Summary
Это видео демонстрирует протокол применения neurosphere тест для изоляции и расширения нервные стволовые клетки из ганглиозные возвышения эмбриональных день 14-мозга мыши.
Abstract
В млекопитающих, стволовые клетки действует как источник недифференцированных клеток для поддержания генезисе клеток и восстановление в различных тканях и органах в течение жизни животного. Они могут потенциально заменить клетки, которые теряются в процессе старения или в процессе получения травмы и болезни. Существование нервные стволовые клетки (NSCs) впервые был описан Рейнольдса и Вайса (1992) у взрослых млекопитающих, центральной нервной системы (ЦНС), используя новые бессывороточной культуре системы, neurosphere анализа (NSA). С помощью этого теста, это также возможно, чтобы изолировать и расширить NSCs из разных регионов эмбриональных ЦНС. Это, в пробирке NSCs расширяемых мультипотентных и может привести к трем основным типам клеток центральной нервной системы. Хотя АНБ кажется относительно прост в исполнении, внимание к процедурам продемонстрировали здесь требуется для достижения надежных и устойчивых результатов. Это видео демонстрирует практически АНБ для создания и расширения NSCs из эмбриональных день 14-мышь мозговой ткани и содержит техническую информацию, таким образом можно достичь воспроизводимых культур neurosphere. Процедура включает в себя уборка E14 эмбрионов мышей, мозг микродиссекции собрать ганглиозные возвышения, диссоциация собрано ткани в среде НСК для получения суспензии отдельных клеток и, наконец, покрытие клеток в культуре АНБ. После 5-7 дней в культуре, в результате первичного нейросферы являются пассировали для дальнейшего расширения числа NSCs для будущих экспериментов.
Protocol
1. Основные настройки Прежде чем приступить к Препарирование:
- Соответствующие объемы полной среде НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно.
- Средний разогревается в 37 ° С водяной бане.
- Холодная HEPES буфером минимальной необходимой среде (ВЭМ) с высокой концентрацией антибиотиков (10%) получают для вскрытия и стиральные цели. Кроме того, НСК базальной среды с дополнением антибиотиков может также использоваться для этой цели.
- 25-30 мл холодной HEM, содержащие антибиотики разливают в стерильные 50 мл пробирки для сбора эмбрионов.
- Несколько 10см пластиковые чашки Петри необходимо провести эмбрионов и мозг во время вскрытия, а также провести расчлененный ткани.
- Хирургические инструменты, необходимые для удаления эмбрионов (большие ножницы, маленькие ножницы отметил, большие щипцы, маленькие изогнутые щипцы), или для эмбрионального вскрытия головного мозга (малый щипцов, изогнутых тонких щипцов, 45 ° угловой штраф щипцы, и маленькие ножницы) стерилизуют использованием стеклянная бусина стерилизатора при температуре 250 ° С или другим доступным методам автоклаве.
- Препарирование микроскоп протирают 70% спиртом и создать внутри ламинарного потока или PC2 капотом.
2. Сбор E14 мозга мыши и Micro-рассечение:
- Время повязана беременных мышь под наркозом в день 14-й беременности в соответствии со своими институциональными утвержденным животных протокола.
- Шейки дислокации осуществляется, чтобы убедиться, животное не страдать от боли и страданий.
- Наркозом мыши укладывается на спину на фильтровальной бумаги ткани и живота промывают 70% этанолом для стерилизации области.
- Кожа на животе захватывается с помощью большого пинцета, а затем кожу и лежащий в основе фасции разрезают с большими ножницами, чтобы разоблачить брюшной полости и рогов матки.
- Матки удаляются с небольшим пинцетом и ножницами и переносят в 50-мл коническую трубку содержащих холодного HEM.
- Матке передаются на капот, а затем промыть несколько раз с достаточным объемом свежего холодного стерильного HEM для удаления возможных загрязнений, как кровь и волосы.
