остановлен в течение 1 минуты при 10000 оборотах в минуту.
- Супернатанты поставляется с одним объемом formamid загрузки красителя и очищены на 12%, карбамидо-страницы с помощью20 Вт в течение 2 часов. Отключите геля и поместите его на Саран обертывание.
- Пятно гель с 3XGelRed решением дополнены 0,1 М NaCl в течение 20 минут. При УФ-возбуждения, лейбл группы тРНК на Саран обертывание с перманентным маркером для последующего удаления. Или же, если ожидаемая доходность выше 50 мкг полосы можно увидеть, УФ-слежка. Для УФ-слежки, место гель на флуоресцентные тонкослойной хроматографии пластине и осветить с УФ-лампой стороны сверху. Этикетка полосы, которые появляются как не флуоресцентные тени в гель (рис. 3), для последующего удаления.
- тРНК полосы вырезают скальпелем и введено в 1,5 мл чашки Эппендорф.
- После добавления 450 мкл 0,5 М NH 4 OAc образцы замораживали при -80 ° С в течение 2 часов, а затем инкубировали при 20 ° С, дрожа от 550 оборотов в минуту на Эппендорф Thermoshaker за ночь. 6. Супернатант NH 4 OAc решений, начиная с шага 5 фильтруются с Nanosep труб (0,45 мкм), спиннинг 90 секунд при 8500 оборотов в минуту, чтобы удалить страницу мусора.
- Осаждение элюировали тРНК было выполнено путем добавления 2,5 объемы -80 ° С чистого этанола (в год), хранение при температуре -20 ° С в течение ночи и 2,5 ч центрифугированием при 4 ° С и 15500 оборотов в минуту.
- После удаления надосадочной гранулы сушили в SpeedVac и ресуспендировали в воде MilliQ.
- Концентрации определялись с помощью Nanodrop-ND1000. Выход один 400 мкл транскрипции было около 80-100 мкг.
Устранение неполадок:
- Ни один продукт ПЦР. → Является ли последовательность праймеров и шаблоны совместимы и все внутренние компоненты реакционной смеси?
- Нет транскрипции продукта. → ПЦР может не увенчались успехом. Правильное T7-промотора. Решения слишком холодно при подготовке реакции. T7 Премикс слишком стар.
- Продукт на гель, но не элюируется продукта. → этанола для осаждения не достаточно холодно, а не чистой, а не правильный объем.
2. Выражение и очистка рекомбинантных E. histolytica Dnmt2 (Ehmeth) Белок в E. кишечной BL21
Этот протокол также подходит для подготовки Dnmt2 белков человека 10 и дрозофилы. 11
- E. histolytica Ehmeth гена усиливается с помощью ПЦР, клонировали в pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) и проверяться с помощью секвенирования
- Рекомбинантная плазмида была преобразована в E. палочка (BL21) для экспрессии рекомбинантных белков.
- Преобразованный бактерий были отобраны на Лурия-Бертани (LB) агар ампициллин (100 мкг / мл) среды. Четыре-пять колоний были подхвачены и засевают в 5 мл LB среды с подходящей селективного маркера (100 мкг / мл ампициллина) и инкубировали в течение ночи в орбитальном шейкере при температуре 37 ° C.
- Культуры выращивали в течение ночи вносили в 500 мл 2 раза Дрожжевой экстракт триптон (2XYT) среды с 100 мкг / мл ампициллина, и инкубировали в орбитальном шейкере при 37 ° С до OD 600 из культура достигла 0,8.
- Выражение Dnmt2 рекомбинантного белка было вызвано добавлением изопропил-бета-D-thiogalactopyranoside (IPTG) в конечной концентрации 0,5 мМ до культуры. Культуру инкубировали в дальнейшем орбитальном шейкере в течение 16 часов при температуре 24 ° C. Времени и температуры инкубации были оптимизированы, чтобы избежать образования телец включения.
- Культуры центрифугировали при 4 ° С, 6000 оборотов в минуту, в 200 мл Nalgene труб на 15 минут. Супернатант удаляют, а осадок замораживают при температуре -70 ° С в течение не менее 1 часа. Это замораживание шаг повышает лизис бактерий.
