Summary
فيديو يوضح هذا البروتوكول تطبيق مقايسة neurosphere للعزلة والتوسع من الخلايا الجذعية العصبية من الفضيلة العقدية من اليوم 14 الفأر الجنينية الدماغ.
Abstract
في mammalians ، والخلايا الجذعية تعمل كمصدر للخلايا غير متمايزة للحفاظ على نشأة وتجديد الخلايا في الأنسجة المختلفة وأجهزة خلال فترة حياة الحيوان. فإنها يمكن أن تحل محل الخلايا التي يحتمل أن تضيع في عملية الشيخوخة أو في عملية الاصابة والمرض. وكان أول وصف وجود الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بواسطة رينولدز وفايس (1992) في النظام العصبي المركزي الثدييات الكبار (CNS) باستخدام نظام رواية ثقافة المصل الحرة ، ومقايسة neurosphere (NSA). باستخدام هذا الاختبار ، بل هو أيضا من المجدي عزل وتوسيع NSCs من مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي الجنينية. في هذه NSCs توسيع المختبر وmultipotent ويمكن أن تؤدي إلى ثلاثة أنواع رئيسية من خلايا الجهاز العصبي المركزي. في حين أن وكالة الأمن القومي يبدو بسيطا نسبيا للتنفيذ ، الانتباه إلى إجراءات أثبتت هنا هو مطلوب من أجل تحقيق نتائج موثوقة ومتسقة. هذا الفيديو يوضح عمليا لتوليد وكالة الامن القومي وتوسيع NSCs من يوم 14 الفأر الجنينية أنسجة المخ ، ويقدم التفاصيل التقنية لذلك يمكن للمرء أن تحقيق الثقافات neurosphere استنساخه. الإجراء يشمل حصاد أجنة الفئران E14 ، microdissection الدماغ لحصاد البوارز العقدية ، تفكك النسيج المقطوع في مجلس الأمن القومي المتوسطة للحصول على تعليق خلية واحدة ، وأخيرا طلاء الخلايا في ثقافة وكالة الامن القومي. بعد 5-7 أيام في الثقافة ، هي في passaged neurospheres الناتجة الأولية لتوسيع عدد NSCs للتجارب المستقبلية.
Protocol
1. تعيين الأساسية حتى قبل الشروع في تشريح :
- مستعدة المتوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي.
- وارتفعت درجة حرارة تصل في المتوسط في حمام ماء C ° 37.
- مستعدة HEPES - مخزنة الباردة المتوسطة الدنيا الأساسية (HEM) مع نسبة عالية من المضادات الحيوية (10 ٪) لغرض التشريح والغسيل. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا NSC المتوسطة القاعدية مع مكملات المضادات الحيوية يمكن استخدامها لهذا الغرض.
- هو الاستغناء 25-30 مل من HEM الباردة تحتوي على مضادات حيوية في أنابيب معقمة 50 مل لجمع الأجنة.
- هناك حاجة لعدة 10cm البلاستيك أطباق بتري لعقد خلال أدمغة الأجنة والتشريح ، وكذلك لاجراء تشريح الأنسجة.
- يتم تعقيم الأدوات الجراحية اللازمة لإزالة الأجنة (مقص كبير ، وأشار مقص صغير ، ملقط كبير ، ملقط صغير منحن) أو لتشريح الدماغ الجنيني (ملقط صغير ، ملقط غرامة منحني ، 45 درجة جيد الزاوية ملقط ومقص صغير) باستخدام الزجاج حبة تعقيم عند 250 درجة مئوية أو غيرها من وسائل تعقيم المتاحة.
- هو محو مجهر تشريح مع الكحول 70 ٪ ووضع داخل التدفق الصفحي أو غطاء PC2.
2. حصاد E14 مخ الفأر وتشريح - مايكرو :
- زمن تزاوج الماوس الحوامل تخدير يوم ال 14 من الحمل وفقا لبروتوكول واحد مؤسسي الحيوانية المعتمدة.
- يتم تنفيذ خلع عنق الرحم للتأكد من أن الحيوانات لا تعاني من الألم والضيق.
- وضعت الماوس تخدير على ظهرها ورقة ماصة الأنسجة ، ويتم شطف البطن مع الإيثانول 70 ٪ لتعقيم المنطقة.
- واستوعب الجلد فوق البطن باستخدام ملقط كبير ، ومن ثم يتم قطع الجلد واللفافة الكامنة مع مقص كبير لفضح تجويف البطن والرحم قرون.
- تتم إزالة الرحم مع ملقط ومقص صغير ويتم نقلها إلى أنبوب يحتوي على 50 مل المخروطية HEM الباردة.
- يتم نقل أنسجة الرحم إلى غطاء الرأس وتشطف ثم مرة أو مرتين مع حجم ما يكفي من HEM العذبة الباردة العقيمة لإزالة الملوثات المحتملة مثل الدم والشعر.
- ثم يتم نقل أنسجة الرحم إلى 10cm طبق بتري تحتوي HEM الباردة.
