Summary
यह वीडियो neurosphere परख के अलगाव और भ्रूण 14 माउस मस्तिष्क दिन के ganglionic eminences से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के विस्तार के लिए आवेदन प्रोटोकॉल को दर्शाता है.
Abstract
Mammalians में स्टेम कोशिकाओं undifferentiated कोशिकाओं के एक स्रोत के जानवर के जीवन काल के दौरान सेल और विभिन्न ऊतकों और अंगों में उत्पत्ति नवीकरण को बनाए रखने के रूप में कार्य करता है. वे संभवतः कोशिकाओं है कि उम्र बढ़ने की प्रक्रिया में या चोट और बीमारी की प्रक्रिया में खो रहे हैं जगह ले सकता है. तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के अस्तित्व में पहली बार वयस्क स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) प्रणाली के एक उपन्यास सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली, neurosphere परख (एनएसए) का उपयोग रेनॉल्ड्स और Weiss (1992) के द्वारा वर्णित किया गया था. इस परख का प्रयोग, यह भी है को अलग करने और भ्रूण सीएनएस के विभिन्न क्षेत्रों से एनएससी का विस्तार संभव है. इन विट्रो विस्तारित एनएससी में इन multipotent हैं और सीएनएस के तीन प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं को जन्म दे सकते हैं. जबकि एनएसए अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान लगता है, यहाँ का प्रदर्शन प्रक्रियाओं को ध्यान क्रम में विश्वसनीय और संगत परिणामों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस वीडियो को व्यावहारिक एनएसए उत्पन्न करने के लिए और भ्रूण दिन से एनएससी का विस्तार 14-माउस मस्तिष्क के ऊतकों को दर्शाता है और तकनीकी जानकारी प्रदान करता है तो एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य neurosphere संस्कृतियों प्राप्त कर सकते हैं. प्रक्रिया E14 माउस भ्रूण, मस्तिष्क microdissection कटाई फसल ganglionic एनएससी माध्यम से काटा ऊतक के eminences पृथक्करण के लिए एक एकल कक्ष निलंबन लाभ, और अंत में एनएसए संस्कृति में कोशिकाओं चढ़ाना भी शामिल है. संस्कृति में 5-7 दिनों के बाद, जिसके परिणामस्वरूप प्राथमिक neurospheres आगे भविष्य प्रयोगों के लिए एनएससी की संख्या का विस्तार करने के लिए passaged हैं.
Protocol
1. बेसिक विच्छेदन के लिए आगे बढ़ने से पहले सेट अप:
- पूरा एनएससी मध्यम की उपयुक्त मात्रा 09:01 के अनुपात में NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम और NeuroCult एनएससी प्रसार पूरक मिश्रण, क्रमशः द्वारा तैयार की है.
- मध्यम एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म है.
- शीत HEPES बफर एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च एकाग्रता (10%) के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम (हेम) विच्छेदन और धोने के उद्देश्य के लिए तैयार है. वैकल्पिक रूप से, एनएससी एंटीबायोटिक दवाओं अनुपूरण के साथ बेसल मध्यम भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- ठंड हेम युक्त एंटीबायोटिक दवाओं की 25-30 एमएल बाँझ भ्रूण के संग्रह के लिए 50 एमएल ट्यूबों में तिरस्कृत है.
- कई 10cm प्लास्टिक पेट्री डिश को विच्छेदन के दौरान भ्रूण और दिमाग पकड़ की जरूरत है और यह भी dissected ऊतक पकड़.
- शल्य चिकित्सा उपकरण, (बड़ी कैंची, छोटे बताया कैंची, बड़े संदंश, छोटे घुमावदार संदंश) भ्रूण या भ्रूण मस्तिष्क विच्छेदन के लिए (छोटे संदंश, घुमावदार ठीक संदंश, 45 ° angled ठीक संदंश, और छोटे कैंची) को हटाने की जरूरत का उपयोग निष्फल कर रहे हैं 250 ग्लास मनका अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ डिग्री सेल्सियस या अन्य उपलब्ध आटोक्लेव तरीकों.
- विच्छेदन खुर्दबीन 70% शराब के साथ नष्ट है और एक लामिना का प्रवाह या PC2 हुड के अंदर स्थापित है.