- Осадок собирают в 30 мл лизирующего буфера (100 мМ KCl, 1 мМ DTT, 1мМ PMSF, 100 мкг / мл лизоцима и Leupeptine 100 мкг / мл в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS)). С этой точки зрения крайне важно сохранить лизата на лед, чтобы предотвратить инактивацию рекомбинантного белка. Лизат ультразвуком в ледяной бане при задании нет. 4 из MSE (Лондон, Соединенное Королевство) sonifier (мощность высока, амплитуда 5, 30 секунд пульс, 30 секундная пауза в течение 5 минут). ДНК бактерий, которые могут быть прикреплены к Ehmeth был удален с Benzonase нуклеазы (Novagen) лечение (5 ЕД / мл ультразвуком лизат), в течение 30 минут на льду. Лизиса была завершена путем добавления 300 мкл BugBuster белка добычи реагента (Novagen) в течение 30 минут при 4 ° С с нежным агитации на орбитальном шейкере (100 оборотов в минуту).
- Рекомбинантных GST-Ehmeth белок очищали под родной условий на глутатион-агарозы смолы в соответствии с инструкциями производств (Sigma). В течение 25 мл лизат, 500 мкл суспензии из бисера смолы и инкубируют при 24 ° С в течение 1 часа.
- Шарики дважды промывают лизис буфера (10 томов лизис буфера на объем бусы) и в 6 раз с холодным PBS. Эти обширные шаги мыть гарантировать, что не было никакого остаются Benzonase до elutioн шагом.
- Рекомбинантного белка Ehmeth элюировали из бисера глутатион агарозы путем инкубации бусин с 5 мл буфера элюирования глутатион (Трис-HCl 50 мМ рН 8,0, глутатион (Sigma) 10 мМ) в течение 12 часов при 4 ° С с легким вращением. Бусины были удалены путем центрифугирования (2000 оборотов в минуту, 5 минут) и супернатант была собрана.
- Элюции буфера в супернатант был заменен хранения буфера (200 мМ KCl, 10 мМ ЭДТА, 0,1 мМ DTT, глицерин 60% в PBS). Для этого 5 мл надосадочной был загружен на вершине Millipore микроконтроллер YM-30 центробежный фильтр устройства (30 кДа отрезать колонка) и центрифугировали при 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут при 4 ° C. Протеиновый концентрат разбавляют в буфере хранения (5 мл) и перегружены на фильтр устройства. Такую же процедуру следует повторять не менее 3 раз, чтобы обеспечить полную замену элюции буфера хранения буфера. Наконец концентрированный белок должен быть разбавлен примерно в 300 мкл буфера хранения.
- Концентрация рекомбинантного белка измеряли анализа белка Брэдфорде. Рекомбинантный препарат фермента хранили при -20 ° C. Конечная концентрация фермента не должна быть менее 3 мкг / мкл в качестве подходящей концентрации для метилирования анализа.
- Белкового препарата была проверена на SDS-PAGE.
Обратите внимание: чтобы обеспечить подготовку активного фермента, все этапы очистки следует делать на льду и DTT должна быть свежеприготовленной и добавлен в хранилище буфера. Это гарантирует, активного фермента в течение 6 месяцев.
3. В пробирке Анализ метилирования тРНК
Решения и реагенты, которые должны быть подготовлены:
- 1 М раствора трис (гидроксиметил) аминометан. Отрегулируйте рН раствора до 8,0 концентрированной соляной кислоты (HCl).
- 5X буфера метилирования (Мб): 100 мМ Трис рН 8,0, 100 мМ NH 4 OAc, 0,1 мМ EDTA, 10 мМ MgCl 2. МБ можно приготовить заранее и хранить при температуре -20 ° С без дитиотреитол (DTT).
- Подготовка немеченого S-аденозилметионина (AdoMet) акции (конечная концентрация 1,5 мм), смешивая 5 мкл AdoMet (Новая Англия Биолабс, 32 мМ концентрации) с 101,67 мл дистиллированной воды.
- 5% трихлоруксусной кислотой (ТСА)
- 100% этанола
- Сцинтилляционные жидкости 3 мл на пузырек.