- Маточной ткани затем перевели в 10 см блюдо Петри с холодной HEM.
- Рогах матки открываются с помощью небольших изогнутых щипцов и ножниц и эмбрионы переносятся на новое блюдо 10 см, который содержит холодной HEM.
- Главы эмбрионы разделяются на шейный уровне спинного мозга, и переданы другому чашке Петри содержащие холодной HEM.
- Чашке Петри, передается согласно рассекает микроскопом, чтобы удалить мозг от черепа.
- Главы проводятся с тонкой изогнутой щипцы из хвостовой стороне, так как спинной стороне головки вверх. Использование микро-ножницы, первый горизонтальный надрез над глазами, а затем продолжил в средней линии от лба к затылку. Убедитесь в том, чтобы прорваться через кожу и череп и, чтобы не повредить лежащий в основе мозга.
- Мозг удален из черепа, нажав края разреза сечения в обратном движения с помощью изогнутых щипцов. Эта процедура продолжается, пока все мозги удаляются из черепов.
- Мозг неизменным использованием изогнутых щипцов, так что спинной стороне вверх и затем с помощью microscissors разрез выполняется через коре каждого полушария простирается от обонятельных луковиц к задней части полушария подвергать ганглиозные возвышения.
- Использование изогнутых щипцов в одной руке и 45 ° угловой щипцами в другой, вырезать полы коре распространение и ганглиозные возвышенности расчленены из.
- Расчлененный ткани помещают в стерильную чашку Петри 10 см, и эта процедура повторяется, пока все мозги были микро-расчленены.
- Ткань части собраны с использованием 1 мл среды НБК в 1 мл пипетки и переносят в 15 мл центрифужную пробирку.
- Ткань затем диссоциирован тщательно, но осторожно, нажимая кончиком пипетки на дне пробирки и пипетки подвески вверх и вниз. Таким образом, сгустки разбиты на отдельные клетки. Пипетирование проводится 3-4 раза, так что, как молочный подвески достигается. Затем, подвеска разрешили селиться в течение 1-2 минут, так как не-диссоциированных скопления осадков.
- Почти весь суспензии клеток передается в другую трубу, а затем еще на 1 мл среды НСК добавляется к оставшимся сгустки и диссоциированных в одной ячейке, как описано.
- Содержание трубы собирали и центрифугировали в течение 5 минут при комнатной температуре, при 700rpm (110г).
- Супернатант пылесосом от до фактического гранул, а также клетки ресуспендировали в 1 мл полной среды НСК.
- Среда осторожно пипеткой вверх и внизесть однородная суспензии отдельных клеток.
- 10 мкл суспензии клеток смешивают с 90 мкл трипанового синего выполнять клеток.
- Наконец, клетки высевают на плотность 2х10 5 клеток / мл в полной среде НСК дополнен 20ng / мл эпидермального фактора роста (EGF). 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колб.
- Нейросферы формируются в течение 5-7 дней, когда инкубировали при 37 ° С в увлажненной инкубаторе с 5% CO 2. В 6-7 дней, сферы должны измерять между 150-200 микрон, и будет готов к субкультуре (прохода).
3. Пассажей и расширения эмбриональных NSCs:
- Когда нейросферы готовы к субкультуре (150-200 мкм в диаметре), среда с приостановлено сферы удаляется из колбы, размещенные в соответствующих размеров стерильную пробирку культуре ткани, и центрифугировали со скоростью 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Супернатант отбрасывается и сфер ресуспендируют в 1 мл 0,05% трипсин-ЭДТА.
- Клеточной суспензии затем инкубировали в 37 ° С водяной бане в течение 2-3 мин, затем равный объем сои ингибитор трипсина используется для остановки трипсина деятельности.
- Клеточной суспензии осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы трипсина был полностью инактивируется.
- Клеточной суспензии центрифугируют при 700 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли, а клетки ресуспендируют в 1 мл полной среды НСК.