2. फसल काटने वाले E14 माउस ब्रेन और माइक्रो विच्छेदन:
- एक समय गर्भवती माउस mated एक संस्थागत पशु अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार गर्भ के 14 वें दिन पर anesthetized है.
- सरवाइकल अव्यवस्था के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर दर्द और संकट ग्रस्त नहीं है बनाने के लिए किया जाता है.
- anesthetized माउस एक शोषक टिशू पेपर पर अपनी पीठ पर रखी है, और पेट 70% इथेनॉल के साथ rinsed है क्षेत्र बाँझ.
- पेट पर त्वचा के एक बड़े संदंश का उपयोग समझा है, और फिर त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी बड़ी कैंची से काट रहा है उदर गुहा और गर्भाशय सींग का पर्दाफाश.
- ग्रीवा छोटे संदंश और कैंची के साथ हटा रहे हैं और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब युक्त ठंड हेम में स्थानांतरित कर रहे हैं.
- गर्भाशय के ऊतकों हुड के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और फिर ताजा बाँझ ठंड हेम के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ एक या दो बार rinsed खून और बालों की तरह संभव contaminants को दूर.
- गर्भाशय के ऊतकों तो एक 10cm पेट्री ठंड हेम युक्त पकवान को स्थानांतरित कर रहे हैं.
- गर्भाशय सींग छोटे घुमावदार संदंश और कैंची का उपयोग कर खोल रहे हैं और भ्रूण को एक नया 10cm पकवान, जिसमें ठंड हेम के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
- भ्रूण के सिर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी के स्तर पर अलग हो रहे हैं और दूसरे पेट्री ठंड हेम युक्त पकवान को हस्तांतरित.
- पेट्री डिश एक विदारक खुर्दबीन के नीचे स्थानांतरित किया है खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने.
- सिर दुम की ओर से एक ठीक घुमावदार संदंश इतनी के रूप में सिर के पृष्ठीय ओर ऊपर की तरफ का सामना कर रहे हैं के साथ आयोजित की जाती हैं. का प्रयोग कैंची सूक्ष्म, पहले एक क्षैतिज कटौती आँखों के ऊपर बना है और फिर सिर के पीछे की ओर माथे से midline में जारी है. त्वचा और खोपड़ी के माध्यम से कटौती और अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
- मस्तिष्क खोपड़ी से एक पिछड़े घुमावदार संदंश का उपयोग गति में कटौती अनुभाग के किनारों धकेलने के द्वारा हटा दिया जाता है. यह प्रक्रिया जारी है जब तक सभी के दिमाग खोपड़ी से हटा रहे हैं.
- मस्तिष्क स्थिर घुमावदार संदंश ताकि पृष्ठीय पक्ष ऊपर और फिर सामना करना पड़ रहा है microscissors कटौती प्रत्येक गोलार्द्ध घ्राण बल्ब से ganglionic eminences बेनकाब गोलार्द्ध के वापस करने के लिए विस्तार के प्रांतस्था के माध्यम से किया जाता है का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए आयोजित किया जाता है.
- एक हाथ में घुमावदार संदंश और दूसरे में 45 ° angled संदंश का प्रयोग, cortices की कटौती फ्लैप फैल रहे हैं और ganglionic eminences dissected हैं.
- dissected ऊतक एक बाँझ 10cm पेट्री डिश में रखा गया है, और इस प्रक्रिया को दोहराया है जब तक सभी के दिमाग सूक्ष्म dissected किया गया है.
- ऊतक टुकड़े एनएससी माध्यम के 1 एमएल का उपयोग एक 1 एमएल विंदुक टिप में एकत्र कर रहे हैं और एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरित.
- ऊतक तो dissociated अच्छी तरह से है, लेकिन धीरे विंदुक टिप ट्यूब के नीचे दबाकर और निलंबन pipetting और नीचे से. इस तरह clumps एकल कोशिकाओं में टूट रहे हैं. Pipetting 3-4 बार इतना है कि एक दूधिया तरह निलंबन हासिल की है प्रदर्शन किया है. फिर, निलंबन के लिए 1-2 मिनट के लिए ऐसा व्यवस्थित रूप में गैर - अलग clumps precipitates की अनुमति दी है.