Анализа:
- Pipeting схема подготовлена (табл. 2) для 40 мкл конечного объема метилирования анализа.
- В 1,5 мл Eppendorf трубки, тРНК разбавляли DEPC очищенной воды до конечной концентрации 5 мкМ (1 мкг тРНК эквивалентно 40 пмоль)
- 4 мкл DTT была добавлена (концентрации маточного раствора) до 8 мкл 5XMB решение.
- Решение тРНК инкубировали при 85 ° С в течение 2 минут и раствор, приготовленный на шаге 3 был добавлен непосредственно к нему. Смесь охладить при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы тРНК раз правильно.
- Смесь AdoMet (конечная концентрация 200 мкМ) получали путем смешивания 50 мкМ меченых AdoMet (250 мкКи, 10,0 Ки / ммоль, PerkinElmer) с 150 мкМ немеченого AdoMet. Для смеси AdoMet подходит для 10 реакций маркировки, мы смешанных 5,2 мкл немеченого AdoMet (от разбавленного раствора), 29 мкл меченых AdoMet и 5,8 мкл дистиллированной воды.
- 4 мкл смеси AdoMet полученного выше был добавлен в решение тРНК и инкубировали в течение 2 минут при 37 ° C.
- ТРНК метилтрансферазы, Ehmeth (1-10 мкМ конечная концентрация) добавляют к раствору, содержащему подложку тРНК и меченых немеченого AdoMet кофактора. Смесь инкубировали в течение 3 часов при 37 ° C. Трубы были смешаны регулярно во время инкубации, осторожно листать их. Кинетической кривой ферментативной реакции был построен с каждые 20 минут образца (8 мкл) из реакционной смеси в течение трех часов.
- Каждый образец сразу увидел в центре ватмана фильтр (0,5 см в диаметре) и фильтр пропитанную 5% ТСА решение и перемешиваются на льду в течение 10 минут (за исключением образцов AdoMet, таблица 2 Колонка E, что не должно быть мыть). Промывки с 5% ТСА решение повторялось еще два раза
- Фильтр промывают 100% этанола на льду в течение 10 минут.
- Фильтр сушили на воздухе в течение минимум 20 минут.
- Каждый сушеные фильтр был помещен в трубку (спецификации), который был ранее заполненную 3 мл сцинтилляционной жидкости (CytoScint)
- Радиоактивности включены в тРНК с помощью сцинтилляционного счетчика (Counter Бета Tri-Carb 2100TR).
4. Поиск неисправностей
- Высокие значения в столбце или В (табл. 3), значения контрольной пробы были аналогичны тем, ожидать от реакции метилирования в колонке C или D (табл. 3) → фильтры не мыть правильно.
- Низкие значения в столбце C или D (табл. 3), метилирование эксперименты с аналогичными значениями для управления реакцией в колонке или В (табл. 3) → фермента не была подготовлена правильно, а это означает, что нет включения Adomet. Другой вариант заключается в том, что тРНК деградированных и не был подходящим субстратом для фермента, это можно проверить, запустив пример тРНК на гель акриламида мочевины (см. п. 1.2) и окрашивания геля бромидом этидия изучить целостность тРНК .
- Низкие значения в столбце D (табл. 3) → с деятельностью Ehmeth слабее, то hDnmt2 фермента производительность может быть повышена за счет увеличения концентрации в DTT хранения буфера (может быть в диапазоне от 1 до 10 мм) или для повышения концентрации ферментов для смягчить низкое качество фермента.
- Низкие значения в столбце Е (табл. 3) → этот столбец представляет общую радиоактивность меченого AdoMet стоимости (за 100%), если значение в этом столбце низка это означает, что AdoMet больше не является активным и потерял свою радиоактивности.