- 10 мкл суспензии клеток смешивают с 90 мкл трипанового синего выполнять клеток.
- Клетки высевают при концентрации 5х10 4 клеток / мл в полной среде НСК дополнен 20ng / мл ЭФР в соответствующие колбы культуре ткани размером. 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колб.
- Вторичные нейросферы формируются в течение 5-7 дней, когда инкубировали при 37 ° С в увлажненной инкубатор с 5% CO 2.
4. Представитель Результаты:
В первичной культуре эмбриональных НСК, большинство клетки станут гипертрофических и приложить к культуре ткани блюда на обшивке. В то время как большинство клеток будет либо умереть или дифференцироваться, через 2-3 дня, пролиферативные клетки делают небольшие скопления клеток, которые будут отключаться от подложки (рис. 1). Формирование большие сфероидальные агрегатов в первой 48-часовой культуры не следует принимать за основной сферы. Совокупный образование в основном зависит от количества мусора и не диссоциированных тканей скопления в культуре. Правда нейросферы фазе яркие и становятся более сферическими как размер увеличивается (рис. 2). Малый microspikes появляется на внешней поверхности жизнеспособным и здоровым сфер (рис. 3). После 5-7 дней, сферы должна быть круглой, но не сжимаются, и должны измерить от 150 до 200 мкм в диаметре. Если нейросферы могут расти слишком большой (после 9-10 дней в культуре), они могут образовывать агрегаты или становятся темного цвета из-за гибели клеток в центре сферы (см. видео). Большой нейросферы может в конце концов начинают дифференцироваться на месте (прикрепление к субстрату и мигрируют по направлению к периферии). Кроме того, трудно отделить большие нейросферы и субкультуры них.
Рисунок 1. Первичные E14 НСК культуры через 3 дня после металлизации. Стрелками показаны пролиферирующих кластеров NSCs. Оригинальные увеличении; 20x
Рисунок 2. Первичные E14 НСК культуры 7 дней после покрытия. Оригинальные увеличении; 10x
Рисунок 3. Прохождение один E14 нейросферы 5 дней после покрытия. Обратите внимание, микро-шипы (стрелки) на периферии сферы. Оригинальные Увеличение; 20x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurosphere анализ является методом выбора для изоляции и расширения нервные стволовые клетки 1-5 из-за своей простоты и воспроизводимости. Этот анализ является бесценным инструментом для крупномасштабных поколения недифференцированных предшественников нервной клетки, которые могут быть использованы для как в пробирке и в естественных исследованиях. Следует подчеркнуть, что нейросферы могли быть получены как из добросовестных нервные стволовые клетки и более ограниченным прародителей. Поэтому, вычисляя neurosphere формирования частоты просто переоценивает количество добросовестных NSCs в той или иной нейронной популяции клеток 6. Для оценки частоты добросовестных NSCs, настоятельно рекомендуется использовать нейронные колонии Формирование сотовых анализ (N-ЦАФД), который был разработан для этой цели 7.
Для того, чтобы последовательно высокой культуры neurosphere качество E14 NSCs, мы рекомендуем:
- Для подготовки необходимых вещей, прежде чем начать сбор эмбрионов.
- Чтобы сохранить эмбрионов в холодной HEM или базальной среды НСК всей рассечение.
- Чтобы выполнить рассечение как можно быстрее (в течение 1 ч), а ткань становится мягкой и липкой с течением времени и может быть трудно анализировать.
- Не дать сферы расти слишком много. Как правило, они должны быть суб-культурных каждые 5-7 дней в зависимости от размера шаров.
- Для trypsinize сферы в размере 150-200 мкм в течение 2-3 минуты. Оставив трипсина в течение более 3 минут приводит к повреждению клеток и сфера формирования эффективность будет уменьшаться, а клетки, как правило, придают блюдам культуры и дифференцировать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование из Оверстрит Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