- लगभग पूरे सेल निलंबन अन्य ट्यूब को सौंप दिया है और फिर एनएससी माध्यम की एक 1 एमएल शेष clumps और एकल कक्ष के लिए अलग रूप में वर्णित करने के लिए जोड़ा जाता है.
- ट्यूबों की सामग्री और जमा कर रहे हैं कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifuged 700rpm (110g),.
- सतह पर तैरनेवाला बंद vacuumed नीचे वास्तविक गोली, और कोशिकाओं पूरा एनएससी माध्यम के 1 एमएल में resuspended कर रहे हैं.
- मध्यम धीरे pipetted है और नीचेएक सजातीय एकल कक्ष निलंबन है.
- सेल निलंबन के 10 μL trypan नीले रंग के 90 μL एक कोशिका गिनती करने के साथ मिलाया जाता है.
- अंत में, कोशिकाओं को पूरा एनएससी / 20ng एमएल epidermal वृद्धि कारक (EGF) के साथ पूरक माध्यम 2x10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर चढ़ाया जाता है. 5 एमएल मध्यम T25, T75 और T175 बोतल के लिए 40 एमएल के लिए 20 एमएल के लिए प्रयोग किया जाता है.
- Neurospheres 5-7 दिनों में बनते हैं, जब यह 37 ° सी humidified इनक्यूबेटर में 5% के साथ सीओ 2 में incubated . 6-7 दिनों में 150-200 माइक्रोन के बीच, क्षेत्रों उपाय और उपसंस्कृति बीतने () के लिए तैयार हो जाएगा चाहिए.
3. Passaging और भ्रूणीय एनएससी का विस्तार:
- जब neurospheres उपसंस्कृति (व्यास में 150-200 सुक्ष्ममापी) के लिए तैयार हैं, निलंबित क्षेत्रों के साथ मध्यम बोतल से निकाल दिया जाता है, एक उपयुक्त आकार बाँझ टिशू कल्चर ट्यूब में रखा, और 5 मिनट के लिए 700 rpm (110 ग्राम) पर centrifuged कमरे के तापमान.
- सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है और क्षेत्रों trypsin - EDTA 0.05% की 1 एमएल में resuspended हैं.
- सेल निलंबन फिर 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में incubated है, तो सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा trypsin गतिविधि को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- सेल निलंबन धीरे से ऊपर pipetted है और नीचे करने के लिए सुनिश्चित करें कि trypsin पूरी तरह से निष्क्रिय है.
- सेल निलंबन 5 मिनट के लिए 700 rpm (110g) पर centrifuged है. फिर, सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और कोशिकाओं पूरा एनएससी माध्यम के 1 एमएल में resuspended कर रहे हैं.
- सेल निलंबन के 10 μL trypan नीले रंग के 90 μL एक कोशिका गिनती करने के साथ मिलाया जाता है.
- कोशिकाओं को पूरा एनएससी के साथ पूरक एक उपयुक्त आकार टिशू कल्चर फ्लास्क में 20ng / एमएल EGF माध्यम 5x10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में चढ़ाया जाता है . 5 एमएल मध्यम T25, T75 और T175 बोतल के लिए 40 एमएल के लिए 20 एमएल के लिए प्रयोग किया जाता है.
- माध्यमिक neurospheres 5-7 दिनों में गठन कर रहे हैं जब 37 ° सी humidified इनक्यूबेटर में 5% के साथ सीओ 2 में incubated .