5. Представитель Результаты
| Реагент | Конечная концентрация | ПЦР - программа | |||||
| Gentherm ПЦР-буфера | 1X | 1. | 90 ° C | 2 мин | |||
| MgCl 2 | 3,0 мМ | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| дНТФ смеси | 1,2 мм | 2. | 90 ° C | 30 с | 5. | 90 ° C | 30 с |
| Шаблон ДНК | 15,0 нМ | 3. | 54 ° C | 30 с | 6. | 60 ° C | 30 с |
| Форвард Primer | 3,0 мкМ | 4. | 72 ° C | 45 с | 7. | 72 ° C | 45 с |
| Обратный праймер | 3,0 мкМ | 2.-4. 10 циклов | 5.-7. 25 циклов | ||||
| Taq-полимеразы | 0,1 ед / мкл | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | Объявление 50 мкл | Крышка 95 ° C | 8. | 72 ° C | 3 мин | ||
Таблица 1: Внесите схемы для ПЦР и ПЦР программы.
| Отрицательный контроль (Ehmeth только) | B Отрицательный контроль (ТРНК только) | C Положительный контроль с человеческим Dnmt2 | D Стандартная реакция (ЭНЦ + + индуктор COF) | E Общая стоимость AdoMet на фильтре | |
| тРНК | - | (3 мкг) | (3 мкг) | (3 мкг) | - |
| hDnmt2 | - | (2,48 мкг) | - | ||
| Ehmeth | (2,48 мкг) | (2,48 мкг) | |||
| МБ | 8 | 8 | 8 | 8 | - |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | - |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| DDW | - | ||||
| Общий | 40 мкл | 40 мкл | 40 мкл | 40 мкл | 1 мкл |
Таблица 2. Пример pipeting схема Каждый столбец в схеме представляет собой один образец.
* Оба Ehmeth и hDnmt2 были слиты с тегом GST по оценкам, размер белка 62 кДа.
-Отрицательный контроль, который включает Ehmeth только.
B-Отрицательный контроль, который включает только тРНК.
C-Положительный контроль с человеческим Dnmt2. Этот фермент имеет десять раз больше активности, чем Ehmeth
D-Standard реакция, которая включает в себя фермента, субстрата и кофактора
E-Общая стоимость AdoMet на фильтре. Это значение используется для расчета процента метильной группы включены.
| Отрицательный контроль (Ehmeth только) | B Отрицательный контроль (ТРНК только) | C Положительный контроль с человеческим Dnmt2 | D Стандартная реакция (ЭНЦ + + индуктор COF) | E Общая стоимость AdoMet на фильтре | |
| копий в минуту | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
Таблица 3. Пример значений читают сцинтилляционных счетчиков Каждый столбец в схеме представляет собой одну выборку из таблицы 1.
Рисунок 1: () T7 шаблон транскрипции и грунтовки для экстракорпорального транскрипции. Все последовательности написаны в 5 'к 3' ориентации. Colorcode: см. текст. (B) Схема образования продукта во время транскрипции. Транскрипта РНК синтезируется полимераза T7 РНК. Hammerhead рибозим и тРНК сворачиваются в соответствующих 2D-структур и рибозим расщепляет себя тРНК оставляя гидроксильные группы на их 5'-конце (адаптировано из 9).
Рисунок 2:. ПЦР-реакции управления на 1,3% агарозном геле prestained с 1X GelRed реакции ПЦР на двух разных шаблонов показаны наряду с 100 пар оснований плюс лестница. Система контроля предусматривает "шаблон только" полосы движения и реакции, в которых обратный праймер был опущен.
Рисунок 3. УФ-слежка СТРАНИЦА разделения двух смесей транскрипции показано на рисунке. Полосы предшественником стенограммы (до дробления), полная длина тРНК и молот рибозим становятся видны, как тени, так как они предотвратить ультрафиолетовый свет от достижения флуоресцентные пластины ТСХ. Всего тРНК из Е. палочка используется как размер маркера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации мы показали, как подготовить активных компонентов для меры тРНК метилтрансферазы деятельность Е. histolytica Ehmeth фермента. Эта процедура может служить отправной точкой и быть легко адаптированы для других меру метилтрансферазы тРНК. Важно следовать процедурам, которые сохраняют качество и целостность подложки тРНК и тРНК метилтрансферазы белка, чтобы обеспечить оптимальную меру ферментативной активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами от Израиля научного фонда и института семьи Раппапорт по исследованиям в области медицинских наук и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
