הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

Summary

זה פרוטוקול וידאו מדגים את היישום של assay neurosphere לבידוד והרחבת בתאי גזע עצביים מן יואילו הוד מעלתם ganglionic היום עובריים 14-עכבר המוח.

Abstract

ב mammalians, בתאי גזע מהווה גם מקור של תאים שלא עברו התמיינות לשמור בראשית התא התחדשות רקמות ואיברים שונים במהלך תוחלת החיים של החיה. הם יכולים באופן פוטנציאלי להחליף תאים אובדים בתהליך ההזדקנות או בתהליך של פציעה ומחלה. קיומו של בתאי גזע עצביים (NSCs) תוארה לראשונה במערכת יונקים בוגרים העצבים המרכזית (CNS) באמצעות נסיוב ללא הרומן בתרבות המערכת, assay neurosphere (NSA) של ריינולדס וייס (1992). שימוש assay, זה גם אפשרי לבודד להרחיב NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים העוברית. אלה ב NSCs במבחנה מורחבת multipotent הם יכולים להצמיח את שלושת סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית. בעוד NSA נראית פשוטה יחסית לביצוע, לב הנהלים הפגינו כאן נדרשת על מנת להשיג תוצאות אמינה ועקבית. סרט הווידאו הזה מדגים למעשה NSA ליצור ולהרחיב NSCs מיום עובריים 14-עכבר רקמת המוח ומספק פרטים טכניים כך אפשר להשיג תרבויות neurosphere לשחזור. ההליך כולל קצירת E14 עוברי עכברים, microdissection המוח לקצור את יואילו הוד מעלתם ganglionic, ניתוק של הרקמה שנקטפו במדיום NSC להשיג ההשעיה תא בודד, ולבסוף ציפוי התאים בתרבית NSA. לאחר 5-7 ימים בתרבות, neurospheres הראשוני וכתוצאה מכך הם passaged להרחיב עוד יותר את מספר NSCs ניסויים עתידיים.

Protocol

1. יסוד הגדרת לפני שתמשיך Dissection:

1. נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה.
2. המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. בינוני הקרה HEPES שנאגרו חיוני מינימום (שולי) עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה (10%) מוכן לנתיחה ומטרה כביסה. לחלופין, המדיום NSC הבסיס עם תוספת אנטיביוטיקה עשוי לשמש גם למטרה זו.
4. 25-30 מ"ל של שולי קר המכילות אנטיביוטיקה הוא חילק לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי עבור אוסף של העוברים.
5. כמה פלסטיק 10 ס"מ צלחות פטרי יש צורך להחזיק את העוברים ואת המוח במהלך דיסקציה וגם להחזיק רקמות גזור.
6. כלים כירורגיים, צריך להסיר את העוברים (מספריים גדולים, מספריים קטנים ומחודדים, מלקחיים גדולים, מלקחיים מעוקל קטן) או לניתוח מוח עובריים (מלקחיים קטנים, מלקחיים בסדר מעוקל, 45 ° מלקחיים בסדר זוויתי, ומספריים קטנים) הם מעוקרים באמצעות חרוז זכוכית מעקר ב 250 ° C או אחר שיטות החיטוי זמין.
7. מיקרוסקופ Dissection הוא ניגב עם אלכוהול 70% ולהקים בתוך זרימה למינרית או ברדס PC2.

2. מסיק E14 מוח עכבר Micro-לנתיחה:

