Summary
Denna video protokoll visar tillämpningen av neurosphere test för isolering och utbyggnad av neurala stamceller från ganglieblockerande eminens embryonala dag 14-musen hjärnan.
Abstract
I mammalians fungerar stamceller som en källa till odifferentierade celler för att upprätthålla cellens uppkomst och förnyelse i olika vävnader och organ under den livslängd djuret. De kan potentiellt ersätta celler som går förlorade i åldrandeprocessen eller i färd med att skada och sjukdom. Förekomsten av neurala stamceller (NSCs) beskrevs först av Reynolds och Weiss (1992) i den vuxna däggdjur centrala nervsystemet (CNS) enligt en ny serumfritt kultur system, neurosphere analys (NSA). Med hjälp av denna analys är det också möjligt att isolera och expandera NSCs från olika regioner av embryonala CNS. Dessa in vitro expanderade NSCs är multipotenta och kan ge upphov till de tre stora celltyper i CNS. Medan NSA verkar relativt enkla att utföra, uppmärksamma de förfaranden som visats här krävs för att erhålla tillförlitliga och konsekventa resultat. Denna video demonstrerar praktiskt NSA för att skapa och expandera NSCs från embryonala dag 14-musen hjärnvävnad och ger tekniska detaljer så kan man uppnå reproducerbara neurosphere kulturer. Förfarandet omfattar skörd E14 musembryon, hjärnan microdissection att skörda ganglieblockerande höjder, dissociation av den skördade vävnad i NSC mediet för att få en enda cell fjädring och slutligen plätering celler i NSA kultur. Efter 5-7 dagar i kultur, är den resulterande primära neurospheres passerats att ytterligare utöka antalet NSCs för framtida experiment.
Protocol
1. Grundläggande installation innan du fortsätter till Dissection:
- Lämplig volym av hela NSC mediet bereds genom att blanda NeuroCult NSC bassubstratets och NeuroCult NSC spridning Kosttillskott vid ett 9:1-förhållande, respektive.
- Mediet värms upp i ett 37 ° C vattenbad.
- Kall HEPES-buffrad minst viktigt medium (HEM) med hög koncentration av antibiotika (10%) är redo för dissektion och tvätt syfte. Alternativt kan NSC bassubstratets med antibiotika tillskott även användas för detta ändamål.
- 25-30 ml kall HEM som innehåller antibiotika är förpackat i sterila 50 ml rör för insamling av embryon.
- Flera 10cm petriskålar av plast behövs för att hålla embryon och hjärnan under dissekering och även att hålla dissekeras vävnad.
- Den kirurgiska verktyg som behövs för att ta bort embryon (stora saxar, små spetsiga saxar, stor pincett, liten böjd pincett) eller för embryonal hjärn-dissektion (liten tång, böjda fin pincett, 45 ° vinklat fin pincett och en liten sax) är steriliserade med glaspärla autoklav vid 250 ° C eller andra tillgängliga metoder autoklav.
- Dissektion mikroskop torkas med 70% alkohol och ställa in inne i ett laminärt flöde eller PC2 huva.
2. Skörd E14 Mus Hjärna och Micro-dissektion:
- En tid parat gravid musen är sövda på dag 14: e graviditetsveckan enligt ett institutionella godkända djur protokollet.
- Halsdislokation utförs för att se till att djuret inte lider av smärta och ångest.
- Den sövda mus läggs på rygg på en absorberande mjukpapper, och buken sköljs med 70% etanol för att sterilisera området.
- Huden över buken är fattade med hjälp av en stor pincett, och sedan huden och den underliggande fascia skärs med stora sax för att exponera bukhålan och livmoderns horn.
- Den livmoder tas bort med små pincett och sax och överförs till en 50-ml konisk tub innehåller kalla HEM.
- Den livmoder vävnad överförs till huven och sedan sköljas en eller två gånger med tillräcklig mängd färsk steril kalla HEM för att avlägsna eventuella föroreningar som blod och hår.
- Den livmoder vävnad överförs sedan till en 10cm petriskål innehåller kalla HEM.