- فتحت أبواق الرحم باستخدام ملقط ومقص صغير منحن ويتم نقل الأجنة إلى صحن 10cm الجديد ، الذي يحتوي على HEM الباردة.
- وتفصل رؤساء الأجنة على مستوى النخاع الشوكي عنق الرحم ونقل إلى أخرى تحتوي على طبق بيتري HEM الباردة.
- يتم نقل طبق بيتري تحت المجهر لإزالة تشريح الدماغ من الجمجمة.
- وعقد رؤساء بالملقط منحني غرامة من الجانب الذيلية ، وذلك في الجانب الظهري من رؤساء تواجه صعودا. باستخدام المقص الصغير ، يتم أولا قطع أفقي فوق العينين ، ثم استمرت في خط الوسط من الجبهة نحو الجزء الخلفي من الرأس. تأكد من أن تخترق الجلد والجمجمة ، وليس للضرر في الدماغ الكامنة.
- تتم إزالة الدماغ من الجمجمة عن طريق دفع حواف المقطع قطع في حركة الى الوراء باستخدام الملقط منحنية. واستمر هذا الإجراء حتى يتم إزالة كافة العقول من الجماجم.
- يقام في الدماغ باستخدام الملقط ثابتة منحنية بحيث تواجه الجانب الظهري صعودا ثم استخدام microscissors تتم من خلال قطع كل قشرة الكرة الأرضية التي تمتد من بصيلات الشم في الجزء الخلفي من نصف الكرة الأرضية لفضح العقدية الفضيلة.
- باستخدام الملقط المنحني في يد واحدة وملقط الزاوية 45 درجة في الآخر ، وتنتشر اللوحات خفض القشور وتشريح البوارز العقدية بها.
- يوضع النسيج تشريح في طبق بتري 10cm العقيمة ، ويتكرر هذا الإجراء حتى كل العقول الصغيرة قد تم تشريح.
- يتم جمع قطع الأنسجة باستخدام 1 مل من مجلس الأمن القومي في المتوسط تلميح 1 مل ماصة ونقلها الى اجهزة الطرد المركزي أنبوب 15 مل.
- ثم فصل الأنسجة بدقة ، ولكن بلطف عن طريق الضغط على الطرف ماصة إلى أسفل الأنبوب وpipetting التعليق صعودا وهبوطا بهذه الطريقة يتم تقسيم كتل تصل إلى خلايا واحد. يتم تنفيذ Pipetting 3-4 مرات حتى يتم التوصل إلى وقف مثل حليبي. ثم ، سمح للتعليق على تسوية لمدة 1-2 دقائق حتى كتل غير فصل الرواسب.
- تقريبا يتم نقل التعليق الخلية بأكملها إلى أنبوب أخرى وأخرى ثم يضاف 1 مل من المتوسط NSC إلى كتل المتبقية ونأت إلى خلية واحدة كما هو موضح.
- يتم تجميع المحتوى من أنابيب وطرد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، في 700rpm (110g).
- وطاف هو بالمكنسة الكهربائية وصولا الى قبالة بيليه الفعلية ، ومعلق الخلايا في 1 مل من المتوسط NSC كاملة.
- هو pipetted بلطف المتوسطة صعودا وهبوطا للديك تعليق خلية واحدة متجانسة.
- يتم خلط 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 90 ميكرولتر التريبان الأزرق لإجراء تعداد خلايا.
- أخيرا ، ومطلي الخلايا في كثافة الخلايا 2x10 5 / مل في المتوسط تستكمل مع مجلس الأمن القومي الشامل. 20ng / مل عامل نمو البشرة (EGF). يستخدم 5 مل متوسطة لمدة 20 مل T25 ، T75 للو 40 مل لT175 القوارير.
- تتشكل Neurospheres في 5-7 أيام عندما حضنت في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5 ٪ CO 2. في 6-7 أيام ، وينبغي قياس المجالات بين 150-200 ميكرون ، وسوف تكون مستعدة لثقافة فرعية (مرور).
3. الركض وتوسيع NSCs الجنينية :
- عندما neurospheres مستعدون للثقافة فرعية (150-200 ميكرون في القطر) ، تتم إزالة المتوسطة المجالات مع وقف التنفيذ من قوارير ، وضعت في حجم الأنسجة المعقمة المناسبة أنبوب الثقافة ، وطرد في الدقيقة 700 (110 غ) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- يتم تجاهل طاف ومعلق في المجالين 1 مل من 0.05 ٪ التربسين - EDTA.
- ومن ثم حضنت تعليق خلية في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 2-3 دقيقة ، ثم يتم استخدام حجم مساو من مثبط التربسين فول الصويا لوقف النشاط التربسين.
- هو pipetted بلطف تعليق خلية صعودا وهبوطا لضمان أنه تم التربسين المعطل تماما.
- يتم طرد تعليق خلية عند 700 دورة في الدقيقة (110g) لمدة 5 دقائق. ثم تتم إزالة طاف ومعلق الخلايا في 1 مل من المتوسط NSC كاملة.