1. זמן הזדווגו העכבר בהריון הוא הרדים ביום ^ה -14 של ההיריון על פי פרוטוקול חיה מוסדיים אחד מאושר.
2. פריקה צוואר הרחם מתבצעת על מנת לוודא החיה אינה סובלת כאב ומצוקה.
3. עכבר הרדים מונח על גבו על גבי נייר סופג רקמה, ואת הבטן היא שטפה עם אתנול 70% לחטא את האזור.
4. העור על הבטן נתפסת באמצעות מלקחיים גדולים, ולאחר מכן את העור ואת fascia הבסיסית היא לגזור במספריים גדולים כדי לחשוף את חלל הבטן ואת הרחם קרניים.
5. Uteri יוסרו עם מלקחיים ומספריים קטנים מועברים לתוך שפופרת המכילה 50 מ"ל חרוטי שולי קר.
6. רקמות הרחם מועברים למכסה המנוע ושטף אז פעם או פעמיים עם נפח מספיק של שולי טרי קר סטרילי להסרת מזהמים אפשריים כמו דם ושיער.
7. רקמות הרחם מועברים לצלחת פטרי המכילה 10 ס"מ שולי קר.
8. קרניים הרחם נפתחים באמצעות מלקחיים מעוקל קטן מספריים העוברים מועברים צלחת 10 ס"מ חדש, אשר מכיל שולי קר.
9. ראשי העוברים מופרדים ברמת חוט השדרה הצווארי והועברו צלחת פטרי אחר המכיל שולי קר.
10. צלחת פטרי מועבר תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להסיר את המוח מהגולגולת.
11. ראשי מתקיימים עם מלקחיים מעוקל בסדר מהצד הזנב כדי בצד הגב של ראשים תפנינה כלפי מעלה. באמצעות מיקרו מספריים, תחילה חתך אופקי הוא עשה מעל העיניים ואז המשיכו קו האמצע מן המצח כלפי החלק האחורי של הראש. הקפד לחתוך דרך העור את הגולגולת ולא הנזק המוחי הבסיסי.
12. המוח מוסר מהגולגולת על ידי דוחפים את הקצוות של המקטע לחתוך בתנועה לאחור באמצעות מלקחיים מעוקל. הליך זה נמשך עד שכל המוחות יוסרו מן הגולגולות.
13. המוח הוא יציב באמצעות מלקחיים מעוקל כך בצד הגבי פונה מעלה ולאחר מכן באמצעות microscissors חתך מבוצע דרך הקורטקס של האונה כל המשתרעת הנורות הריח לחלק האחורי של האונה לחשוף את יואילו הוד מעלתם ganglionic.
14. באמצעות מלקחיים מעוקל ביד אחת ואת 45 ° זווית מלקחיים השנייה, דשי חתך של הקורטקס מפוזרים ואת יואילו הוד מעלתם ganglionic הם גזור החוצה.
15. הרקמה גזור ממוקם צלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ, ועל הליך זה חוזר על עצמו עד שכל המוחות כבר מיקרו גזור.
16. פיסות רקמות נאספים באמצעות 1 מ"ל של מדיום NSC ב 1 מ"ל פיפטה קצה והועברו צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
17. רקמות הוא ניתק אז ביסודיות, אך בעדינות על ידי לחיצה על קצה פיפטה אל החלק התחתון של הצינור pipetting ההשעיה למעלה ולמטה. בדרך זו הם גושים שבור לתוך תאים בודדים. Pipetting מבוצע 3-4 פעמים כך ההשעיה כמו חלבי מושגת. לאחר מכן, ההשעיה מותר להתפשר על 1-2 דקות כדי לא ניתק גושים משקעים.
18. כמעט ההשעיה התא כולו מועבר צינור אחר ואז עוד 1 מ"ל של מדיום NSC מתווסף גושי הנותרים ניתק לתא בודד כמתואר.
19. התוכן של הצינורות הם אספו ו centrifuged במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, על 700rpm (110g).
20. Supernatant הוא שאב את עד גלולה בפועל, התאים הם resuspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל להשלים.
21. המדיום הוא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדייש השעיה הומוגנית תא בודד.
22. 10 μL ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90 μL של trypan כחול לבצע ספירת תאים.
23. לבסוף, התאים מצופה בצפיפות של 2x10 ⁵ תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים בתוספת גורם 20ng / mL הצמיחה אפידרמיס (EGF). 5 מ"ל בינוני משמש 20 מ"ל T25, T75 עבור מ"ל ו - 40 עבור T175 צלוחיות.
24. Neurospheres נוצרות 5-7 ימים כאשר מודגרות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO _2. ב 6-7 ימים, הכדורים צריך למדוד בין 150-200 מיקרון יהיה מוכן תת (מעבר).

3. Passaging והרחבת NSCs עובריים:

1. כאשר neurospheres מוכנים תת (150-200 מיקרומטר קוטר), בינוני עם תחומי מושעה יוסר צלוחיות, להציב צינור סטרילי המתאים לגודל רקמת תרבות, centrifuged על 700 סל"ד (110 גרם) במשך 5 דקות ב טמפרטורת החדר.
2. Supernatant נמחקת ואת התחומים הם resuspended ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA.
3. השעיית התא מודגרות אז אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים 2-3 דקות, ולאחר מכן נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה משמש כדי לעצור את פעילות טריפסין.
4. המתלים התא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח את טריפסין כבר מומת לחלוטין.
5. המתלים התא centrifuged ב 700 סל"ד (110g) עבור 5 דקות. ואז, supernatant היא להסיר את התאים הם resuspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל להשלים.
6. 10 μL ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90 μL של trypan כחול לבצע ספירת תאים.
7. התאים מצופה בריכוז של ⁴ תאים 5x10 / מ"ל במדיום המל"ל להשלים בתוספת 20ng / mL EGF בתוך בקבוק בגודל המתאים רקמה תרבות. 5 מ"ל בינוני משמש 20 מ"ל T25, T75 עבור מ"ל ו - 40 עבור T175 צלוחיות.
8. Neurospheres משניות נוצרות 5-7 ימים כאשר מודגרות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO _2.