- Den livmoder hornen öppnas med hjälp av små böjda pincett och sax och embryona överförs till en ny 10cm maträtt, som innehåller kalla HEM.
- Cheferna för de embryon som separeras vid cervikal ryggmärgen och överförs till en annan petriskål innehåller kalla HEM.
- Petriskålen överförs under ett dissekera mikroskop för att ta bort hjärnan från skallen.
- Huvudena hålls med en fin böjd tång från den bakre sidan så ryggsidan av cheferna pekar uppåt. Med en mikro-sax, är först ett horisontellt snitt gjordes över ögonen och fortsatte sedan i mittlinjen från pannan mot bakhuvudet. Se till att skära genom huden och skallen och inte skada den underliggande hjärnan.
- Hjärnan är avlägsnats från skallen genom att trycka kanterna på den kapade sektionen i ett efterblivet rörelse med böjda pincetten. Denna procedur fortsätter tills alla hjärnor är bort från skallar.
- Hjärnan hålls stabil med hjälp av böjda pincetten så att ryggen är vänd uppåt och sedan använda microscissors ett snitt görs genom cortex varje halvklotet sträcker sig från lukt glödlampor på baksidan av halvklotet att exponera ganglieblockerande höjder.
- Med hjälp av böjda pincett i ena handen och 45 ° vinklat pincetten i den andra, är de skär flikar cortex spridas och ganglieblockerande höjder är dissekeras ut.
- Den dissekerade vävnad placeras i en steril 10 cm petriskål, och denna procedur upprepas tills alla hjärnor har mikro-dissekeras.
- Tissue bitar samlas in med hjälp av 1 mL av NSC medium i en 1 ml pipettspets och överförs till ett 15 ml centrifugrör.
- Tissue är då dissocierade noga, men försiktigt genom att trycka på pipettspetsen till botten av röret och pipettera suspensionen upp och ner. På detta sätt klumpar bryts upp i enstaka celler. Pipettering utförs 3-4 gånger så att en mjölkig som suspension erhålls. Då är suspensionen tillåtas sjunka i 1-2 minuter så att den icke-differentierade klumpar utfällningar.
- Nästan hela cellsuspension överförs till det andra röret och sedan ytterligare 1 ml NSC mediet läggs till den återstående klumpar och dissocierade till en enda cell som beskrivs.
- Innehållet i rören samman och centrifugeras i 5 minuter i rumstemperatur, i 700rpm (110g).
- Supernatanten sugs bort ner till själva pellets, och cellerna är suspenderade i 1 ml av kompletta NSC medium.
- Mediet är försiktigt pipetteras upp och ner tillhar en homogen enda cell suspension.
- 10 mikroliter av cellsuspensionen blandas med 90 mikroliter av trypan blått för att utföra ett celltal.
- Slutligen är de celler klädd i täthet 2x10 5 celler / ml i fullständig NSC mediet kompletteras med 20ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF). 5 ml medium används för T25, 20 ml för T75 och 40 ml för T175 kolvar.
- Neurospheres bildas i 5-7 dagar när de inkuberas vid 37 ° C i en fuktig kuvös med 5% CO 2. I 6-7 dagar bör sfärerna är mellan 150-200 mikrometer och kommer att vara redo att subkultur (passage).
3. Passaging och utbyggnad av embryonala NSCs:
- När neurospheres är redo för subkultur (150-200 mikrometer i diameter), är det medium med hängande sfärer bort från flaskor, placeras i en lämplig storlek sterilt vävnadsodling rör och centrifugeras vid 700 rpm (110 g) i 5 min vid rumstemperatur.
- Supernatanten är kasseras och sfärer är suspenderade i 1 ml% 0,05 trypsin-EDTA.
- Cellsuspensionen sedan inkuberas vid 37 ° C vattenbad i 2-3 minuter, sedan en lika stor volym av sojabönor trypsin inhibitor används för att stoppa trypsin aktivitet.
- Cellsuspensionen är försiktigt pipetteras upp och ner för att säkerställa att trypsin helt har inaktiverats.