- يتم خلط 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 90 ميكرولتر التريبان الأزرق لإجراء تعداد خلايا.
- ومطلي الخلايا في تركيز خلايا 5x10 4 / مل في المتوسط تستكمل مع مجلس الأمن القومي الشامل. 20ng / مل EGF في قارورة الحجم المناسب زراعة الأنسجة. يستخدم 5 مل متوسطة لمدة 20 مل T25 ، T75 للو 40 مل لT175 القوارير.
- تتشكل neurospheres الثانوية في 5-7 أيام عندما حضنت في 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5 ٪ CO 2.
4. ممثل النتائج :
في التعليم الابتدائي الثقافة NSC الجنينية ، فإن الغالبية العظمى من الخلايا تصبح الضخامي ونعلق على أطباق زراعة الأنسجة عند الطلاء. في حين أن الغالبية العظمى من الخلايا سوف يموت أو تمييز ، وبعد 2-3 أيام ، وخلايا التكاثري جعل مجموعات صغيرة من الخلايا التي سيتم فصل من الركيزة (الشكل 1). لا ينبغي تشكيل المجاميع كروي كبير في أول 48 ساعة من الثقافة لا يمكن تمييزه عن المجالات الأساسية. تشكيل يعتمد أساسا على تجميع كميات من الأنقاض وكتل الأنسجة غير فصلها في الثقافة. neurospheres الحقيقية هي مرحلة مشرقة وتصبح أكثر كروية كما يزيد من حجم (الشكل 2). microspikes صغيرة تظهر على السطح الخارجي للمجالات قابلة للحياة وصحية (الشكل 3). بعد 5-7 أيام ، يجب أن تكون الجولة المجالات ولكن لا ضغط ، وينبغي أن تقيس ما بين 150 و 200 ميكرومتر في القطر. إذا سمح neurospheres أن تنمو كبيرة جدا (بعد 9-10 أيام في الثقافة) ، لأنها قد شكل مجاميع أو تصبح داكنة اللون بسبب موت الخلايا في مركز المجالات (انظر الفيديو). قد تبدأ في نهاية المطاف neurospheres كبيرة للتمييز في الموقع (المترتبة على الركيزة والهجرة باتجاه محيط). كما أنه من الصعب فصل neurospheres كبيرة وثقافة فرعية لها.
الشكل 1. الأولية ثقافة NSC E14 3 أيام بعد الطلاء. الأسهم تظهر مجموعات من NSCs المتكاثرة. التكبير الأصلي ؛ 20X
الشكل 2. الابتدائي الثقافة NSC E14 بعد 7 أيام من الطلاء. التكبير الأصلي ؛ 10X
الشكل 3. إحدى الفقرات E14 neurospheres 5 أيام بعد الطلاء. لاحظ المسامير الصغيرة (الأسهم) في محيط المجالات. التكبير الأصلي ؛ 20X
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في مقايسة neurosphere هو الأسلوب المفضل لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية 1-5 بسبب بساطته والتكاثر. هذا الاختبار هو أداة لا تقدر بثمن على نطاق واسع جيل من خلايا غير متمايزة CNS السلائف ، والتي يمكن استخدامها على حد سواء في التجارب المختبرية والدراسات المجراة. وينبغي التأكيد على أنه يمكن إنشاء neurospheres من كل من حسن النية والخلايا الجذعية العصبية الأسلاف اكثر تقييدا. ولذلك ، وحساب وتيرة تشكيل neurosphere يغالي ببساطة عدد NSCs الحقيقيين في أية مجموعة من السكان الخلية العصبية نظرا 6. لتقدير وتيرة NSCs الحقيقيين ، فمن المستحسن استخدام مستعمرة العصبية تشكيل خلية الفحص (N - CFCA) ، الذي تم تطويره لهذا الغرض 7.
لدينا عالية الجودة بما يتفق neurosphere ثقافة NSCs E14 ، فإننا نوصي بما يلي :
- لإعداد المواد اللازمة قبل البدء في حصاد الأجنة.
- للحفاظ على الأجنة في البرد أو HEM القاعدية المتوسطة مجلس الأمن القومي في جميع أنحاء تشريح.
- لإجراء التشريح في أسرع وقت ممكن (في حدود 1 ساعة) ، والأنسجة اللينة ويصبح مع مرور الوقت لزجة ، وربما يكون من الصعب تشريح.
- لا تدع المجال تنمو كثيرا. عادة يجب أن تكون شبه مثقف كل 5-7 أيام اعتمادا على حجم المجالات.
- ليعرض للتريبسين المجالات في حجم 150-200 ميكرون لمدة 2-3 دقيقة. ترك التربسين لأكثر من 3 دقائق يسبب ضررا لخلايا والكفاءة في المجال تشكيل النقصان وسوف الخلايا سوف تميل إلى إرفاق الأطباق الثقافة والتفريق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