4. נציג תוצאות:

בתרבות העיקרי NSC עובריים, רוב התאים יהפכו hypertrophic ולצרף את התרבות מנות רקמה על ציפוי. בעוד שרוב התאים יהיה גם למות או להבדיל, לאחר 2-3 ימים, שגשוג תאים לעשות אשכולות קטנים של תאים תנתק מן המצע (איור 1). כינונה של אגרגטים spheroidal גדול השעה-48 הראשונים של התרבות לא צריך להיות בטעות התחומים העיקריים. היווצרות מצטבר בעיקר תלוי בסכומים של פסולת ולא ניתק גושי רקמה בתרבות. Neurospheres נכון הם שלב בהיר יותר להיות כדורית כמו מגדילה גודל (איור 2). Microspikes קטן נראה על פני השטח החיצוניים של הספירות קיימא ובריא (איור 3). לאחר 5-7 ימים, הכדורים חייבים להיות עגול, אבל לא דחוס, ויש למדוד בין 150 ל -200 מיקרומטר קוטר. אם neurospheres מותר לגדל גדול מדי (אחרי 9-10 ימים בתרבות), הם עלולים ליצור אגרגטים או להפוך כהה בגלל מוות של תאים במרכז הספירות (ראה וידאו). Neurospheres גדול עשוי בסופו של דבר מתחילים להבחין באתרו (מצרף המצע נודדות לעבר הפריפריה). קשה גם לנתק neurospheres גדול תת אותם.

באיור 1. ראשיים E14 תרבות NSC 3 ימים לאחר ציפוי. חצים מראים אשכולות מתרבים של NSCs. הגדלה מקורי; 20x

איור 2. ראשיים E14 תרבות NSC 7 ימים לאחר ציפוי. הגדלה מקורי; 10x

איור 3. בקטע אחד E14 neurospheres 5 ימים לאחר ציפוי. הערה מיקרו קוצים (חיצים) בשולי הספירות. הגדלה מקורי: 20x

Discussion

Assay neurosphere היא שיטת הבחירה של בידוד והרחבת בתאי גזע עצביים ^1-5 בגלל הפשטות שלה reproducibility. Assay זהו כלי רב ערך עבור הדור בקנה מידה גדול של תאים במערכת העצבים המרכזית מובחן מבשר, אשר יכול לשמש הן במבחנה במחקרים vivo. יודגש כי neurospheres יכול להיווצר משני לתאי גזע עצביים בתום לב ואת אבות יותר מוגבלת. לפיכך, חישוב תדר להרכיב neurosphere פשוט מגזים בהערכת מספר NSCs בתום לב באוכלוסיה נתונה כל תא עצביות ^6. כדי להעריך את תדירות NSCs בתום לב, מומלץ מאוד להשתמש המושבה עצבית יצירת Cell Assay (N-CFCA), אשר פותחה לצורך זה ^7.

כדי להיות neurosphere עקבי באיכות גבוהה של תרבות E14 NSCs, אנו ממליצים:

1. כדי להכין את הפריטים הדרושים לפני תחילת הבציר עוברים.
2. כדי לשמור על עוברי במכפלת קר או הבסיס בינוני NSC ברחבי לנתיחה.
3. כדי לבצע דיסקציה מהר ככל האפשר (תוך 1 ח), כמו רקמות הופך רך ודביק לאורך זמן עלול להיות קשה לנתח.
4. לא לתת התחום לגדול יותר מדי. בדרך כלל הם צריכים להיות תת תרבות כל 5-7 ימים, בהתאם לגודל של תחומים.
5. כדי trypsinize בתחומים בגודל של 150-200 מיקרומטר לרגע 2-3. השארת טריפסין במשך יותר מ 3 דקות גורם נזק לתאים התחום יעילות להרכיב יקטין והתאים נוטים לצרף את הכלים תרבות להבדיל.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.