4. प्रतिनिधि परिणाम:
प्राथमिक भ्रूण एनएससी संस्कृति में कोशिकाओं के बहुमत hypertrophic बन और चढ़ाना पर टिशू कल्चर बर्तन को देते हैं. जबकि कक्षों के बहुमत या तो मर जाते हैं या 2-3 दिनों के बाद, अंतर, proliferative कोशिकाओं कोशिकाओं है कि सब्सट्रेट (चित्रा 1) से अलग होगा के छोटे समूहों बनाते हैं. संस्कृति के पहले 48 घंटे में बड़ी गोलाकार समुच्चय के गठन प्राथमिक क्षेत्रों के लिए गलत नहीं चाहिए. सकल गठन मुख्य रूप से मलबे और गैर - अलग संस्कृति में clumps ऊतक की मात्रा पर निर्भर करता है. यह सच है neurospheres उज्ज्वल चरण कर रहे हैं और अधिक का आकार बढ़ता है (चित्रा 2) के रूप में गोलाकार हो जाते हैं. छोटे microspikes व्यवहार्य और स्वस्थ क्षेत्रों (चित्रा 3) के बाहरी सतह पर दिखाई देता है. 5-7 दिनों के बाद, क्षेत्रों दौर हो लेकिन जमा नहीं करना चाहिए, और व्यास में 150 और 200 के बीच सुक्ष्ममापी उपाय करना चाहिए. यदि neurospheres भी बड़े हो जाना (संस्कृति में 9-10 दिनों के बाद) की अनुमति दी हैं, वे समुच्चय फार्म या कोशिका मृत्यु की वजह से रंग में अंधेरा क्षेत्रों के केंद्र में (वीडियो देखें) बन सकता है. बड़े neurospheres अंततः के बगल में अंतर (सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न है और परिधि की ओर पलायन) शुरू हो सकता है. यह भी बड़ी neurospheres अलग कर देना मुश्किल है और उन्हें subculture.
चित्रा 1 3 दिनों चढ़ाना के बाद प्राथमिक E14 एनएससी संस्कृति . तीर एनएससी के proliferating समूहों दिखा. मूल आवर्धन, 20x
चित्रा 2 7 दिनों के चढ़ाना के बाद प्राथमिक E14 एनएससी संस्कृति. मूल 10x बढ़ाई;
चित्रा 3 चढ़ाना के बाद एक E14 neurospheres 5 दिनों पारित. नोट क्षेत्रों की परिधि में माइक्रो के spikes (तीर). मूल आवर्धन, 20x
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Discussion
neurosphere परख अलगाव और अपनी सादगी और reproducibility की वजह से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 1-5 के विस्तार के लिए पसंद की विधि है. इस परख undifferentiated सीएनएस अग्रदूत साबित कोशिकाओं है, जो इन विट्रो में और vivo अध्ययन में दोनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की बड़े पैमाने पर की पीढ़ी के लिए एक अमूल्य उपकरण है. यह कि neurospheres दोनों सदाशयी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और अधिक प्रतिबंधित progenitors से उत्पन्न हो सकता है पर जोर दिया जाना चाहिए. इसलिए, neurosphere बनाने आवृत्ति की गणना बस किसी भी तंत्रिका कोशिका 6 जनसंख्या में सदाशयी एनएससी की संख्या overestimates. सदाशयी एनएससी की आवृत्ति का अनुमान करने के लिए, यह दृढ़ता से तंत्रिका बनाने कॉलोनी सेल परख (एन CFCA), जो इस प्रयोजन के लिए 7 विकसित किया गया है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
एक सुसंगत E14 एनएससी की उच्च गुणवत्ता neurosphere संस्कृति है, हम अनुशंसा करते हैं:
- भ्रूण फसल शुरू करने से पहले आवश्यक वस्तुओं को तैयार है.
- ठंड या विच्छेदन भर बेसल एनएससी मध्यम हेम में भ्रूण रखने के लिए.
- विच्छेदन के रूप में जल्दी संभव प्रदर्शन (एक घंटे के भीतर), के रूप में ऊतक समय पर नरम और चिपचिपा हो जाता है और काटना मुश्किल हो सकता है.
- नहीं क्षेत्र बहुत ज्यादा हो जाना. आमतौर पर वे उप - सुसंस्कृत हर 5-7 दिनों क्षेत्रों के आकार के आधार पर किया जाना चाहिए.
- 2-3 मिनट के लिए 150-200 सुक्ष्ममापी के आकार में क्षेत्रों trypsinize के लिए. अधिक से अधिक 3 मिनट के लिए trypsin छोड़कर कोशिकाओं को नुकसान का कारण बनता है और क्षेत्र बनाने दक्षता में कमी होगी और कोशिकाओं संस्कृति व्यंजन देते हैं और अंतर के लिए करते हैं जाएगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