- Cellsuspensionen är centrifugeras vid 700 rpm (110g) i 5 minuter. Då är supernatanten bort och cellerna är suspenderade i 1 ml av kompletta NSC medium.
- 10 mikroliter av cellsuspensionen blandas med 90 mikroliter av trypan blått för att utföra ett celltal.
- Cellerna är klädd i en koncentration av 5x10 4 celler / ml i fullständig NSC mediet kompletteras med 20ng / ml fonden i en lämplig storlek vävnadskultur kolv. 5 ml medium används för T25, 20 ml för T75 och 40 ml för T175 kolvar.
- Sekundära neurospheres bildas i 5-7 dagar när de inkuberas vid 37 ° C i en fuktig kuvös med 5% CO 2.
4. Representativa resultat:
I första hand embryonala NSC kultur, kommer majoriteten av cellerna blir hypertrofisk och fäster vid disken vävnadsodling vid plätering. Medan majoriteten av cellerna kommer antingen dö eller skilja, efter 2-3 dagar, proliferativ celler gör små kluster av celler som kommer att lossna från underlaget (Figur 1). Bildandet av stora sfäriska aggregat i den första 48-timmars av kultur bör inte förväxlas med primära sfärer. Aggregate bildas beror främst på mängder av skräp och icke-differentierade klumpar vävnad i kulturen. Sann neurospheres är fas ljusa och bli mer sfärisk som storlek ökar (figur 2). Små microspikes visas på utsidan av livskraftiga och friska områden (Figur 3). Efter 5-7 dagar måste sfärerna vara rund, men inte komprimeras, och bör mäta mellan 150 och 200 mikrometer i diameter. Om neurospheres tillåts växa för stor (efter 9-10 dagar i kultur), kan de bilda aggregat eller bli mörk till färgen på grund av celldöd i centrum av sfärer (se video). Stora neurospheres kanske så småningom att skilja på plats (knutna till substrat och vandrar mot periferin). Det är också svårt att skilja stora neurospheres och subkultur dem.
Figur 1. Primär E14 NSC kultur 3 dagar efter plätering. Pilar visar förökar kluster av NSCs. Original förstoringen, 20x
Figur 2. Primär E14 NSC kultur 7 dagar efter plätering. Original förstoring, 10x
Figur 3. Passage en E14 neurospheres 5 dagar efter plätering. Observera mikro-spikar (pilar) i utkanten av sfärerna. Original Förstoring, 20x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den neurosphere analysen är den metod som föredras för isolering och expansion av neurala stamceller 1-5 grund av dess enkelhet och reproducerbarhet. Denna analysmetod är ett ovärderligt verktyg för storskalig produktion av odifferentierade CNS föregångare celler, som kan användas för både in vitro och in vivo-studier. Det bör understrykas att neurospheres kan genereras från både seriösa neurala stamceller och mer begränsad stamceller. Därför beräkna neurosphere bildar ofta helt enkelt överskattar antalet bona fide NSCs i en viss neural cellpopulation 6. För att uppskatta frekvensen av bona fide NSCs, rekommenderas det starkt att använda Neural kolonibildande Cell-analys (N-fiske), som har utvecklats för detta ändamål 7.
Att ha en jämn och hög kultur kvalitet neurosphere på E14 NSCs rekommenderar vi:
- För att förbereda saker som behövs innan du börjar skörda embryon.
- För att hålla embryon i kallt HEM eller basal NSC och genomgående dissekering.
- För att utföra dissekering så snabbt som möjligt (inom 1 h), eftersom vävnaden blir mjuk och klibbig över tiden och kan vara svår att dissekera.
- Att inte låta området växa för mycket. Vanligtvis bör vara sub-odlade var 5-7 dagar beroende på storleken på sfärerna.
- För att trypsinize sfärerna på storleken på 150-200 ìm i 2-3 minuter. Leaving trypsin i mer än 3 minuter skadar cellerna och klotet bildar effektiviteten minskar och cellerna tenderar att fästa kultur rätter och differentiera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
